CLONTECH酵母雙雜中文版Word版

1、傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！目錄（一） 介紹4（二） 試劑盒物品清單 7（三） 額外附加物品列表9（四） 酵母菌株11（五） 酵母載體14（六） 方法簡述：單雜交文庫的構(gòu)建和篩選16方法簡述：雙雜交文庫的構(gòu)建和篩選17（七） 構(gòu)建用于酵母單雜交的報(bào)告質(zhì)粒載體18（八） 構(gòu)建用于酵母雙雜交的DNA-BD融合載體19（九） 構(gòu)建生成cDNA文庫21（十） 構(gòu)建和篩選酵母單雜交和雙雜交文庫（簡述）27（十一） 酵母單雜交文庫的構(gòu)建和篩選28（十二） 酵母雙雜交文庫的構(gòu)建和篩選30方法A:通過酵母配對（Yeast Mating）來篩選目的蛋白30方法B:通過共轉(zhuǎn)化的方法篩選目

2、的蛋白35（十三） 分析陽性相互作用結(jié)果38（十四） 問題解決指南44（十五） 參考文獻(xiàn)47（十六） 相關(guān)產(chǎn)品50 附錄A: 雙鏈 cDNA合成的典型結(jié)果51附錄B: 酵母感受態(tài)的制備LiAc 法52附錄C： 單雜交對照載體信息53附錄D： 雙雜對照載體信息54表格列表 Table I BD Matchmaker酵母菌株的基因型11Table II BD Matchmaker酵母菌株的表型11Table III單雜交系統(tǒng)的載體14Table IV 雙雜交系統(tǒng)的載體15Table V 各BD-Matchmaker DNA-BD 載體的比較19Table VI RNA起始濃度和PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間

3、的關(guān)系24Table VII單雜交共轉(zhuǎn)化的對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置29Table VIII單雜共轉(zhuǎn)化對照實(shí)驗(yàn)：期望的結(jié)果29Table IX 雙雜交轉(zhuǎn)化的對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置33Table X 雙雜交配對篩選的對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置Table XI 雙雜交共轉(zhuǎn)化的對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置Table XII 雙雜交共轉(zhuǎn)化的對照實(shí)驗(yàn)：期望的結(jié)果Table XIII 用于PCR篩選菌落的Assembling Master Mixs傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！圖片列表Figure 1使用BD Matchmaker單雜交系統(tǒng)篩選蛋白-DNA相互作用4 Figure 2使用BD Matchmaker單雜交系統(tǒng)篩選

4、蛋白-蛋白相互作用 4Figure 3酵母單雜交和雙雜交篩選的大致步驟5Figure 4構(gòu)建和篩選BD Matchmaker酵母單雜交和雙雜交文庫6Figure 5酵母菌株AH109和Y187中的報(bào)告基因12Figure 6BD Matchmaker酵母單雜交文庫的構(gòu)建和篩選16Figure 7BD Matchmaker酵母雙雜交文庫的構(gòu)建和篩選17Figure 8用BD SMART技術(shù)合成高質(zhì)量的ds cDNA21Figure 9BD CHROMA SPIN純化柱和收集管26Figure 10通過酵母重整合作用來構(gòu)建AD融合文庫27Figure 11為雙雜交篩選AD融合文庫32Figure

5、12分析和證明可能的單雜交和雙雜交相互作用陽性結(jié)果的策略39Figure 13通過酵母配對來驗(yàn)證蛋白-蛋白相互作用42Figure 14用對照用人胎盤Poly A+ RNA合成雙鏈cDNA51Figure 15p53HIS對照載體的圖譜53Figure 16pGAD-Rec2-53 AD對照載體的圖譜53Figure 17pGADT7-RecT AD對照載體的圖譜54Figure 18pGBKT7-53 DNA-BD 對照載體圖譜54Figure 19pGBKT7-Lam DNA-BD 對照載體圖譜55傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除?。ㄒ唬?介紹BD Matchmaker

6、TM Library Construction & Screening試劑盒提供一種簡便的方法構(gòu)建cDNA文庫用來進(jìn)行酵母雙雜交和單雜交的篩選，這些試劑盒結(jié)合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技術(shù)，只需要用任何組織的1 g poly A+ RNA 或total RNA就能構(gòu)建cDNA文庫。 通過一般細(xì)胞內(nèi)克隆步驟，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的靈敏的轉(zhuǎn)錄方法所構(gòu)建的文庫來進(jìn)行單雜交或雙雜交實(shí)驗(yàn)。單雜交實(shí)驗(yàn)的原理蛋白-DNA相互作用實(shí)驗(yàn)單雜交實(shí)驗(yàn)使你能夠確定和描述蛋白與目的順式DNA激活序列的綁定

7、，該序列可能是處于最小限度的啟動(dòng)子上游的用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的元件。這個(gè)實(shí)驗(yàn)也可以用于預(yù)測或新蛋白的DNA綁定結(jié)構(gòu)域的確定。通過BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的獲得這些基因表達(dá)的蛋白在BD Matchmaker One-Hybrid實(shí)驗(yàn)中，潛在的DNA綁定蛋白基因是與克隆在pGADT7-Rec2（為單雜交設(shè)計(jì)的低拷貝載體）上GAL4激活結(jié)構(gòu)域（AD）序列一起融合表達(dá)的。一個(gè)或多個(gè)目的DNA序列的串聯(lián)拷貝被構(gòu)建在pHIS2（含有HIS3營養(yǎng)缺陷報(bào)告基因的報(bào)告載體）。DNA綁定蛋白和目標(biāo)序列的相互作用會(huì)激活HIS3的轉(zhuǎn)錄（Figure 1），該過程要在宿主菌株Y

8、187（組氨酸缺陷型）中進(jìn)行并在缺少組氨酸的培養(yǎng)基生長雙雜交實(shí)驗(yàn)的原理蛋白-蛋白相互作用的原理雙雜實(shí)驗(yàn)分析能用于鑒定新的蛋白與蛋白相互作用、確定疑似作用、明確結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)BD Matchmaker雙雜交實(shí)驗(yàn)分析中，誘餌基因是與GAL4 DNA（DNA-BD）綁定結(jié)構(gòu)域序列融合表達(dá)的，同時(shí)其他的基因或其cDNA與GAL4激活域（AD）序列融合表達(dá)（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。當(dāng)誘餌與文庫融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）這樣的報(bào)告菌株中相互作用， DNA-BD和 AD相接近結(jié)合，并激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄（Figu

9、re 2) DNA-BD 和AD的融合序列是將cDNA序列克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pGBKT7 和pGADT7-Rec載體中來實(shí)現(xiàn)的。pGBKT7表達(dá)了與GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而 pGADT7-Rec表達(dá)與GAL4 AD相融合的蛋白。在酵母中，兩種融合基因在組成型啟動(dòng)子PADH1下高水平表達(dá)的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆載體與這個(gè)試劑盒也相兼容的。pBridge載體能被用于鑒定三蛋白復(fù)合體的酵母三雜交實(shí)驗(yàn)。單雜交和雙雜交實(shí)驗(yàn)分析的生物學(xué)基礎(chǔ)單雜交和雙雜交方法是基于許多真核轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)是復(fù)合組成的，它們的轉(zhuǎn)錄激活和DNA綁第結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上

10、和功能上是分開的。這使研究者可以構(gòu)建各種融合基因，當(dāng)在酵母中表達(dá)時(shí)，能同時(shí)結(jié)合到目標(biāo)DNA序列并激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄（Figure1 和Figure2），BD Matchmaker systems使用的GAL4的轉(zhuǎn)錄激活域與DNA綁定域是被完全闡述的的轉(zhuǎn)錄因子（Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.）傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！雙雜和單雜文庫的建立和篩選雙雜和單雜文庫的建立和篩選由四個(gè)主要步驟組成，（注：有兩個(gè)步驟遵從同樣的流程）。如果想去篩選雙雜交相互作用，第一步是建立一種DNA-BD融合載體。第二步是使用試劑盒所提供BD SMART試劑從你

11、所抽提poly A 和total RNA建立cDNA文庫。 就酵母雙雜篩選而言，如果你打算我們從預(yù)制的BD Matchmaker cDNA文庫選取來替代自己準(zhǔn)備文庫，可以跳過RNA分離、cDNA合成、AD融合文庫構(gòu)建。這些包含非常廣泛組織的文庫被有效的保存在甘油中或預(yù)轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母菌株。我們也提供一種BD Matchmaker文庫服務(wù)，基于這個(gè)服務(wù)，提供給我們你想篩選的組織與細(xì)胞，我們?yōu)槟阒谱鰽D融合文庫。請注意，我們盡管在高拷貝酵母表達(dá)載體中建立了很多的預(yù)制和預(yù)轉(zhuǎn)化的BD Matchmaker cDNA文庫，對雙雜工作非常理想的，但他們很少適合單雜分析。在單雜分析中我們推薦使用pGADT

12、7-Rec2 and pHIS2等低拷貝載體，因?yàn)樗麄儺a(chǎn)生較少的假陽性克隆。 其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BD Matchmaker AD克隆載體中建立一個(gè)GAL4 AD融合文庫，如果是建立雙雜文庫是pGADT7-Rec載體，單雜則是pGADT7-Rec2載體?？寺≡诩?xì)胞內(nèi)通過同源重組來進(jìn)行的，這一步利用酵母替內(nèi)高效重組系統(tǒng)使ds cDNA和相應(yīng)的GAL4 AD質(zhì)粒融合。采用重組介導(dǎo)的克隆，文庫的構(gòu)建和篩選能緊密的完成，而不需要任何的細(xì)菌轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增步驟。簡單的把cDNA文庫和相應(yīng)的BD Matchmaker載體轉(zhuǎn)化到酵母中，然后把細(xì)胞用于成分缺省培養(yǎng)基篩選雙雜作用。Figure 3.

13、酵母單雜和雙雜篩選的一般步驟，更加詳細(xì)單雜和雙雜篩選流程圖，請參考Figures 6 and 7.傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！Figure 4. BD MatchmakerTM 單雜和雙雜文庫篩選與構(gòu)建. 如這個(gè)圖表所示，As this diagram shows,重組介導(dǎo)克隆使文庫構(gòu)建和篩選更快捷高效，盡管這里沒有顯示，雙雜文庫能通過酵母融合篩選（細(xì)節(jié)參照Section XII）.BD SMARTTM 的cDNA合成和擴(kuò)增，請參照Section IX. pGADT7-Rec被用于雙雜文庫構(gòu)建和篩選而 pGADT7-Rec2被用于單雜文庫構(gòu)建和篩選。被pGADT7-R

14、ec2所顯示的兩個(gè)相關(guān)載體有不同復(fù)制元件。更多的信息請參照Section X 和相關(guān)的載體信息包.i傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除?。ǘ┰噭┖袃?nèi)試劑列表 此試劑盒包含有足夠試劑能制備5次單雜或5次雙雜文庫。 去離子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)補(bǔ)充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,、YPD Plus培養(yǎng)基在室溫下保存；.酵母菌株、對照Poly A +和BD SMART III Oligo保存在70C，其他試劑儲存在20C.下。 cDNA第一條鏈合成cDNA擴(kuò)增Trial Size BD Advantage TM PC

15、R 試劑盒cDNA 純化單雜交文庫構(gòu)建傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！雙雜交文庫構(gòu)建BD Yeastmaker 酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！（三）自備材料下列試劑自備，無其他特別要求所有的試劑與溶液均儲存與室溫下。cDNA第一條鏈合成l 無菌0.5ml離心管l Poly A+ or total RNAl 礦物油l 熱循環(huán)儀l DNA marker (1-kb DNA ladder)l 1.2% Agarose/EtBr gelcDNA的分離l 1.5ml無菌離心管l 帶有小架子環(huán)型支架l 95%乙醇（-20）l 1% 氯代二甲苯誘餌質(zhì)

16、粒構(gòu)建l E. coli感受態(tài)細(xì)胞。像DH5 or BD Fusion-Blue 感受態(tài)細(xì)胞l T4 DNA連接酶l 10X T4 連接bufferl LB/amp 平板l 50 mM NaCll 從E. coli轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒的試劑盒酵母轉(zhuǎn)化（在無菌容器中準(zhǔn)備試劑）l PEG/LiAc溶液l 1.1X TE/LiAc溶液l 二甲亞砜傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！酵母的培養(yǎng)與配對l YPD培養(yǎng)基(參照Yeast Protocols Handbook)l YPDA培養(yǎng)基（添加30 mg/L adenine hemisulfate，參照Yeast Protocols Ha

17、ndbook）l TE buffer或者無菌的蒸餾水l 適合轉(zhuǎn)化的無菌試管和燒瓶l 100-和150-培養(yǎng)平板l 無菌玻璃棒，用于撲板彎曲的吸管l X-Gal（用于酵母雙雜MEL1表達(dá)的藍(lán)白篩選）l 有agar的Minimal SD Base和沒有agar的Minimal SD Basel 3-AT（抑制SD缺省his培養(yǎng)基背景生長）l Kanamycin 儲存液（ 50 mg/ml ）保存于-20l Ampicillin 儲存液（ 50 mg/ml ）保存于-20 文庫長期保存l 100%甘油l YPD冷凍培養(yǎng)基（25%v/v甘油）酵母雙雜文庫的構(gòu)建與篩選BD Matchmaker Two-

18、Hybrid Library Construction & Screening Kit不提供下列缺省補(bǔ)充物。用戶必須自己從其他公司購買或者按照Yeast Protocols Handbook的附錄C的配比自己準(zhǔn)備。l Trp DO Supplementl His/Leu/Trp DO Supplementl His/Trp DO Supplementl Ade/Trp DO SupplementPCR 克隆篩選l BD Matchmaker GAL4 AD LD-Insert Screening Amplimer Set傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！IV酵母菌株酵母生長

19、和保藏的其它信息，請參考Yeast Protocols Handbook。我們也推薦Guthrie & Fink的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (1991)和Heslot & Gaillardin的Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts (1992)。A 基因型 TABLE I. BD MATCHMAKERTM酵母的基因型 aGAL1, GAL2和 MEL1 的上游激活序列（UASs）應(yīng)答于GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子。trp1,his3, gal4和 gal80的突變都被刪除

20、；leu2-3, 112是一個(gè)雙突變。b. AH109衍生于 PJ69-2A菌株，包括ADE2 、HIS3營養(yǎng)標(biāo)記和一個(gè)內(nèi)源的MEL1基因(James et al., 1996)。lacZ 報(bào)告基因被引入PJ69-2A 而得到AH109菌株。B.表現(xiàn)型驗(yàn)證AH109 和Y187表現(xiàn)型是很重要的(Table II)。1. 復(fù)蘇凍存的菌株，用無菌環(huán)或者牙簽挑少量的細(xì)胞劃到Y(jié)PDA平板上。2. 30C溫育平板3到5天直到克隆出現(xiàn)，從這個(gè)工作平板上分離克隆增殖其他的平板。3. 按照Table II測試營養(yǎng)需求a. 用無菌環(huán)或者牙簽，從工作平板上劃3-4個(gè)克隆帶單個(gè)合適的SD選擇平板上。b. 30C溫育

21、平板3到6天。酵母在SD選擇培養(yǎng)基生長比YPDA培養(yǎng)基上要慢一些。c. 參照Table II比對你的結(jié)果，只有AH109 和Y181是期望的表現(xiàn)型才繼續(xù)進(jìn)行。4. 進(jìn)行菌株融合或準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞的液體培養(yǎng)，要使用已分離好經(jīng)過驗(yàn)證工作平板克隆，用保鮮膜密封好經(jīng)過表型驗(yàn)證的工作平板，包藏在4C。TABLE II .BD MATCHMAKER酵母菌株的表型注： l 如果TRP1 和LEU2功能基因被導(dǎo)入，AH109 和Y187能夠在SD/Leu/Trp上生長。l 如果AH109攜帶ADE2 and HIS3基因被激活，AH109 and AH109/Y187 二倍體能在SD/Ade/His生長。(i.

22、e., in the presence of GAL4).傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！C可配對的菌株Y187 (MAT)能夠與AH109, HF7c, CG-1945, Y190或 SFY526 (all MATa)相融合。D. 克隆的顏色和大小l Y187攜帶的ade2-101突變和AH109在缺乏GAL4顯示Ade-表型。在低含量的ade 培養(yǎng)基上，克隆在幾天后將變成粉紅色，并在克隆老化后可能變暗。在補(bǔ)充Ade的培養(yǎng)基上生長時(shí)，顏色變化不顯著。這些克隆生長到直徑2 mm。由于自發(fā)缺失線粒體功能的突變，會(huì)形成12%小的白色克隆。溫育培養(yǎng)時(shí)要避免這些白色克隆。l 總體

23、上Y187比AH109生長慢并形成明顯較小的克隆。E.報(bào)告基因 AH109包含四個(gè)在三個(gè)遠(yuǎn)距離GAL4上游調(diào)空序列(UASs)和TATA boxes調(diào)控下的ADE2, HIS3, MEL1和 lacZ四個(gè)報(bào)告基因(Figure 5)。ADE2報(bào)告基因針對ADE2 and HIS3，單獨(dú)提供強(qiáng)的高嚴(yán)緊度的營養(yǎng)選擇，減少假陽性率(James et al., 1996)。你也可以選擇分析編碼-galactosidase的MEL1。由于-galactosidase是一種內(nèi)分泌酶，MEL1對于Y187和 AH109兩者是內(nèi)源性的，可以通過添加X-Ga到選擇平板來檢測他的的活性，如果X-Gal存在，MEL

24、1被激活，克隆將變成蘭色。由于在完整的GAL1 UAS調(diào)控下，在陽性的雙雜分析中Y187的lacZ表現(xiàn)出高水平的誘導(dǎo)-galactosidase活性。Figure 5. 酵母菌株AH109 和Y187中的報(bào)告基因。AH109是由PJ69-2A派生而來，包括了ADE2和HIS3兩個(gè)營養(yǎng)合成基因（James et al., 1996）。MEL1是GAL4的內(nèi)源效應(yīng)基因。lacZ報(bào)告基因被引入PJ69-2A而建成AH109。HIS3，ADE2 和MEL1/lacZ報(bào)告基因都在不完全的GAL4效應(yīng)序列和啟動(dòng)子元件GAL1，GAL2，MEL1的分別控制下傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去

25、除！F. 缺失HIS3的表達(dá)l 3-AT是酵母HIS3蛋白的競爭性抑制劑。它被用于在缺省方式下阻止低水平的His3p的表達(dá)，抑制缺省his SD培養(yǎng)基的北京生長。l 由于誘餌蛋白內(nèi)在的dna結(jié)合特性，源于AH109的轉(zhuǎn)化子可能表現(xiàn)出稍高HIS3表達(dá)。通常少量3-AT足以抑制SD/His上的背景生長。然而，如果你的選擇是針對his3和 ade2兩者共同表達(dá)的，在初始文庫篩選中沒有必要去抑制缺省的HIS3。l 某些酵母菌株有相對較高本底水平的His3p，如果你使用Y190作為宿主菌，在培養(yǎng)基中需要2545 mM 3-AT去抑制背景生長。l 在你的選擇培養(yǎng)基中優(yōu)化3-AT的濃度在你開始這個(gè)步驟以前，

26、注意這個(gè)試劑盒不提供His/Trp缺省補(bǔ)充物，你必須自己單獨(dú)購買或者按照Yeast Protocols Handbook的目錄c的配比自己準(zhǔn)備。1. 鋪酵母轉(zhuǎn)化子于一系列的不同3-AT濃度的SD/His/Trp平板上。l 如果你采用是包含有像pGBKT7這樣 DNA-BD質(zhì)粒的AH109轉(zhuǎn)化子，我們推薦你從0 到15 mM之間開始測試3-AT的濃度（0,2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 mM）l 如果你是采用包含有pHIS2報(bào)告質(zhì)粒Y187轉(zhuǎn)化子，我推薦你從10 到60 mM之間測試3-AT的濃度。注：這些僅僅是推薦，優(yōu)化濃度的高低主要依賴于使用的構(gòu)件和菌株。2. 使用低濃度

27、的3-AT，一周后，僅允許小的克隆去生長。培養(yǎng)基中太多的3-AT能 新的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除?。ㄎ澹?酵母載體A單雜交系統(tǒng)1、克隆載體l 信號載體pHIS2：cis-acting DNA片段插在HIS3營養(yǎng)報(bào)告基因的上游多克隆位點(diǎn)（MCS）上，與HIS3基因（PminHIS3）啟動(dòng)子區(qū)相鏈接。在信號載體上還有一段高度保守的低拷貝的CEN6/ARS4序列。l 克隆載體pGADT7-Rec2: 表達(dá)一個(gè)與GAL4 激活結(jié)構(gòu)域(AD)相融合的蛋白，用于酵母中同源重組介導(dǎo)的克?。▓D4）。因此用戶可以用Sma1消化的pGADT7-Rec2（提供的）和ds cDN

28、A（BD SMART文庫構(gòu)建法得到的）（Section IX）通過酵母轉(zhuǎn)化構(gòu)建cDNA/AD融合文庫。 2、對照載體（附錄C）l 陽性對照載體p53HIS2：由DNA片段（包含至少3個(gè)連續(xù)拷貝的p53 cis-acting DNA序列）插在pHIS2載體的多克隆位點(diǎn)上構(gòu)成。插入片段在載體中HIS3基因（PminHIS3）及其啟動(dòng)子的上游。l 陽性對照載體pGAD-Rec2-53：編碼一個(gè)融合于GAL4 AD的鼠源p53蛋白。包含p53HIS2和pGAD-Rec2-53的酵母細(xì)胞可以在缺組氨酸的SD培養(yǎng)基（如SD/His/Leu/Trp）上生長。a、HA是血凝素，這些免疫標(biāo)記用于通過體外的免疫共

29、沉淀來鑒定蛋白與蛋白相互作用，使用的抗體和實(shí)驗(yàn)方案由BD Matchmaker Co-IP 試劑盒提供。它們不適用于檢測、親合純化和酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的免疫共沉淀。b、通過SV40 Large T PCR Fragment和 pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)同源重組產(chǎn)生的。c、DNA-BD 和AD載體有不同的營養(yǎng)標(biāo)記，酵母轉(zhuǎn)化子被涂布在缺少特定成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基他們可以被單獨(dú)地篩選出來。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！ B雙雜交系統(tǒng)2. 克隆載體l pGBKT7：被用于表達(dá)一種與GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)(DNA-BD域融合的蛋白。l pGADT7-Rec：被用于表達(dá)一種與GA

30、L4 激活結(jié)構(gòu)域(AD)融合的蛋白。這個(gè)載體被設(shè)計(jì)成針對同源重組介導(dǎo)的克隆。提供的pGADT7-Rec是被Sma I消化的線形DNA。3. 對照載體a. 陽性對照l pGBKT7-53編碼一種GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白。l SV40 Large T PCR Fragment編碼SV40 large T-antigen。一起使用這個(gè)DNA片段和pGADT7-Rec去檢測酵母轉(zhuǎn)化重組的效率。SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec重組形成pGADT7-RecT，它編碼GAL4 AD 和large T-antigen的融合蛋白。l p53和 SV40

31、 large T-antigen在酵母雙雜分析中相互作用b. 陰性對照l pGBKT7-Lam編碼一種GAL4 DNA-BD和人類lamin C融合基因，提供一個(gè)對照，針對一種不相關(guān)的蛋白和pGADT7-RecT 和你的AD/library的質(zhì)粒兩者之一的意外作用。Lamin C既不形成復(fù)合體也不于大多數(shù)蛋白相互作用。TABLE IV. 雙雜系統(tǒng)的載體a. HA是血凝素，這些免疫標(biāo)記被用于通過體外的免疫共沉淀來鑒定蛋白與蛋白相互作用，使用的抗體和實(shí)驗(yàn)方案由BD Matchmaker Co-IP Kit 提供。它們無意被用于去檢測、親合純化或者酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白的免疫共沉淀。b. 通過SV40 L

32、arge T PCR Fragment和 pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)同源重組產(chǎn)生的。c. DNA-BD 和AD載體有不同的營養(yǎng)標(biāo)記，當(dāng)酵母轉(zhuǎn)化子被撲到缺少特定成分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基他們可以被單獨(dú)的選擇。d. 載體可以攜帶不同的抗生素標(biāo)記因此可以在E. coli.中單獨(dú)選擇。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除?。?酵母雙雜交文庫構(gòu)建與篩選傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除?。ㄆ撸┙湍鸽p雜交文庫的構(gòu)建和篩選傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！VII、構(gòu)建酵母單雜實(shí)驗(yàn)的信號載體A、背景 如果用BD Matchmaker單雜體系從cDNA庫中

33、篩選DNA-結(jié)合蛋白，必須先確定一個(gè)正確的或預(yù)測的靶元件。比如，敲除和點(diǎn)突變分析必須非常精確的運(yùn)用。所構(gòu)建的含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的連續(xù)靶調(diào)控元件，其邊界包含限制性酶切位點(diǎn)，重組入pHIS2的多克隆位點(diǎn)（MCS）。這就使得靶元件和HIS3信號基因聯(lián)系到一起。插入靶元件后可能會(huì)影響HIS3表達(dá)的強(qiáng)度。因此，在做單雜實(shí)驗(yàn)前，要先檢測一下構(gòu)建的載體是否會(huì)減弱HIS3的表達(dá)。背景克隆的生長是由于HIS3的表達(dá)遺漏造成的，這可以通過在選擇培養(yǎng)基中添加3-AT來控制，在第IV、F部分有詳述。B、靶元件的合成 每個(gè)靶-信號載體的構(gòu)建都應(yīng)在報(bào)告基因上游插入包含至少DNA靶元件的一個(gè)拷貝。早期的許多研究都提出，信號

34、蛋白應(yīng)包含至少3個(gè)連續(xù)拷貝的DNA靶元件。然而，Wei et al. (1999)證實(shí)了在許多情況下，單拷貝就已經(jīng)足夠了。關(guān)于靶元件數(shù)量問題可以參見Ghosh et al., 1993。連續(xù)的拷貝可通過多種方法制備，我們發(fā)現(xiàn)的最便捷、可靠的方法是寡核苷酸合成法。該方法之所以受歡迎是因?yàn)閷τ?0 bp長度的調(diào)控元件該方法都很有效。1、設(shè)計(jì)兩條反向平行核苷酸鏈，一條為正義鏈，另一條為反義互補(bǔ)鏈。注：正義鏈應(yīng)包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的靶元件和兩端不同的酶切位點(diǎn)。當(dāng)兩鏈退火時(shí)，雙鏈DNA會(huì)在每個(gè)末端有不同的突出來定向連入pHIS2。設(shè)計(jì)載體時(shí)參照pHIS2載體的多克隆位點(diǎn)信息（PT3705-5）。2、合成不

35、含5 磷酸鹽的雙鏈（參照合成方法）。C、將靶DNA插入pHIS2的多克隆位點(diǎn)1、正反義鏈核苷酸各0.1g在10l 50mM NaCl中混勻2、核苷酸置于70 5min退火，慢慢冷卻至室溫（30min）3、20l體系完全酶切0.1g pHIS2。37 2hr或者按生產(chǎn)商的指導(dǎo)。4、取2l樣品進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定質(zhì)粒是否完全線性化。5、將5l酶切后的質(zhì)粒、1l退火后的寡核苷酸和4l水混勻。6、加入1.2l 10T4連接酶buffer和0.8l（至少0.8units）T4 DNA連接酶，置于室溫4hr。注：寡核苷酸和載體的摩爾分子量為比100：1或者更大，無需通過膠回收來出除小片段。7、用

36、標(biāo)準(zhǔn)方法，每個(gè)構(gòu)建的載體各自轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Sambrook et al., 1989）。我們推薦用DH5或者BD Fusion-BlueTM 提供的感受態(tài)細(xì)胞。8、涂布在LB/Kan平板上，過夜。、用任意標(biāo)準(zhǔn)方法制備純凈的DNA（Sambrook et al., 1989）。通過用瓊脂糖凝膠電泳和測序來鑒定靶片段插入是否正確。、鑒定靶信號載體的HIS3背景表達(dá)、靶信號載體用小規(guī)模方法轉(zhuǎn)化Y187（參見第XI、C部分）、按第IV、F部分的方法來決定優(yōu)化選擇性培養(yǎng)基中-AT的濃度。比如，我們發(fā)現(xiàn)mM -AT 就足夠抑制Y細(xì)胞轉(zhuǎn)化p53HIS2對照實(shí)驗(yàn)的背景生長了。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您

37、有幫助，可雙擊去除！VIII、為雙雜分析建立一個(gè)與DNA-BD融合的載體 A. 建立一個(gè)DNA-BD融合基因l 如果相同的酶切位點(diǎn)在測試基因和相應(yīng)的載體都存在，你可以建立一個(gè)GAL4 DNA-BD融合基因。如果不，你可以通過PCR擴(kuò)增基因片段，使用的引物帶有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，通過合并期望的突變PCR引物，一個(gè)在基因末端酶切位點(diǎn)可以被改變成不同的位點(diǎn)或者加入到不同的閱讀框。另外，如果你已經(jīng)把一個(gè)基因克隆到BD Creator Donor Vector中，使用Cre recombinase把你的基因轉(zhuǎn)到pLP-GBKT7中。參考BD Creator DNA Cloning Kits User Man

38、ual。l 更多關(guān)于克隆的具體信息，請參照Sambrook et al. (1989)TABLE V. BD MATCHMAKERTMDNA-BD載體的比較a. 包含兩個(gè)檢測三蛋白復(fù)合體的遠(yuǎn)距離表達(dá)框。b. 在以前BD Matchmaker Two-Hybrid Systems使用的DNA-BD載體。c. BD Creator Acceptor Vector (LP = loxP). 從任何BD Creator Donor Vector接受基因，作為GAL4 DNA-BD融合蛋白表達(dá)它。1. 純化基因片段。（我們推薦使用NucleoSpin Extraction Kit (#K3051-1,

39、-2)快速純化DNA片段）。2. 用合適的內(nèi)切酶消化DNA-BD載體，進(jìn)行磷酸化和醇化處理3. 連接相應(yīng)的載體和插入片段，轉(zhuǎn)化連接混合物到E. coli。4. 用酶切分析或PCR來鑒定被插入的質(zhì)粒B. 檢測DNA-BD融合基因的轉(zhuǎn)錄激活1. 使用少量轉(zhuǎn)化方案（Section XII.A.7），使AH109 和Y187轉(zhuǎn)化雜交。撲轉(zhuǎn)化子在下列平板上：l SD/Trp/X-Gall SD/His/Trp/X-Gall SD/Ade/Trp/X-Gal 包括一個(gè)假陽性對照，例如利用空載的DNA-BD載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 注：BD Matchmaker Library Construction & Scre

40、ening Kit (#K1615-1)不提供制作這些培養(yǎng)基所要求的卻省培養(yǎng)物。你必須自己單獨(dú)購買或者按照Yeast Protocols Handbook的目錄c的配比自己準(zhǔn)備。2. 結(jié)果分析l 誘餌蛋白不被激活，如果轉(zhuǎn)化子克隆是白色的并不能在SD/His/Trp 或者SD/Ade/Trp上生長，繼續(xù)5-6步。l 誘餌蛋白沒有激活，如果轉(zhuǎn)化子克隆是蘭色的，并能SD/His/Trp 或者SD/Ade/Tr傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！p生長，用3-4步驟繼續(xù)。4. 如果誘餌菌株在缺少His的培養(yǎng)基顯示背景生長，在你可以通過添加3-AT到選擇培養(yǎng)基（Section IV.F

41、）。也可以使用Ade/His/Leu/Trp培養(yǎng)基篩選文庫。5. 如果一個(gè)誘餌菌株在缺少Ade和His的培養(yǎng)基上顯示背景生長，很難在雙雜篩選中使用這個(gè)誘餌蛋白。請參照故障處理指導(dǎo)。6. 如果就你的誘餌蛋白而言已知蛋白可用，用他去核對用這個(gè)特別DNA-BD/bait fusion雙雜相互作用的是否 有可檢測性。7. 蛋白表達(dá)的鑒定l 用轉(zhuǎn)化的菌液做Western印記，用GAL4 DNA-BD的抗體做印記探針。使用沒有轉(zhuǎn)化的酵母菌液做對照。注：使用多克隆抗體可能導(dǎo)致多重交叉反映帶；pGBT9 和pBridge的表達(dá)水平太低不允許使用GAL4 DNA-BD單克隆抗體檢測。C. 測試DNA-BD融合蛋

42、白的毒性l 對比轉(zhuǎn)化空載DNA-BD載體和DNA-BD/誘餌質(zhì)粒的液體培養(yǎng)Y187細(xì)胞的生長率，如果誘餌菌株生長明顯減慢，你的DNA-BD/誘餌質(zhì)粒可能有毒。l 使用少量酵母轉(zhuǎn)化方案去準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化子。在SD/Trp上選擇轉(zhuǎn)化子，如下方案貯備過夜培養(yǎng)：1. 用50 ml SD/Trp/Kan (20 g/ml)溫育一個(gè)大的克?。?-3mm）2. 30C，250270 rpm 搖晃，過夜培養(yǎng)(1624 hr)。3. 檢測培養(yǎng)物OD600。它應(yīng)該0.8，如果OD600遠(yuǎn)小于0.8/，DNA-BD融合蛋白可能有毒。如果融合基因不阻止酵母的生長，她是無毒的，你可以計(jì)劃用酵母融合去篩選你的雙雜文庫，用步驟4-

43、7繼續(xù)。如果你打算用共轉(zhuǎn)化去篩選，你可以停在這里并采用Section IX。4. 離心600 x g，5分鐘。5. 棄上清6. 在5 ml SD/Trp液體培養(yǎng)基重新懸浮，用計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞密度應(yīng)該1 x 10 cells/ml.7. 融合這些誘餌菌株和你的AD融合文庫的宿主菌(Section XII.A.4)。 注：Y187 (MAT)能與AH109, HF7c, CG-1945, Y190, or SFY526 (MATa)菌株融合。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除?。ň牛┙⒁粋€(gè)cDNA文庫A. 用BD SMART技術(shù)建立一個(gè)cDNA文庫使用BD SMART技術(shù)

44、mrna的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能被有效的復(fù)制成ds cDNA，由于它可以保持序列的完整性同時(shí)可以高通量產(chǎn)生cDNA，非常適合單雜和雙雜文庫的構(gòu)建.通過保持器官組織的復(fù)雜性，BD SMART步驟可以提供你檢測稀有的和潛在的未知相互作用良好機(jī)會(huì)，在酵母單雜和雙雜篩選過程中。B. BD SMART cDNA 合成與擴(kuò)增是如何進(jìn)行的 在首鏈cDNA合成步驟中，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶用于把RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA.就cDNA合成的引物RNA，你即可以使用被修正的oligo(dT)引物（CDS III Primer）也可以使用隨機(jī)引物(CDS III/6 Primer). 得到的cDNA文庫的復(fù)雜性可能不同，主要依賴于你選擇哪

45、種引物.如果你使用CDS III引物，它雜交到poly A RNA的3末端，在接近5的反轉(zhuǎn)錄序有稍低的保真性.如果你使用CDS III/6引物替代，隨機(jī)引物可以能雜交到RNA摸板序列的不同部位，你的文庫應(yīng)該包括很多不同5- 和3-端的序列，他們可能被均等的表達(dá)。 MMLV RT遇到摸板的5末端時(shí)候，酶的末端轉(zhuǎn)移活性就回增加一些額外的核酸到cDNA的3末端，主要是脫氧胞啶。那么具有oligo(G)序列3末端的BD SMART III寡核苷與脫氧胞啶骨架配對，產(chǎn)生一個(gè)延伸摸板。此時(shí)RT轉(zhuǎn)換摸板繼續(xù)復(fù)制到核苷酸的末端。在大部分的合成中，生成的ss cDNA包含有完整的可以與BD SMART III

46、Oligo互補(bǔ)mrna 5末端，它可以后續(xù)擴(kuò)增作為長距離PCR的通用引物，僅這些具有BD SMART 5 末端錨定序列的ss cDNAs可以做為摸板，被LD PCR呈指數(shù)級擴(kuò)增。 在第二步中，ss cDNA被LD PCR擴(kuò)增產(chǎn)生ds cDNA庫。Library Construction &Screening Kits 包括一個(gè)免費(fèi)試用包裝BD Advantage(TM)2 PCR Kit，因而你可以產(chǎn)生和擴(kuò)增ds cDNA。BD Advantage 2 Polymerase Mix包括有：BD TITANIUM(TM) Taq DNA Polymerase（沒有n末端檢測能力的Taq DNA

47、polymerase），適用于hot-start PCR的BD TaqStart(TM) Antibody，少量的具有校正能力的聚合酶。這個(gè)酶可以允許你比普通的PCR更高的保真度來擴(kuò)增cDNA（大約20 kb） Figure 8使用BD SMART(TM) 技術(shù)高質(zhì)量ds cDNA的合成傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！C. 良好的實(shí)驗(yàn)室操作l 帶手套保護(hù)你的RNA 、cDNA摸板免于被核酸酶降解l 在懸浮液體或者混合反應(yīng)物時(shí)，輕輕上下吸打液體或者輕敲打試管底部。簡短的把液體甩到試管底部。在懸浮試劑時(shí)不要渦旋震蕩樣品；渦旋震蕩可能震短你的cDNA.。l 所有的操作在冰上進(jìn)行

48、，除非有其他提示。l 最后加酶到反應(yīng)混合液中，一定確定通過輕輕的上下戲打混合液試使酶完全混合到反應(yīng)混合物中。l 不要增加任何反應(yīng)的體積，所有的組分都是為這個(gè)特定體積優(yōu)化的。l EB是致癌物，在操作與處理這些試劑小心使用。對于其他信息，參照sambrook et al。BondEx Ethidium Bromide Detoxification Cartridges 可以從BD Biosciences Clontech獲得。l 苯酚也是常備的，處理含有這個(gè)試劑的溶液時(shí)，一直帶手套穿防護(hù)服。如果可以，在通風(fēng)櫥里處理含有苯酚或氯仿。l 準(zhǔn)備你的反映時(shí)，使用提供的去離子水，其他的，使用新鮮的不經(jīng)DEP

49、C處理去離子水。避免使用蒸餾水，因?yàn)槟承┱麴s器的循環(huán)蒸汽可能會(huì)導(dǎo)入妨礙PCR的污染物。l 用0.5 N NaOH 清洗所有的玻璃制品，在用去離子水沖洗，然后在烘箱160180C烘烤4-9小時(shí)。l 處理RNA時(shí)，使用一次性的塑料移液管和槍頭。D、RNA的分離l 對于total RNA和poly A RNA的分離，很多方法是有效的。BD Biosciences Clontech提供幾個(gè)試劑盒用于total RNA的分離和后續(xù)poly A RNA的分離。l 100 ng或者25 ng poly A RNA 是cDNA合成最少的起始材料，一般來講，你開始有的RNA越多，擴(kuò)增要求的pcr循環(huán)數(shù)越少。更少

50、的熱循環(huán)數(shù)可能更少產(chǎn)生非特異性pcr產(chǎn)物。對于優(yōu)化cDNA和文庫的質(zhì)量是非常好的。此時(shí)，如果你的RNA樣本不受限制，請按照表格使用高啟動(dòng)量的RNA。E. RNA Analysisl 合成的ds cDNA序列完整性、最終的構(gòu)建的cDNA完整性都依賴于實(shí)驗(yàn)起始RNA的質(zhì)量。因此，在第一條合成你使用rna之前，我們推薦，你在變性凝膠上檢測一個(gè)樣本的RNA，來評估她的完整性。哺乳動(dòng)物來源的Total RNA因該在4.5 和1.9 kb位置上出現(xiàn)兩個(gè)亮帶（28S 和18S 核糖體RNA），28S 和18S rRNA帶強(qiáng)度比列應(yīng)在1.52.5:1。完整的哺乳動(dòng)物poly A RNA也應(yīng)出現(xiàn)弱28S and

51、 18S rRNA的smear帶，在大小分布上應(yīng)該比非哺乳動(dòng)物小。l 如果，28S RNA 對18S RNA（對total RNA）強(qiáng)度比列少于1:1或者你實(shí)驗(yàn)用的poly A RNA明顯的比預(yù)期少。我們建議我們建議你準(zhǔn)備新的ran在核對了針對RNase和其他雜質(zhì)的RNase純化試劑后，如果問題在出現(xiàn)，你需要尋找其他來源的組織和細(xì)胞。l 我們建議你用Human Placenta Poly A RNA作為cDNA合成的陽性對照，這個(gè)對照讓你鑒定所有的組分正常工作并讓你從你的RNA樣本合成的ds cDNA的大小和產(chǎn)量。l 在接下來的步驟中，你有選擇首鏈合成的引物，oligo(dT)或者隨機(jī)引物。反

52、應(yīng)條件變化依賴于與使用的引物。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！F.使用Oligo (dT)引物合成第一條鏈cDNA1. 加下列試劑到一個(gè)0.25ml離心管中2.混合各個(gè)成分并簡短混合3. 72C溫育2min4. 在冰上放置2min5. 簡短的離心6. 增加下列試劑到反應(yīng)試管中2.0 l 5X First-Strand Buffer1.0 l DTT (20 mM)1.0 l dNTP Mix (10 mM )1.0 l MMLV Reverse Transcriptase9.0 l Total volume 7. 輕輕敲打混合。簡短離心 8. 42C溫育10min 9.

53、加1.0 l BD SMART III Oligonucleotide 10.在空氣培養(yǎng)廂或者熱蓋熱循環(huán)中42C溫育一個(gè)小時(shí)。注：這種溫育你使用水浴或者非熱蓋熱循環(huán)，在你閉上管蓋前，加一滴礦物油覆蓋反應(yīng)混合物。這樣可以阻止因?yàn)檎舭l(fā)引起的水分流失。 11. 75C，10 min終止試管里的首鏈合成反應(yīng)。 12.在室溫下冷卻，然后加入1.0 l RNase H。 13. 37C溫育20min 14.如果你打算直接進(jìn)行LD-PCR步驟，從首鏈合成物取2-l液體并加入到一個(gè)干凈的、預(yù)冷的、0.5ml試管中，放置在冰上，進(jìn)行到Section H。如果你在首鏈合成中你使用礦物油，避開礦物油從試管底部取2-

54、l樣品。15.任何不使用的首鏈反應(yīng)物立即放到20C.下。首鏈合成cdna在20C保存三個(gè)月。G. 使用隨機(jī)引物合成首鏈cDNA1. 加下列試劑到一個(gè)0.25ml離心管中2. 混合各個(gè)組分，簡短離心。3. 72C 溫育2min4. 在冰上冷卻2min。傳播優(yōu)秀Word版文檔 ，希望對您有幫助，可雙擊去除！5. 簡短離心。6. 離心管放置在室溫下，加入下列組分：2.0 l 5X First-Strand Buffer1.0 l DTT (20 mM)1.0 l dNTP Mix (10 mM )1.0 l MMLV Reverse Transcriptase9.0 l Total volume 7

55、. 輕敲混勻，稍微離心 8. 在2530C的室溫下，溫育10min。 9. 42C溫育10min。10. 加入1.0 l BD SMART III Oligonucleotide.11. 在空氣培養(yǎng)箱或者熱蓋PCR儀上，42C溫育一個(gè)小時(shí)。注：這種溫育你使用水浴或者非熱蓋熱循環(huán)，在你閉上管蓋前，加一滴礦物油覆蓋反應(yīng)混合物。這樣可以阻止因?yàn)檎舭l(fā)引起的水分流失。12. 放置反應(yīng)試管75C、10min，終止首鏈合成。13.室溫下冷卻，在加1.0 l（3個(gè)單位）RNase H。14. 37C溫育20min。15. 如果你打算直接進(jìn)行LD-PCR步驟，從首鏈合成物取2-l液體并加入到一個(gè)干凈的、預(yù)冷的、0.5ml試管中，放置在冰上，進(jìn)行到Section H。如果你在首