常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用（人衛(wèi)9版）ppt課件

1、作者 : 藥立波,單位 : 第四軍醫(yī)大學(xué),第二十四章,常用分子生物學(xué)技術(shù) Basic Techniques in Molecular Biology,第一節(jié) 分子雜交和印跡技術(shù),第二節(jié) PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用,第三節(jié) DNA測(cè)序技術(shù),第四節(jié) 生物芯片技術(shù),第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分離、純化與結(jié)構(gòu)分析,第六節(jié) 生物大分子相互作用研究技術(shù),重點(diǎn)難點(diǎn),印記技術(shù)的概念；PCR技術(shù)的概念，原理、用途；DNA序列測(cè)定的概念和用途；生物芯片的概念；蛋白質(zhì)分離純化的主要技術(shù)所依據(jù)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì),印記技術(shù)的種類；實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的原理和用途；新一代DNA序列測(cè)定的概念和用途；生物芯片的用途；蛋白質(zhì)分離純化的主要方法的概

2、念和應(yīng)用,分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的意義；基因文庫(kù)的概念；蛋白質(zhì)分離純化的主要方法及其基本原理；多肽鏈中氨基酸的序列分析方法及其原理；蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的基本原理；蛋白質(zhì)相互作用分析的主要方法和意義,分子雜交和印記技術(shù),第一節(jié),Molecular Hybridization and BlottingTechnique,不同的DNA或RNA分子之間，或DNA分子與RNA分子之間，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，兩條完全或不完全互補(bǔ)的多核苷酸鏈相互結(jié)合、形成雜交分子的過(guò)程,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理,分子雜交 (molecular hybridization,分子雜交技術(shù),印跡技術(shù),是將待檢測(cè)的生物大

3、分子轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，再通過(guò)分子雜交，使其得到顯現(xiàn)的過(guò)程。通過(guò)印跡技術(shù)不僅能夠檢測(cè)DNA 或RNA分子，還能夠利用抗原、抗體相互識(shí)別結(jié)合的特點(diǎn)，對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行檢測(cè)。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，即印跡技術(shù),探針（probe）指的是帶有特殊可檢測(cè)標(biāo)記的多聚核苷酸片段 放射性核素、生物素或熒光染料可以標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列 探針可以與固定在NC膜上的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合可以用于檢測(cè)核酸樣本中存在的特定基因,探針技術(shù),二、分子雜交和印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,DNA印跡 (Southern Blotting) Southern EM,1975,RNA印跡 (Nor

4、thern Blotting) Alwine JC，Kemp DJ and Stark GR,1977,蛋白質(zhì)的印跡 (Western Blotting) Towbin H, Staehelin T and Gordon J,1979,用于克隆基因的酶切圖譜、基因組中某一基因的定性及定量、基因突變、基因拷貝數(shù)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析等,用于RNA的定性定量分析,用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究,DNA印跡實(shí)驗(yàn),三種印跡技術(shù)的比較,其他雜交或印記技術(shù) 斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization) 組織原位雜交 細(xì)胞染色體DNA原位雜交 菌落原

5、位雜交 DNA芯片技術(shù) (DNA chip,原位分子雜交技術(shù),基本原理：利用標(biāo)記的核酸分子探針與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA結(jié)合，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái) 重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定，具有能與待測(cè)特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列（探針），以及與探針結(jié)合的標(biāo)記物,原位雜交是進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù),分析基因在染色體上的位置 DNA熒光原位雜交 確定特定基因的表達(dá)定位 RNA原位雜交,原位分子雜交技術(shù),PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用Principle and Application of Polymerase Chain Reaction,第二

6、節(jié),簡(jiǎn)稱PCR，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程在體外獲得大量DNA的技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng) (The Polymerase Chain Reaction, PCR,一、PCR技術(shù)的基本原理,以待擴(kuò)增的DNA分子為模板，用兩條寡核苷酸片段作為引物，分別在擬擴(kuò)增片段的DNA兩側(cè)與模板DNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，提供3-OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成兩條新鏈的合成。不斷重復(fù)這一過(guò)程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增,模板（template）： DNA雙鏈,原料（material）： 四種dNTP,催化酶（enzyme）： 耐熱的DNA聚合酶,引物（primer）： 兩條,Mg

7、2+緩沖液,基本反應(yīng)過(guò)程,一對(duì)模板變性開(kāi) 二條引物退火連 三種溫度交替變 四種原料來(lái)延伸,PCR體系基本組成成分,變性 退火 延伸,基本反應(yīng)步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C （50-65 C,產(chǎn)物：兩引物之間特異的DNA片段,變性（9496C ） 退火（5065C ） 延伸（72C,PCR工作原理示意圖,二、PCR技術(shù)的主要用途,一）獲得目的基因片段 在人類基因組計(jì)劃完成之前，PCR是從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，該技術(shù)是從各種生物標(biāo)本或基因工程載體中快速獲得已知序列目的基因片段的主要方法 （二）DNA和RNA的微量分析 PCR

8、技術(shù)敏感性高，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理論上講，1滴血液、1根毛發(fā)或1個(gè)細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測(cè)需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景 （三）DNA序列分析 將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度，是實(shí)現(xiàn)高通量DNA序列分析的基礎(chǔ)。待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定,四）基因突變分析 PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性，例如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、等位基因特異的寡核苷酸探針?lè)治?、基因芯片技術(shù)、DNA序列分析等 （五）基因的體外突變 在PCR技術(shù)建立以前，在體外對(duì)基

9、因進(jìn)行各種突變是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作?，F(xiàn)在，利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行插入、嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造,逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù) RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法,逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),24,逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)常用引物,逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)原理,三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),原位PCR技術(shù),利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的基因片段 PCR反應(yīng)在福爾馬林固定、

10、石蠟包埋的組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)后，再用特異性探針進(jìn)行原位雜交即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在 原位PCR將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合，既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置,實(shí)時(shí)PCR技術(shù),實(shí)時(shí)PCR (real-time PCR) 技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 實(shí)時(shí)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR,三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理-非引物探針類實(shí)時(shí)PCR,最常用的熒光染

11、料為SYBR Green，它能結(jié)合到DNA雙螺旋小溝區(qū)域,引物探針類實(shí)時(shí)PCR,TaqMan探針?lè)?FRET探針?lè)?分子信標(biāo)探針?lè)?實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理-TaqMan探針?lè)?實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理-分子信標(biāo)引物探針?lè)?實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)具有定量、特異、靈敏和快速等特點(diǎn)，是目前檢測(cè)目的核酸拷貝數(shù)的可靠方法，是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。目前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域,實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用,實(shí)時(shí)PCR在腫瘤方面的應(yīng)用 實(shí)時(shí)PCR用于多態(tài)性分析 實(shí)時(shí)PCR用于病原體的檢測(cè),DNA測(cè)序技術(shù) DNA Sequencing,第三節(jié),四、DNA測(cè)序在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣

12、泛應(yīng)用價(jià)值,三、高通量DNA測(cè)序技術(shù)使基因測(cè)序走向醫(yī)學(xué)實(shí)用,二、第一代全自動(dòng)激光熒光DNA測(cè)序儀器基于雙脫氧法,一、雙脫氧法和化學(xué)降解法是經(jīng)典DNA測(cè)序方法,一、雙脫氧法和化學(xué)降解法是經(jīng)典DNA測(cè)序方法,DNA鏈末端合成終止法,二、第一代全自動(dòng)激光熒光DNA測(cè)序儀器基于雙脫氧法,早期的全自動(dòng)DNA序列分析儀的工作原理主要是基于Sanger法，采用四色熒光標(biāo)記ddNTP而制作的。采用4種不同熒光染料標(biāo)記4種不同的可終止DNA延伸反應(yīng)的底物ddNTP，經(jīng)Sanger法反應(yīng)后，賦予所合成的DNA片段4種不同的顏色。待測(cè)DNA樣品的4個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物在同一個(gè)泳道內(nèi)依照片段大小電泳分離，由儀器自動(dòng)連續(xù)采集熒光

13、數(shù)據(jù)并完成分析，最后直接顯示待測(cè)DNA的堿基序列,三、高通量DNA測(cè)序技術(shù)使基因測(cè)序走向醫(yī)學(xué)實(shí)用,人群及個(gè)體進(jìn)行全基因組序列分析必須實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序技術(shù)的微量、快速和低成本化 新的高通量DNA測(cè)序技術(shù)及其分析儀器因此應(yīng)運(yùn)而生。這些新技術(shù)被冠予新一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）之稱,新一代測(cè)序技術(shù),焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing） 循環(huán)芯片測(cè)序（cyclic-array sequencing） 單分子實(shí)時(shí)測(cè)序,二、 DNA序列分析的主要用途,通過(guò)DNA序列分析可以鑒定基因和基因組的變異 通過(guò)DNA序列測(cè)定分析人工重組的基因 通過(guò)DNA序列測(cè)定對(duì)定點(diǎn)

14、突變進(jìn)行確認(rèn),生物芯片技術(shù) Biochip Technologies,第四節(jié),是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測(cè)的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測(cè)、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNA microarray,一、基因芯片,基因芯片(gene chip,利用DNA芯片技術(shù)可同時(shí)進(jìn)行高通量基因 轉(zhuǎn)錄活性的分析 染色質(zhì)免疫共沉淀與芯片技術(shù)結(jié)合檢測(cè) 蛋白質(zhì)-DNA相互作用 （ChIP-on-chip） 確定轉(zhuǎn)錄因子及其作用位點(diǎn) 確定基因表觀遺傳修飾，

15、應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)研究,基因芯片技術(shù)的應(yīng)用,基因芯片分析腫瘤差異表達(dá)基因,是將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白質(zhì)樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù),二、蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)芯片(protein chip,蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片 蛋白質(zhì)功能芯片,蛋白質(zhì)芯片作用原理-蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng),是將數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)小的處于自然或病理狀態(tài)下的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上（通常是載玻片） 形成微縮組織切片，以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，在組織切片上高通量獲取基因的表達(dá)信息的一種技術(shù),組織芯片(tissue chip，tissue micro

16、array,多組織片 組織陣列 組織微陣列,胃癌患者的組織芯片（免疫組化染色,蛋白質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)分析 Isolation, Purification and Structural Analysis of Proteins,第五節(jié),一、有機(jī)溶劑沉淀、鹽析及免疫沉淀用于蛋白質(zhì)濃縮及分離,有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì),丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀，再將其溶解在小體積溶劑中即可獲得濃縮的蛋白質(zhì)溶液 為保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性，需要在04低溫下進(jìn)行丙酮或乙醇沉淀 沉淀后應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性,鹽析分離蛋白質(zhì),將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，

17、導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀,各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度及pH均不同，可據(jù)此將不同的蛋白質(zhì)予以分離,免疫沉淀分離蛋白質(zhì),利用特異抗體可以識(shí)別相應(yīng)抗原并形成抗原抗體復(fù)合物的特性，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得相應(yīng)的抗原蛋白,用于特定蛋白質(zhì)定性和定量分析,將抗體交聯(lián)至固相化的瓊脂糖珠上，易于獲得抗原抗體復(fù)合物,二、透析和超濾法去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物,利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法,透析（dialysis,超濾法（ultra-filtration,應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的,三、電泳分離蛋白質(zhì),電泳：蛋白

18、質(zhì)分離與鑒定的常用方法,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophoresis) 根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等,幾種重要的蛋白質(zhì)電泳,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 IEE等電聚焦電泳：通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法 2-DGE雙向凝膠電泳：蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù),樣品加于凝膠上部的上樣孔內(nèi)，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)分子根據(jù)其固有 的帶電性和分子大小進(jìn)行分離 b. 凝膠經(jīng)染料（例如：考馬斯亮藍(lán)）染色后，蛋白質(zhì)條帶得以顯現(xiàn),

19、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠中加入系列兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)中形成一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，樣品加于凝膠上部，蛋白質(zhì)根據(jù)不同的等電點(diǎn)被分離,IEE等電聚焦電泳,雙向凝膠電泳,第一相：等電聚焦電泳將蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)進(jìn)行分離 將等電聚焦電泳的凝膠置于水平的SDS-PAGE凝膠的上樣處 第二相：SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量進(jìn)行分離。圖中水平方向代表了蛋白質(zhì)等電點(diǎn) 的差別，垂直方向代表了蛋白質(zhì)分子量的差別,四、層析分離蛋白質(zhì),層析（chromatography）又稱色譜法，是根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而

20、達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的,離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離,是根據(jù)天然蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱分子篩層析,凝膠過(guò)濾層析,五、蛋白質(zhì)顆粒沉降行為與超速離心分離,超速離心法 (ultracentrifugation) 既可以用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量,蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S) 表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān),因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子形狀的高度不對(duì)稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用,六、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析,一）用化學(xué)

21、方法測(cè)定肽鏈的氨基酸序列 （二）通過(guò)核酸來(lái)推演蛋白質(zhì)的氨基酸序列,得到一個(gè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)有兩種基本策略,水解法分析已純化蛋白質(zhì)的 氨基酸殘基組分,標(biāo)記和測(cè)定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基,測(cè)定各肽段的氨基酸序列 （Edman降解法、質(zhì)譜法,把肽鏈水解成片段,至少要用兩種方法裂解多肽鏈，這兩套肽段要逐一測(cè)序，最后根據(jù)其重疊區(qū)確定這些肽段的排列次序，從而得到整條肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu),用化學(xué)分析方法測(cè)定肽鏈的氨基酸序列,水解法分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組分,蛋白質(zhì)水解后用離子交換層析分析其氨基酸組分,蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解后成為個(gè)別氨基酸，用離子交換樹(shù)脂將各種氨基酸分開(kāi)，測(cè)定它們的含量，算出各氨基酸在蛋白質(zhì)

22、中的百分組成或個(gè)數(shù),標(biāo)記和測(cè)定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基,N端,C端,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,氨基酸分析,第二個(gè)分析循環(huán),PITC,PITC,待測(cè)肽段,TFA裂解,切除了N端氨基酸的肽段,Edman降解法,通過(guò)核酸來(lái)推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質(zhì)的基因,測(cè)定DNA序列,排列出mRNA序列,七、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)分析,通常采用圓二色光譜(circular dichroism，CD)測(cè)定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。 -螺旋的CD峰有222nm處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)峰和198nm處的正峰3個(gè)成分；而-折疊

23、的CD譜不很固定,圓二色光譜可估算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例,蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)解析,X射線衍射法（X-ray diffraction）需要首先將蛋白質(zhì)制備成晶體，X射線射至蛋白質(zhì)晶體上，產(chǎn)生不同方向的衍射，收集衍射光束所產(chǎn)生的電子密度圖，可計(jì)算出空間結(jié)構(gòu) 核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance, NMR）主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)的液相三維空間結(jié)構(gòu)。 冷凍電鏡（cryo-electron microscopy）技術(shù)的發(fā)明極大提高了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析速度和分辨率，而且可以分析蛋白質(zhì)在相對(duì)天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，當(dāng)前已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要研究手段,從頭預(yù)測(cè)法 : 用分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)

24、的方法，根據(jù)物理化學(xué)的基本原理，計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu),生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)三維空間結(jié)構(gòu),同源建模法（homology modeling）:又稱為比較建模法，是根據(jù)大量已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)序列已知而結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的方法主要有兩類,生物大分子相互作用研究技術(shù) Technologies for Analyzing Interaction of Biological Macromolecular,第六節(jié),酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,一、常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個(gè)基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法,標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白質(zhì)分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子,標(biāo)簽蛋白沉淀,GST融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn),將蛋白X的編碼基因插到GST編