食品衛(wèi)生微生物指標(biāo)及微生物檢測方案ppt課件

1、食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標(biāo),食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn),是檢驗食品衛(wèi)生狀況的依據(jù)，包括,目前實際應(yīng)用的指標(biāo)菌可以分為以下三種： 一、一般衛(wèi)生狀況指標(biāo)菌，包括菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)； 二、糞便污染指標(biāo)菌，包括大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、霍亂弧菌等； 三、致病菌，包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌等,食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的微生物指標(biāo),菌落總數(shù),菌落總數(shù) 指食品檢樣經(jīng)處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g食品或1mL食品中或1cm2食品表面積上所含有的細(xì)菌菌落總數(shù),1.1菌落總數(shù)概念和其所指示的衛(wèi)生意義,一定條件：如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等 不能滿足厭氧或

2、微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌的生長 因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類 單位菌落形成單位叫做CFU（colony forming units,菌落總數(shù)所指示的食品衛(wèi)生意義,它可以作為食品被污染程度的標(biāo)志，一般食品中菌落總數(shù)越多，則表明該食品污染程度越深,它可以用來預(yù)測食品存放的期限或程度,檢測方法與步驟,平板菌落計數(shù)法 基本操作一般包括： 樣品的稀釋傾注平皿培養(yǎng)48小時計數(shù)報告,GB中國國家標(biāo)準(zhǔn) SN 中國檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) FDA BAM(Bacteriological analytical manual) 美國食品藥品管理局細(xì)菌學(xué)分析手

3、冊 ISO(International Organization for Standardization )國際標(biāo)準(zhǔn)化組織 AOAC國際分析化學(xué)家協(xié)會,細(xì)菌總數(shù)的常規(guī)檢驗方法,樣品的稀釋 -傾注平皿 -培養(yǎng)48（24）小時 -計數(shù) -報告,稀釋平板菌落計數(shù)法(Plate Counter,操作步驟,稀釋平板菌落計數(shù)法,稀釋液的選擇,樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1%蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水,培養(yǎng)溫度一般為37（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30） 培養(yǎng)時間一

4、般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù) 培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15 在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別,培養(yǎng)條件,平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA,胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000ml， pH7.00.2, 12115分鐘滅菌,若有二個稀釋度均在30300之間時，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告,計數(shù)原則,到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即

5、計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過24h,中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30300cfu/g的平板（SN檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求為25250cfu/g,如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告,若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之,如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之,如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之,不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋

6、度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù),當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù),當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘

7、以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù),菌落數(shù)的報告,按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定 菌落數(shù)在1100時，按實有數(shù)字報告。 如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。 固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告,方法優(yōu)點,方法簡便，較精確，重復(fù)性好,細(xì)菌總數(shù)的其它檢驗方法,涂布平板法 點滴平板法 螺旋平板法：螺旋平板法是由一臺機器完成的,涂布平板法,是將營養(yǎng)瓊脂制成平板、經(jīng)5012小時或351820小時干燥后，在上面滴加檢樣稀釋液0.2ml，用“L”棒涂布于整個平板的表現(xiàn)，放置約10分鐘，將平板翻轉(zhuǎn)，放至36+1溫箱內(nèi)培養(yǎng)242小時，

8、（水產(chǎn)品用30C培養(yǎng)482小時)取出，進(jìn)行菌落計數(shù)，然后乘以5(由02ml換算為1ml)，再乘以樣品稀釋液的倍數(shù)，即得每克或每升檢樣所含菌落數(shù),涂布法優(yōu)缺點,比常規(guī)檢驗法效果好。因為菌落生長在表面，便于識別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中含有食品顆粒，也不會發(fā)生混淆但是本法取樣量比常規(guī)檢驗法少。 代表性會受到一定影響,點滴平板法,與涂布平板法相似。不同的是點滴平板法只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴(使每滴相當(dāng)于0025m1)將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域(預(yù)先在乎板背面用標(biāo)記筆劃成四個區(qū)域)每個區(qū)域滴1滴，每個稀釋度滴兩個區(qū)域，作為平行試驗。滴加后，將平板放平約10分鐘，然后翻轉(zhuǎn)平板，如涂

9、布平板法+樣移入溫箱中，培養(yǎng)68小時后進(jìn)行計數(shù)，將所得菌落數(shù)乘以40(由0025m1換算為1ml)，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得每克或每毫升檢樣所含菌落數(shù),螺旋平板儀,糞便污染指示菌類,理想的指示菌應(yīng)具備的性能,必須與糞便或病原菌有密切關(guān)系。它們正常寄居場所應(yīng)是人或動物的腸道，在正常情況下不應(yīng)在一般檢樣中存在,在普通培養(yǎng)基上易生長，用簡單的操作方法即能快速和準(zhǔn)確地測定出數(shù)量,它們與腸道致病菌應(yīng)有相同的對外界不良因素的抵抗力,大腸菌群,糞便污染指示菌之一 -大腸菌群(coliforms,一、大腸菌群(coliforms)的定義,二、大腸菌群MPN值（大腸菌群數(shù)）所指示的衛(wèi)生意義,三、大腸菌群計數(shù)方

10、法：國家標(biāo)準(zhǔn)法 （一）大腸菌群MPN計數(shù)法 （二）大腸菌群平板菌落計數(shù)法,大腸菌群,大腸菌群(coliforms)的定義,具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。 指在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢的桿菌。 包括埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬等的一些菌種,分布廣泛：土壤、人和動物腸道,大腸菌群MPN值,指每1g或1ml食品檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（most probable number,大腸菌群MPN值（大腸菌群數(shù)）所指示的衛(wèi)生意義,1.它可作為糞便污染食品的指示菌,2.它可作為腸道致病菌污染食品可能性的指示菌,樣品稀釋 初發(fā)酵試驗 復(fù)發(fā)酵試

11、驗,大腸菌群計數(shù)方法：國家標(biāo)準(zhǔn)法,方法一-大腸菌群MPN計數(shù)法,不產(chǎn)氣,產(chǎn)氣,圖 大 腸 菌 群 M P N 計 數(shù) 法 檢 驗 程 序,樣品稀釋 平板計數(shù)典型和可疑菌落數(shù) 證實試驗,大腸菌群計數(shù)方法：國家標(biāo)準(zhǔn)法,方法二-大腸菌群平板計數(shù)法,圖 大 腸 菌 群 平 板 計 數(shù) 法 檢 驗 程 序,計數(shù)典型和可疑菌落,10 倍系列稀釋,選擇適宜3 個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種VRBA 平板,檢 樣 25 g(mL)樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì),BGLB肉湯,報告結(jié)果,36 1,36 1,18 h 24h,24h 48h,VRBA結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基 成分：蛋白胨7.0g；酵母膏3.0g

12、；乳糖10.0g；氯化鈉5.0g；膽鹽或3號膽鹽1.5g；中性紅0.03g；結(jié)晶紫0.002g；瓊脂15-18g；蒸餾水1000mL；pH7.40.1。 制法：將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45-50傾注平板。使用前臨時制備，不得超過3h,選取菌落數(shù)在15 CFU150 CFU 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。 典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大,大腸菌群在VRBA上的菌落特征,證實試驗 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，3

13、6 1 培養(yǎng)24 h48 h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性,大腸菌群平板計數(shù)的報告 經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL,乳糖發(fā)酵試驗 分離培養(yǎng) 證實試驗,大腸菌群的檢測：舊國家標(biāo)準(zhǔn)-三步法,產(chǎn)氣實驗,伊紅美藍(lán)）瓊脂培養(yǎng)基原理,瓊脂培養(yǎng)基中含有的伊紅和美藍(lán)染料，可抑制革蘭氏陽性細(xì)菌。那

14、些能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，能將染料攝入細(xì)胞，從而使菌落呈現(xiàn)出紫色或邊緣無色、中央暗黑色的菌落,培養(yǎng)基成分,肉湯蛋白胨培養(yǎng)基毫升（h.），乳糖溶液毫升，伊紅溶液毫升，.美藍(lán)溶液毫升,配制方式,將已滅菌的肉湯蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基熔化 以無菌操作加入預(yù)先滅菌的乳糖溶液毫升、伊紅溶液毫升及.美藍(lán)溶液毫升,培養(yǎng)結(jié)果觀察,大腸桿菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反射光下常常有一種金屬光澤（亮綠色） 產(chǎn)氣桿菌以粘質(zhì)狀菌落豐盛地生長，呈棕色 一般腸道致病菌不發(fā)酵乳糖，故呈粉紅色或蘭色的菌落,中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤,糞便污染指示菌之二-糞大腸菌群（faecal coliforms）或耐熱大腸菌群,首先由Eijk

15、man提出，指的是在高溫下發(fā)酵乳糖，是總大腸菌群的亞群，同時也稱為耐熱大腸菌群。 大腸菌群包括：糞（便）大腸菌群和非糞（便）大腸菌群,糞大腸菌群（faecal coliforms）或耐熱大腸菌群,糞大腸菌群定義在44.5 條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，革蘭氏陰性兼性厭氧的小桿菌。包含絕大部分大腸桿菌，少數(shù)腸桿菌和克雷伯氏菌屬的某些品系。 糞大腸菌群的檢測，除水、貝類、貝類養(yǎng)殖水在44.5進(jìn)行，其他所有食品都在45.5進(jìn)行,糞便污染指示菌之三-大腸桿菌,是人類和大多數(shù)溫血動物腸道中的正常茵群 條件致病菌,大腸桿菌，學(xué)名為大腸埃希氏菌（ Escherichia coli，E.coli,大腸桿菌指革蘭氏陰

16、性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為+-或-+-的細(xì)菌。 與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC,大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測,大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測,菌落總數(shù)和大腸菌群MPN的其他測定方法,疏水網(wǎng)膜法（膜過濾法） TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）顯色法 DC(去氧膽酸鈉)半固體法 紙片法 等,膜過濾法,最適合于檢測水樣品，也可用于含微量顆粒少的液體食品,我國飲用水衛(wèi)生

17、標(biāo)準(zhǔn),3個大腸菌群/1L飲水 100個細(xì)菌總數(shù)/1ml飲水,水中大腸桿菌的檢測方法主要有多管發(fā)酵法和濾膜法等。其中，多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸桿菌能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，以及革蘭氏陰性、無芽孢、在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上菌落呈深紫黑色并具有金屬光澤等特性，通過初發(fā)酵實驗、平板分離和復(fù)發(fā)酵實驗三個步驟進(jìn)行檢測，以求得水樣中的大腸桿菌數(shù)。用該法檢測大腸桿菌雖費時較久、手續(xù)較繁，但準(zhǔn)確可靠，是經(jīng)典的檢測方法,膜過濾,TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）顯色法,在計數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中),細(xì)菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義,酵母菌在TTC上的菌落特

18、征,DC(去氧膽酸鈉)半固體法,1）選擇三個稀釋度的樣品液，每個稀釋度分別取1ml放入滅菌試管中。 (2)將溶化并冷至50左右的DC半固體培養(yǎng)基加入上述試管中，每管3m1。立即混合)，凝固后于37培養(yǎng)1824小時。(3)判定標(biāo)準(zhǔn)和記錄：a培養(yǎng)基變桔紅色，有氣泡產(chǎn)生或瓊脂崩裂。記錄為；b培養(yǎng)基為桔紅色，或有桔紅色菌落，無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為十；c培養(yǎng)基為綠色，有黃色菌落，無氣泡和瓊脂崩裂現(xiàn)象，記錄為；d培養(yǎng)基為綠色，記錄為。(4)判定為a、d反應(yīng)結(jié)果；記錄陽性管數(shù)，查MPN表并報告之。若為b、c反應(yīng)結(jié)果，可挑大腸菌群可疑菌落接種乳糖復(fù)發(fā)酵管，根據(jù)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管數(shù)查MPN表，并報告之,菌落為紅色

19、，周圍有紅色的菌落膽鹽沉淀環(huán)，直徑為2-3mm或更大,糞便污染指示菌之四-腸球菌（Enterococcus,是鏈球菌屬中的一個血清學(xué)群（D型群）（Lancefield應(yīng)用鏈球菌細(xì)胞壁中多糖類半抗原，將鏈球菌分成ABCD-十九個血清群,腸球菌分類,1989年，依據(jù)Facklam和Collins的分類，腸球菌屬內(nèi)包括十二個種及一個變異株，它們是： 糞腸球菌（E.faecalis） 屎腸球菌（E.faecium) 鳥腸球菌(E.avium) 酪黃腸球菌(E.casseliflavus) 堅忍腸球菌(E.durans) 雞腸球菌E.galinarum) 芒地腸球菌(E.mundii) 惡臭腸球菌(E.

20、maladoratum) 希拉腸球菌(E.hirae) 孤立腸球菌（E.solitarius） 棉子糖腸球菌(E.raffinosus) 假鳥腸球菌(E.pseudoavium) 糞腸球變異株(E.faecalis var)。 糞腸球菌為該屬中最常見的即為代表種,自然界分布廣，存活力持久 腸球菌普遍存在于自然界，一般棲居在各種溫血和冷血動物的腔腸，甚至昆蟲體內(nèi)，也是健康人體的上呼吸道，口腔或腸道的常居菌。本菌可以引起心內(nèi)膜炎，膽囊炎，腦膜炎，尿路感染及傷口感染等多種疾病。在人類糞便中的數(shù)量僅次于大腸菌群，每克成人的糞便中約含108個,腸球菌分布,腸球菌生物學(xué)性狀,腸球菌屬的細(xì)菌為革蘭氏陽性球菌

21、，多數(shù)菌種成雙或呈短鏈狀排列；一般無芽胞，無莢膜，少數(shù)菌種有鞭毛，陳舊培養(yǎng)物或在厭氧狀態(tài)下有時呈革蘭氏陰性。 最適生長溫度37，最適pH為4.7-7.6，屬內(nèi)各菌種均能在.5%氯化鈉肉湯,pH9.6葡萄糖肉湯及生長，個別菌種在50時生長快,抵抗力強及耐受性強 ，生長營養(yǎng)要求不高 目前該菌多作為生活飲用水，管道水和一些水質(zhì)的指示菌。衛(wèi)生學(xué)家認(rèn)為，腸球菌類似于大腸菌群的生態(tài)活動，但其對惡劣的外環(huán)境和冷凍條件具有較強的抵抗力，作為監(jiān)測水質(zhì)衛(wèi)生，環(huán)境衛(wèi)生質(zhì)量的污染指標(biāo)更具有衛(wèi)生學(xué)意義,腸球菌抵抗性,致病菌,三、致病菌（病原菌,根據(jù)不同食品的特點選定一定的病原菌作為檢驗的重點對象。例如蛋粉、冷凍禽類、肉

22、類食品等常規(guī)定沙門氏菌是必須檢驗的重要項目；酸度不高的罐藏食品，肉毒桿菌是必須檢驗的對象；酸牛奶則規(guī)定腸道致病菌和致病性球菌（鏈球菌和葡萄球菌）是檢測重點,食品中常見的致病性微生物,能引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等,能產(chǎn)生毒素并引起食物中毒的微生物： 肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真菌，都會產(chǎn)生毒素,致病性大腸桿菌,病原性大腸桿菌（致病性大腸桿菌）分類,腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（enterotoxigenic E. coli , ETEC,腸致病性大腸桿菌（enteropathic E. coli , ETEC,腸侵襲性大腸桿菌（entero invasive E. coli , ETEC,腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic E. coli , ETEC,大腸桿菌0 157：H7血清型屬腸出血性大腸桿菌,大腸桿菌O157,生物學(xué)特性,革蘭氏陰性短桿菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。 大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K,4、抗原構(gòu)造復(fù)雜,鞭毛抗原（H,菌體抗原（O,K或Vi抗原,致病物質(zhì),大腸桿菌的致病物質(zhì)為定居因子，即 大腸桿菌的菌毛 腸毒素,所致疾病,腸道外感染 急性腹瀉,月桂