分子標(biāo)記技術(shù)及其在園林植物遺傳育種中的應(yīng)用

1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子標(biāo)記技術(shù)及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用摘要：概述各種常用分子標(biāo)記技術(shù)RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR，SCAR，CAPs，SNP等技術(shù)，綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳育種中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:分子標(biāo)記 植物 遺傳育種 Molecular Marker and Its Application in Garden Plant Genetics and BreedingAbstract：The principals of several commonly used molecular marker including RFLP,RAPD,AFLP,SSR,ISSR,SCAR,S

2、TS and CAPs，are introduced and the applications of molecular markers in plant breeding are summarized from the aspects varieties identification, the conservation of germplasm resources, pedigree analysis and classification gene localization, construction of genetic mapKey words：molecular marker；Plan

3、t；Genetics and Breeding近年，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用，尤以農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)應(yīng)用得最多。分子標(biāo)記是指以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記的出現(xiàn)，使植物育種的“間接選擇”成為可能，大大提高了遺傳分析的準(zhǔn)確性和選育種的有效性，因而在遺傳育種領(lǐng)域愈來愈受到重視。在遺傳學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展了很多種，一般依其所用的分子生物學(xué)技術(shù)大致分為兩大類：一類是以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記(如RFLP)，此類被稱為第一代分子標(biāo)記；以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記(如STS、RAPD、AFLP、SSR等)稱為第二代分

4、子標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記稱為第三代分子標(biāo)記，這也是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)?，F(xiàn)分別介紹其原理及在植物育種上的應(yīng)用。1分子標(biāo)記在植物育種上的特點(diǎn)分子標(biāo)記育種(molecular mark-assist selection，MAS)是借助分子標(biāo)記在DNA水平上對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對作物產(chǎn)量，品質(zhì)和抗性等綜合性狀進(jìn)行高效改良，并針對目標(biāo)性狀基困連鎖進(jìn)行優(yōu)良植株篩選，是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的新品種選育方法。與傳統(tǒng)育種相比分子標(biāo)記的優(yōu)勢是：(1)傳統(tǒng)育種通過性狀間接篩選目的基因，分子標(biāo)記則通過直接與目的基因連鎖進(jìn)行篩選，因此，后者比前者準(zhǔn)確，特別是在一些表現(xiàn)型

5、與基因型之間對應(yīng)關(guān)系較差時的篩選，(2)傳統(tǒng)育種需要在成熟期才能篩選，分子標(biāo)記篩選則可以不受植物生長發(fā)育期的限制，在苗期就可以篩選，而且不影響植株生長，(3)傳統(tǒng)方法一次只能標(biāo)記一個基因，分子標(biāo)記篩選則可以同時篩選多個目的性狀基因，(4)分子標(biāo)記篩選利用了控制單一性狀的多個等位基因，避免了傳統(tǒng)育種通過表現(xiàn)型而獲得不純植株的缺陷；(5)分子標(biāo)記篩選樣品用量少，可以進(jìn)行非破壞性篩選，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。2常用分子標(biāo)記的技術(shù)及其在植物育種上的應(yīng)用2.1限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP，簡稱限制片段長度多

6、態(tài)性) RFLP是以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，其原理是堿基的突變、缺失、重排或是一段DNA的重排或插入，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核苷酸酶的酶切位點(diǎn)分布發(fā)生改變，得到的切割片段在數(shù)量和長度上不同，從而產(chǎn)生多態(tài)性。用限制性內(nèi)切酶切割基因得到不同片段，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，印跡到尼龍膜或硝酸纖維膜上，再用DNA探針與同源序列雜交，經(jīng)放射自顯影或酶學(xué)檢測。RFLP的優(yōu)點(diǎn)是檢測到的等位基因具有共顯性，能區(qū)分純合子和雜合子，能穩(wěn)定遺傳。 甘娜16等（2006）利用RAPD、葉綠體和線粒體基因組PCR2RFLP標(biāo)記系統(tǒng)評價(jià)了大花蕙蘭20個品種的遺傳多樣性。其結(jié)果表明RAPD標(biāo)記揭示的大花蕙蘭遺傳多樣性最高,

7、其次為cpDNA PCR-RFLP標(biāo)記, 而mtDNA PCR-RFLP標(biāo)記揭示的遺傳多樣性最低。但是大花蕙蘭的葉綠體和線粒體基因組比較保守, 遺傳多樣性較低, 不能作為聚類分析的依據(jù)。 張立平29等（1996）提出簡便易行的葡萄染色體DNA的提取純化方法，并對部分葡萄種及品種進(jìn)行RFLP鑒定，以期用分子生物學(xué)方法完善我國葡萄分類，也為其它果樹分類提供借鑒。 2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplification polymorphism DNA，RAPD) RAPD以DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)為基礎(chǔ)，它的引物是一段任意寡聚脫氧核糖核苷酸單鏈片段(長度通常為810 bp)，

8、在基因組DNA上隨機(jī)引物都有特定的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域。一旦此區(qū)域的堿基突變或是DNA插序、重排、缺失，均會引起結(jié)合位點(diǎn)分布的變化，從而引起PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在數(shù)量和長度上不同，產(chǎn)生多態(tài)性。加人隨機(jī)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度不同的DNA片段，然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段，經(jīng)染色顯示相應(yīng)區(qū)域內(nèi)DNA的多態(tài)性。由于使用多個引物，多態(tài)性的檢測可以擴(kuò)大到整個基因組，因此RAPD可用于構(gòu)建基因指紋圖譜。 RAPD1(2012)技術(shù)操作簡便，已大量應(yīng)用于品種鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建及進(jìn)化關(guān)系研究（Kuginuki et al.，1997；徐炎等，2003；譚雪等，2009；Ramchiary & Lim，2011），存

9、在穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較低的不足（Jones et al.，1997）。 朱華武18等（2005）為探明茄子抗青枯病的遺傳機(jī)制, 用RAPD技術(shù)對供試材料的抗青枯病基因進(jìn)行了研究。其結(jié)果是找到了一個與茄子抗青枯病親本S3中的抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記S，該標(biāo)記與S3的抗病基因的交換值為432% , 遺傳距離為433 cM。但是試驗(yàn)中在抗病親本S3和F2代抗病池中均能擴(kuò)增出S , 而感病親本北京六葉茄和F2代感病池均缺失這條帶。 徐炎22等（2003） 以感病抗病的葡萄種間雜交組合白玉霓塘尾的F1代17個單株及塘尾自交一代16個單株為試材, 采用BSA法和RAPD 技術(shù), 通過對155個隨機(jī)引物的篩選

10、, 獲得了一個與中國野生葡萄抗白腐病基因連鎖的RAPD標(biāo)記OPP09-760 , 并在中國野生葡萄8 個種的32個株系及歐洲葡萄16個品種中得到驗(yàn)證。但是本研究獲得的刺葡萄塘尾抗白腐病基因RAPD標(biāo)記OPP09-760 ,僅為研究抗白腐病基因提供了一個突破點(diǎn), 更多的RAPD標(biāo)記及其與抗白腐病基因位點(diǎn)的距離及定位作圖是諸多學(xué)者正在進(jìn)行研究的內(nèi)容。秦賀蘭25等（2002）用RAID技術(shù)分析了18個菊花品種DNA的多態(tài)性，其結(jié)果檢測出兩個品種特有的分子標(biāo)記，大紅托桂有OPD15 (1200 bp)玉翎管缺失OPAl7(1100 bp)。瓣型一致的品種間基因型相似系數(shù)較高。但是本試驗(yàn)中篩選出的3個引

11、物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶不能將黃秀芳和白秀兩個品種的菊花花色區(qū)分開。羅素蘭26等（2001）利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD) 在一個葡萄的種間雜交組合的F1 群體中發(fā)展分子標(biāo)記,共產(chǎn)生了89 個穩(wěn)定的RAPD 標(biāo)記,連同4 個形態(tài)標(biāo)記(花型、霜霉病抗性、果皮顏色、果汁顏色) 構(gòu)建了一個葡萄RAPD 分子連鎖圖。為毛葡萄連鎖圖譜的構(gòu)建提供了一個連鎖框架。但是在圖譜上進(jìn)行更多形態(tài)性狀的基因定位或找出與目標(biāo)性狀相連鎖的其它標(biāo)記, 是需要進(jìn)一步填充更多的RAPD 標(biāo)記。王躍進(jìn)28等（1997）用RAPD技術(shù)分析了葡萄屬圓葉葡萄亞屬及真葡萄亞屬美洲種的相關(guān)性。2.3擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplific

12、ation fragment length polymorphism，AFLP)AFLP是通過限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生不同長度的DNA片段來檢測DNA的多態(tài)性。其原理是用限制性內(nèi)切核苷酸酶酶切DNA，在DNA片段的兩端加上帶有特定序列的。接頭”，然后用與接頭互補(bǔ)的3/端帶有幾個隨機(jī)選擇的核營酸引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增。只有與3/端嚴(yán)格配對的DNA片段才能擴(kuò)增。3/端的核苷酸序列決定了DNA片段的特異性。最后用高分辨率測序凝膠將擴(kuò)增產(chǎn)物分離，用放射性自顯影或銀染法檢測。該技術(shù)1(2012)可在不了解某物種任何DNA 信息情況下用于DNA 多態(tài)性的檢測，且多態(tài)性豐富，重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，是一種較為

13、理想和有效的分子標(biāo)記，被廣泛地應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因表達(dá)調(diào)控研究等（Guo et al.，2003；Zhao et al.，2005；Ramchiary & Lim，2011；Shi et al.，2011）。但操作相對較為復(fù)雜，成本較高，通常需要同位素、熒光或銀染觀察多態(tài)性，且多態(tài)性條帶較難以轉(zhuǎn)換成操作簡單的PCR 標(biāo)記（Guo et al.，2003）。趙婷婷2等（2012）以番茄抗葉霉病的品種05HN36為母本，以感病品種為父本配置雜交組合，以親本及其F2分離群體為研究材料，采用AFLP 技術(shù)篩選與抗葉霉病基因Cf12 連鎖的分子標(biāo)記。其結(jié)果是通過對545對引物進(jìn)行篩選

14、，獲得了6個連鎖的AFLP標(biāo)記。但是AFLP 的成本高和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)限制了它在育種工作中的實(shí)際應(yīng)用。劉富中10等（2008）采用AFLP分析技術(shù)和改良BAS法，通過512對EM引物組合的篩選，獲得1個與茄子單性結(jié)實(shí)基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記E75M53-70，該標(biāo)記與單性結(jié)實(shí)基因間的遺傳圖距為1538cM，可用于茄子單性結(jié)實(shí)性的鑒定和單性結(jié)實(shí)分子標(biāo)記輔助育種，加速茄子單性結(jié)實(shí)基因的轉(zhuǎn)育和利用。但是通過試驗(yàn)可知茄子單性結(jié)實(shí)的遺傳機(jī)制較復(fù)雜，存在多個單性結(jié)實(shí)基因的控制，不同材料的遺傳特性不盡相同。唐美玲11等（2008）利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù), 篩選與山葡萄性別相關(guān)的分子標(biāo)記, 同時將其轉(zhuǎn)化為

15、簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記, 可加快葡萄育種進(jìn)程。但是AFLP標(biāo)記具有操作程序復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。因此, 有必要將與山葡萄性別相關(guān)的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為簡單實(shí)用的SCAR標(biāo)記，并且用于山葡萄分子標(biāo)記輔助育種。羅建華14等（2006）以抗病的秋棚和感病的歐洲8號雜交獲得的115份重組自交系(RIL)為材料, 采用集團(tuán)分離分析法(BSA) 和AFLP技術(shù)進(jìn)行了黃瓜抗ZYMV-CH遺傳規(guī)律和連鎖分子研究，并將其轉(zhuǎn)化成共顯性的SCAR 標(biāo)記SCAR3-109，作為黃瓜抗ZYMV輔助選擇的分子標(biāo)記。但是遺傳學(xué)家早就對黃瓜抗ZYMV-CH基因的遺傳進(jìn)行了研究, 認(rèn)為抗性受隱性單基因控制，但本試驗(yàn)中也存在微效基因

16、的作用。 顧興芳15等（2006）運(yùn)用AFLP技術(shù), 采用集群分析法(BSA) 進(jìn)行與黃瓜果實(shí)苦味基因連鎖的分子標(biāo)記的研究,找到了與苦味基因連鎖的兩個顯性AFLP標(biāo)記: E23M66-101和E25M65-213，可用于無苦味黃瓜的分子標(biāo)記輔助育種。但是本試驗(yàn)中對E23M66-101和E25M65-213采用Blast軟件在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行查詢，未發(fā)現(xiàn)與這兩個片段相似性高的片段，說明這兩個片段為新發(fā)現(xiàn)的黃瓜的DNA序列。 婁群峰17等(2005)利用AFLP標(biāo)記結(jié)合銀染技術(shù)獲得了與黃瓜全雌性位點(diǎn)連鎖距離為6.7cM的標(biāo)記,并成功地將其轉(zhuǎn)化成操作簡便、表現(xiàn)穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記,該標(biāo)記命

17、名為SA166。但是在本研究中與TG/CAC234標(biāo)記連鎖的雌性基因?qū)S瓜全雌性表型具有決定作用, 其可能是一個決定全雌性的關(guān)鍵性基因, 但其是否為F基因則需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。李錫香21等（2004）采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對中國黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性及其與外來種質(zhì)的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明8對AFLP引物在70份黃瓜種質(zhì)中共擴(kuò)增出425條帶，多態(tài)性帶的比例為66。聚類分析將70份種質(zhì)分為三大組群，即西雙版納黃瓜組群，野生黃瓜組群和栽培黃瓜組群。大多數(shù)華南型和華北型種質(zhì)歸屬于不同的亞組。這些結(jié)果有助于有目的地利用這些變異拓寬育種材料的遺傳背景。但是在本研究中，雖然大多數(shù)形態(tài)特性類似的種質(zhì)被聚在

18、了一起，但是依據(jù)AFLP標(biāo)記的分類與種質(zhì)的形態(tài)特征和生態(tài)特性的分類也有不相一致的。并且AFLP的檢測效率在不同作物或同種作物不同材料中差異較大。2.4簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat，SSR)SSR叉稱微衛(wèi)星DNA，是由16個核苷酸基序串聯(lián)重復(fù)組成的DNA序列。常見的是二核苷酸重復(fù)序列如(AT)n、(TG)n，這種序列廣泛分布在基因組的不同位置，其重復(fù)單位具有高度的可變性，其多態(tài)性來源于重復(fù)數(shù)量的不同。在不同個體中，重復(fù)序列出現(xiàn)的頻率不同，造成了個體之間的多態(tài)性?；蚪M中某一特定的微衛(wèi)星DNA的側(cè)翼序列通常是保守的單一序列，通過測定側(cè)翼序列，根據(jù)其互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通

19、過PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)量不同，從而擴(kuò)增出不同長度的DNA片段。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙酰胺凝膠電泳。在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來一種簡單序列間區(qū)重復(fù)多態(tài)性(intersimple sequence repeat polymorphism ISSR)標(biāo)記，是用兩個相鄰SSR區(qū)間的引物去擴(kuò)增單拷貝序列，然后通過電泳檢測。引物是由2-3個核苷酸作為基元，以不同重復(fù)次數(shù)再加幾個非重復(fù)的錨定堿基組成的隨機(jī)引物，如(AC)nX、(TG)nX。它避免了SSR種問的特異性，且開發(fā)費(fèi)用低、精度高，目前用于遺傳作圖，品種鑒定、遺傳分化等領(lǐng)域。高穎3等（2012）以190份大白菜種質(zhì)材料為試材，利用分布

20、于全基因組的30個SSR標(biāo)記和27個InDel標(biāo)記，全面分析其群體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行抽薹時間、開花時間與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。其結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)13個標(biāo)記的17個位點(diǎn)與抽薹時間和開花時間相關(guān)，其中15個與抽薹時間相關(guān)，12個與開花時間相關(guān)。10個位點(diǎn)同時與兩個性狀相關(guān)聯(lián)。但是通過本研究可發(fā)現(xiàn)遺傳組分的混合程度是有所不同，遺傳組分相對單一的基因型與遺傳組分混合程度高的基因型的遺傳背景相對差距較遠(yuǎn)，適合作為親本材料配置雜交組合。李慧4等（2012）基于中國48個平菇栽培品種的11對SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，參照位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略，提出了針對小樣本容量的原種質(zhì)在構(gòu)建核心樣本過程中取樣量的確定方法，以期為平菇栽培品種核心樣

21、本的構(gòu)建提供方法依據(jù)。結(jié)果表明：采用位點(diǎn)優(yōu)先取樣策略，在等位基因保留比例為95%的水平上構(gòu)建的核心樣本能夠以最小的樣本量最大限度地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性。但是本研究篩選的11個SSR位點(diǎn)，僅分布在糙皮側(cè)耳全基因組12個nuclear scaffold 中的4個，所以對于該平菇種質(zhì)遺傳多樣性的檢測還不夠全面，還需對覆蓋糙皮側(cè)耳全基因組范圍的SSR位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)。張水明5等（2012）通過SSRIT軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫已收錄的8188條蝴蝶蘭EST進(jìn)行分析，開發(fā)了更多新的蝴蝶蘭EST-SSR標(biāo)記，其結(jié)果表明設(shè)計(jì)開發(fā)的蝴蝶蘭的EST-SSR標(biāo)記是有效的。但是本研究的結(jié)果與其他學(xué)者的同類研究有一

22、定的差異，其原因是是SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)不同。時秋香8等（2009）利用黃瓜近等基因系純雌株W1983G (基因型為FFMM ) 與兩性花株W1983H (基因型為FFMM ) 為親本, 以W1983H為回交親本構(gòu)建了BC1代分離群體, 采用SSR及SCAR分子標(biāo)記技術(shù), 獲得了3個與M 基因緊密連鎖的標(biāo)記SSR23487、SCAR123 和SSR19914, 這3個分子標(biāo)記的獲得不僅可以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種, 而且為最終M 基因的克隆打下了基礎(chǔ)。但是本研究中受近等基因系及SSR位點(diǎn)全基因組掃描進(jìn)行引物設(shè)計(jì)等因素的限制, 所得的分子標(biāo)記偏少。盧江30等（1995）應(yīng)用12對SSR引物對39個葡萄

23、品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出了155條不同分子量DNA條帶，其中多態(tài)性位點(diǎn)149個，占96.13。依據(jù)SSR特征譜帶，可直接鑒別出供試品種；根據(jù)聚類結(jié)果，在相似系數(shù)為0.66時可將供試39個葡萄品種劃分為3個類群，絕大部分系譜相同或相近的品種聚到了一起，不同地域起源的品種間界限不明顯。2.5序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(sequence characterize amplification region，SCAR)SCAR是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記。其原理是對基因作RAPD分析后，選取目的DNA片段克隆，對其末端測序，根據(jù)末段序列設(shè)計(jì)引物。以此引物對DNA再進(jìn)行特異PC

24、R擴(kuò)增，可以鑒別與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點(diǎn)。由于引物較長，具有重復(fù)性和穩(wěn)定性，主要用于基因定位及遺傳作圖。國艷梅19等（2005）結(jié)合SCAR標(biāo)記的原理與多引物PCR技術(shù), 建立了共顯性標(biāo)記技術(shù)Codominant2SCAR。利用該技術(shù)對12份番茄近等基因系進(jìn)行了遺傳鑒定, 結(jié)果表明該方法具有重復(fù)性好、迅速、簡便、成本低的特點(diǎn), 可用于番茄和其它作物的分子育種。江海坤6等（2011）CRF-SCAR分子標(biāo)記輔助篩選恢復(fù)系，對2006年秋2009年秋利用引進(jìn)的CMS不育源作轉(zhuǎn)育母本，配合力自交系材料HY13作輪回親本進(jìn)行3年6個世代的回交，為辣椒雄性不育系及其恢復(fù)系選育提供參考。但是本研究

25、只是進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)。2.6酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplification polymorphism sequence tagged sites，CAPs)CAPs實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合的一種方法。PCR引物是針對特定位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，根據(jù)已知位點(diǎn)DNA序列資源設(shè)計(jì)的PCR引物對特異位點(diǎn)的某一DNA片段擴(kuò)增，接著用專一性很強(qiáng)的限制性內(nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)凝膠電泳、分離、染色觀察其多態(tài)性。 王孝宣20等(2005)建立了同時檢測番茄抗根結(jié)線蟲基因(Mi)和抗葉霉病基因(Cf5)的Mutip lex-CAPS技術(shù),并利用該技術(shù)檢測了12份番茄材料含有的抗性基因。但是在本研究

26、中利用Multiplex-CAPS技術(shù)對12份番茄是否含有Mi和Cf5基因，沒有出現(xiàn)同時含有這兩個基因的植株。王孝宣23等（2003）應(yīng)用MultiplexPCR和CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)原理研究建立了MutiplexCAPS技術(shù)。利用該技術(shù)對番茄TA517及其近等基因系的分析表明，MultiplexCAPS能同時檢測2個、3個或多個CAPS標(biāo)記的多態(tài)性，其效果等同于每個CAPS標(biāo)記的多態(tài)性的疊加，重復(fù)性好，分析效率高，降低成本數(shù)倍。但是MultiplexCAPS存在缺點(diǎn)，需要用先PCR Buffer，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳提高酶

27、切產(chǎn)物的分辨率，可以克服其缺點(diǎn)。2.7簡單序列重復(fù)間區(qū)（intersimple sequence repeat，ISSR) ISSR是以一種錨定引物(SSR引物添加堿基)PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記。該技術(shù)是利用錨定引物與特定位點(diǎn)互補(bǔ)的重復(fù)序列間的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物的差異性表現(xiàn)為物種間(內(nèi))的多態(tài)性，具有引物通用、多態(tài)性高、信息量大、檢測方便等優(yōu)點(diǎn)。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖和指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究、物種進(jìn)化及系統(tǒng)分類研究、品種鑒定等研究中。朱元娣24等（2003）以普通型蘋果品種富士和柱型蘋果舞姿以及其雜交后代的柱型與非柱型實(shí)生苗為試材, 建立了蘋果的ISS

28、R分子標(biāo)記體系, 并將ISSR標(biāo)記用于蘋果柱型基因Co 的遺傳分析。其結(jié)果是獲得了35個ISSR標(biāo)記, 其中33個標(biāo)記呈現(xiàn)11分離,可用于蘋果柱型基因的遺傳分析。但是在本試驗(yàn)中在可以檢測區(qū)域的片段由于瓊脂糖凝膠電泳分離能力，一些多態(tài)性片段不能被檢測到。呂琳13等（2008）采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對來源于不同地區(qū)的19份要用菊花種源、4份野菊種源、1份菊花腦種源和一份雜交菊花黃金菊種源進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析。聚類分析結(jié)果表明：種源可分成2大類，即野菊、菊花腦、雜交菊花歸為一組，19份藥用菊花種源歸為一組；19份藥用菊花種源又可根據(jù)原產(chǎn)地進(jìn)一步分成2組，大部分原產(chǎn)北方的藥用菊花種源的遺傳關(guān)系較近，而

29、大部分南方栽培的藥用菊花種源也有相對較近的遺傳關(guān)系。但是通過本實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)有些ISSR引物反應(yīng)不穩(wěn)定，可能是由于ISSR引物含有重復(fù)序列，與它結(jié)合的基因組DNA內(nèi)靶序列在DNA復(fù)制過程孛存在滑動翻不均等現(xiàn)象，在不同品種或個體之間的重復(fù)次數(shù)差算較大，易引起引物結(jié)合位點(diǎn)和兩結(jié)合位點(diǎn)間片段長度的差異。2.8 SCoT目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（start codon targeted polymorphism，SCoT） SCoT標(biāo)記是Collard 和Mackill從水稻上提出的一種基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)（single primer amplification reaction，SPAR）的新型分子標(biāo)記，是一

30、種新的目的基因分子標(biāo)記，其原理是根據(jù)植物基因中的ATG 翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記，并且操作簡單，多態(tài)性豐富。韓國輝7等（2011）采用正交設(shè)計(jì)方法，對影響柑橘SCoT-PCR 反應(yīng)的Mg+2、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶及模板DNA 用量等因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了適于柑橘的SCoT 標(biāo)記分析體系。研究結(jié)果表明建立的柑橘SCoT體系結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可為柑橘遺傳育種提供新的技術(shù)支持。但是由于SCoT反應(yīng)結(jié)果受材料、反應(yīng)體系等因素的影響很大，有必要對SCoT-PCR 體系進(jìn)行優(yōu)化。2.9 ISTR反向序列標(biāo)簽重復(fù)技術(shù)

31、( inverse sequence2tagged repeat, ISTR) ISTR是一種基于逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記。ISTR標(biāo)記較AFLP等常規(guī)分子標(biāo)記靈敏, 因使用的是通用引物, 故與其它以物種特異性引物為前提的逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記類型相比, 可以免去前期逆轉(zhuǎn)座子引物開發(fā)步驟, 降低試驗(yàn)成本和提高效率。杜曉云9等（2009）利用反向序列標(biāo)簽重復(fù)技術(shù)，對柿屬7個種共32個基因型進(jìn)行了種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系研究。結(jié)果表明: ISTR可區(qū)分供試柿屬植物中的30份;ISTR能夠很好地適用于柿屬植物親緣關(guān)系分析;供試的中國與日本原產(chǎn)柿種質(zhì)分別聚類;新發(fā)現(xiàn)的中國甜柿變異類型與日本甜柿的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)且存在較豐富

32、的遺傳變異, 可能是潛在的育種資源。ISTR標(biāo)記可在柿屬植物種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析中更廣泛地應(yīng)用。但是本試驗(yàn)中新發(fā)現(xiàn)的稀有的中國原產(chǎn)完全甜柿，目前尚未用于育種實(shí)踐中。2.10 IRAP技術(shù)和REMAP技術(shù) IRAP和REMAP是Kalendar等(1999)基于大麥的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子首先開發(fā)出來兩種檢測效率高、重復(fù)性強(qiáng)的分子標(biāo)記方法。REMAP根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩端的LTR保守序列和微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與簡單重復(fù)序列之間的多態(tài)性。IRAP根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩端的LTR保守序列設(shè)計(jì)引物，檢測相鄰?fù)患易宓姆崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)間的多態(tài)性。王利英12等（2008）根據(jù)煙草和大麥中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)

33、座子Bare-1和Ttol的LTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對14份茄子材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且建立了IRAP和REMAP分子標(biāo)記體系。其結(jié)果是通過兩種方法均得到了多態(tài)性豐富的指紋圖譜，為茄子品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建提供了新途徑。但是本試驗(yàn)在優(yōu)化反應(yīng)體系過程中發(fā)現(xiàn)，兩種方法對循環(huán)次數(shù)要求較高，循環(huán)達(dá)到40次擴(kuò)增圖譜才清晰正常，適宜采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高對弱帶的分辨率。2.11 SNP單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（Single Nucleotide Poiymoprphism, SNP）SNP27單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（Single Nucleotide Poiymoprphism, SNP）是美國學(xué)者Land

34、er E于1996年提出的基于DNA芯片技術(shù)的第三代DNA遺傳標(biāo)記。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展，SNP漸漸成為與分子標(biāo)記有關(guān)各領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)，有望成為最重要最有效的分子標(biāo)記技術(shù)。3結(jié)語目前分子標(biāo)記技術(shù)在植物育種中主要起輔助性作用。分子標(biāo)記主要是用于一些表現(xiàn)型與基因型相關(guān)性不是很大的植株的篩選。大部分是先在構(gòu)建好遺傳圖譜的基礎(chǔ)上尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，然后從雜交子代中檢測分子標(biāo)記是否存在。檢測到了分子標(biāo)記的植株，表明含有目的基因，可以進(jìn)一步優(yōu)化和篩選。與傳統(tǒng)育種相比，分子標(biāo)記育種更快，更節(jié)省人力、節(jié)約時間、提高效率。但分

35、子標(biāo)記技術(shù)在園林植物遺傳育種中應(yīng)用較少，今后若加大結(jié)合力度，必將促進(jìn)植物遺傳育種工作的快速發(fā)展。 分子標(biāo)記在輔助育種中主要用在種質(zhì)資源的鑒定及評價(jià)、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的定位、外來染色體的鑒定，基因的累加等方面。但目前，與主要農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記還比較少，且分子標(biāo)記的成本高，因此，降低應(yīng)用成本是分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。參考文獻(xiàn)：1 許蘭桂，夏巖石，李榮華，等菜薹分子標(biāo)記利用的研究進(jìn)展園藝學(xué)報(bào)：2012,39(9)：1739-17482 趙婷婷，宋寧寧，姜景彬，等番茄抗葉霉病基因Cf12 的分子標(biāo)記及種質(zhì)資源篩選園藝學(xué)報(bào)：2012,39(5)：985-9113 高穎，羅雙霞，王彥華，等

36、大白菜抽薹開花時間與SSR和InDel 標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析園藝學(xué)報(bào)：2012,39(6)：1081-10894 李慧，陳強(qiáng)，黃晨陽，等基于SSR標(biāo)記構(gòu)建平菇栽培品種核心樣本方法的探討園藝學(xué)報(bào)：2012,39(10)：2023-20325 張水明，陳程，等蝴蝶蘭EST資源SSR標(biāo)記分析與開發(fā)園藝學(xué)報(bào)：2012,39(6)：1191-11986江海坤，張其安，方凌，等辣椒雄性不育系HY13A 的選育及其恢復(fù)系的分子標(biāo)記輔助篩選園藝學(xué)報(bào)：2011,38(增刊)：25797 韓國輝，向素瓊，汪衛(wèi)星，等柑橘SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立及其在遺傳分析中的用園藝學(xué)報(bào)：2011,38(7)：1243-12508時秋香,劉世強(qiáng),李征，等與黃瓜M基因連鎖的三個共顯性標(biāo)記園藝學(xué)報(bào)：2009,36(5)：737-7429 杜曉云 ,張夢思,羅正榮，等ISTR在部分柿屬植物種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析中應(yīng)用園藝學(xué)報(bào)：2009,36(4)：481-48610劉富中，萬翔一，陳鈺輝，等茄子單性結(jié)實(shí)基因的遺傳分析及AFLP分子標(biāo)記園藝學(xué)報(bào)：2008,35(9)：1305-130911 唐美玲, 孔瑾 , 許雪峰，等山葡萄性別相關(guān)AFLP標(biāo)記篩選及SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化園藝學(xué)報(bào)：2008,35(2)：195-20012 王利英，杜永臣，張斌，等茄子IRAP和REMAP分子標(biāo)記的開發(fā)