2017人教版高中生物選修1專題5課題3《血紅蛋白的提取和分離》導(dǎo)學(xué)案(最新整理)

1、專題 5 課題 3 血紅蛋白的提取和分離一、基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法1、凝膠色譜法也稱做，是根據(jù)分離蛋白質(zhì)的有效方法。2、凝膠實際上是一些微小的球體，這些小球體大多數(shù)是由構(gòu)成的，如葡聚糖或瓊脂糖。3、在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時速度不同， 相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程，移動速度；而相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在移動，路程，移動速度。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。（二）緩沖溶液1、緩沖溶液的作用是。2、緩沖溶液通常由溶解于水中配制而成的。3、生物體內(nèi)進行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的 ph 下進行的，為了

2、 ，必須保持體外的 ph 與體內(nèi)的。（三）電泳1、電泳是指。2、許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的 ph 下，這些基團會帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷 的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各分子的差異以及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3、兩種常用的電泳方法是和，在凝膠中加入 sds，電泳速率完全取決于 ，因此，在測定蛋白質(zhì)分子量時通常使用。二、實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：、和。（一）樣品處理1、 紅細胞的洗滌： 洗滌紅細胞的目的是， 采集的血樣要及時分離紅細胞，分離時采用 離心（500

3、r/min），然后用膠頭吸管吸出上層透明的，將下層暗紅色的 倒入燒杯，再加入 （質(zhì)量分數(shù)為 ），緩慢攪拌 min，離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至，表明紅細胞已洗滌干凈。2、血紅蛋白的釋放：在和作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。3、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合溶液離心（2000r/min） 后，試管中的溶液分為 4 層。第一層為無色透明的，第 2 層為白色薄層固體，是，第 3 層是紅色透明液體，這是 ，第 4 層是的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的。（二）粗分離：透析取 1ml 的血紅蛋白溶液裝入中，將透析袋放入盛有 300ml 的物

4、質(zhì)的量的濃度為20mmol/l 的 （ph7.0）中，透析 12h。透析可以去除樣品中的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。（三）純化：凝膠色譜操作1 、制作凝膠色譜柱2、裝填凝膠色譜柱裝填前將色譜柱固定在支架上。因為干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需要的凝膠量。裝填時凝膠要緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時要輕輕敲動色譜柱，使凝膠裝填，色譜柱內(nèi)不得有存在，一旦發(fā)現(xiàn)，必須重裝。裝填完后，連接緩沖液洗脫瓶，在約 50cm 高的操作壓下，用 300ml 物質(zhì)的量濃度為 20mmol/l 的（ph7.0）充分洗滌平衡凝膠 12h，使凝膠。3、樣品的加入和洗脫準備：打開色譜

5、柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的的緩沖液與凝膠面，關(guān)閉出口。加樣：用吸管小心地將 1ml 透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意。加樣后打開下端出口，直到樣品后，關(guān)閉下端出口。洗脫：小心加入物質(zhì)的量的濃度為 20mmol/l 的（ph7.0）到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。待接近色譜柱時，用試管收集。（四）純度鑒定： 三、操作提示1、 紅細胞的洗滌 洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去；離心速度過高和時間過長會使一同沉淀，達不到分離的效果。2、色譜柱填料的處理 商品凝膠使干燥的顆粒，使用前需直接放在洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可以將加入洗脫液的濕凝膠用加

6、熱，逐漸升溫至接近沸騰，通常只需 1 2h。這種方法不但，而且可以除去凝膠中可能帶有的，排除膠粒內(nèi)的。3、凝膠色譜柱的裝填 在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量，以降低凝膠顆粒之間的 空 隙 。 在 裝 填 凝 膠 柱 時 ， 不 得 有 氣 泡 存 在 。 氣 泡會，降低。在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液 ，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。4、蛋白質(zhì)的分離 在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶 地移動，說明色譜柱制作成功。【教材答案】（一）旁欄思考題你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？答：凝膠實際上是一些

7、微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，影響分離的效果。（二）練習(xí)1答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多

8、孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當(dāng)一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時，各分子在色譜柱內(nèi)進行兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動。相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程，移動速 度；相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程，移動速度。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。2答：在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液 ph 發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液

9、叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由 12 緩沖劑溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同 ph 范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的 ph 不變。在生物體內(nèi)進行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的 ph 下進行的，受到氫離子濃度的嚴格調(diào)控。為了在實驗室條件下，就必須。3答：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的 ph 下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷的電極方向移動。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電以及分子本身、等性質(zhì)的差異，使帶電分子

10、產(chǎn)生的遷移速度，從而達到對樣品進行、或的目的。4. 答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。l 首先通過、等操作收集到血紅蛋白溶液， 即樣品的處理；l 再經(jīng)過去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；l 然后通過將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；l 最后經(jīng)進行純度鑒定。5. 答：血紅蛋白是蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作?！啊薄啊盿t the end, xiao bian gives you a passage. minand once said, peo

11、ple who learn to learn are very happy people. in every wonderful life, learning is an eternal theme. as a professional clerical and teaching position, i understand the importance of continuous learning, life is diligent, nothing can be gained, only continuous learning can achieve better self. only by constantly learning and mastering the latest relevant knowledge, can employees from all walks of life keep up with the pace of enterprise development and in