抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法課件

1、抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,1,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,2,在抗腫瘤研究中，人們提出了腫瘤多步驟、DNA突變、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期核心機(jī)制、細(xì)胞周期啟動(dòng)及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與等許多理論和學(xué)說。 抗腫瘤藥的研究隨著理論的更新和技術(shù)的進(jìn)步，已從以核酸等為靶點(diǎn)的殺傷型細(xì)胞毒藥轉(zhuǎn)向?qū)δ[瘤新靶點(diǎn)的研究。包括化學(xué)預(yù)防藥、分化誘導(dǎo)劑、凋亡誘導(dǎo)劑、信號(hào)傳導(dǎo)阻滯劑、血管生成抑制劑、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑、生物調(diào)節(jié)劑以及化放療保護(hù)劑等。 隨著新型抗癌藥的研究，誕生了許多抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)方法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,3,第1節(jié) 腫瘤細(xì)胞體外篩選方法,一、抗腫瘤藥體外方法 動(dòng)物模型在抗腫瘤藥物的評(píng)價(jià)中起重要的作用，但動(dòng)物模型費(fèi)用高，

2、周期長(zhǎng)使其不適合大規(guī)模的抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)。因此抗腫瘤藥初步篩選首先應(yīng)采用腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)方法，既節(jié)約成本又節(jié)省時(shí)間,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,4,1.MTT法 【基本原理】活細(xì)胞線粒體中存在的脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）為藍(lán)紫色的甲臜；而死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm處酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度（OD值）。 OD值與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目，了解藥物抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,5,操作步驟】 （1）0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，5%10%NBS的RPMI 1640調(diào)細(xì)胞

3、濃度50000個(gè)/ml。96孔板100ul/孔。設(shè)溶劑對(duì)照，每組3-6平行孔。37，5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，棄上清。 （2）加藥物5個(gè)10倍稀釋的濃度（溶劑常用的有二甲亞砜和水)，通常為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （3）細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2472h，每孔加入10l 5mg/ml的MTT溶液（以無血清培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h。 （4）吸去上清。加入200l DMSO，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 （5）計(jì)算抑制率(%)=（對(duì)照OD-藥物OD）/對(duì)照OD*100,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,6,2.XTT法 【基本原理】XTT

4、 是MTT的衍生物，經(jīng)過活細(xì)胞代謝還原成水溶性的代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的量與活細(xì)胞的數(shù)目成正比，因此利用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)465nm處測(cè)定代謝物的OD值可以推測(cè)活細(xì)胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)處理方法同MTT法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,7,操作步驟】 （1）細(xì)胞接種，藥物處理均同MTT方法。 （2）藥物處理2472h后，每孔加50l XTT溶液（內(nèi)含50g XTT，5l 10mmol/L的電子偶聯(lián)劑 (PMS)）繼續(xù)培養(yǎng)4h。 （3）96孔培養(yǎng)板振蕩23min后，直接用酶標(biāo)儀在465nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,8,注意事項(xiàng)】 （1）優(yōu)點(diǎn)：XTT代謝產(chǎn)物溶解于水，不需要吸去上清就可測(cè)OD值，簡(jiǎn)單方便，減少誤差。

5、 （2）XTT不易被線粒體酶還原，因此同時(shí)加入電子偶聯(lián)劑 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高濃度的代謝產(chǎn)物抑制線粒體酶活性。 （4）XTT和PMS現(xiàn)用現(xiàn)配,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,9,3.染料排斥法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制 【基本原理】 活細(xì)胞有排斥染料（如伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑等染色的能力，而細(xì)胞死亡后由于膜完整性遭到破壞，細(xì)胞即被著色,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,10,操作步驟】 （1）25ml培養(yǎng)瓶中加入細(xì)胞4104個(gè)、受試藥40l，終體積4ml， （2）5%CO2，37培養(yǎng)4896h。 （3）取細(xì)胞懸液0.4ml，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)液0.1ml，在室溫作用5min，在15min內(nèi)，細(xì)胞

6、計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)約200個(gè)細(xì)胞中死細(xì)胞（藍(lán)色）的個(gè)數(shù)。 【結(jié)果評(píng)定】 （1）活細(xì)胞率%=（未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）100%。 （2）將活細(xì)胞率與藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，可得到S形劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算半數(shù)殺傷濃度（LC50）。 （3）當(dāng)LC5010g/ml并能重復(fù)時(shí)，提示藥物應(yīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,11,注意事項(xiàng)】 藥物殺傷細(xì)胞作用可能被低估原因： （1）存活細(xì)胞可能繼續(xù)繁殖，使活細(xì)胞率增高。 （2）死細(xì)胞可能過早地崩解，計(jì)數(shù)時(shí)已不存在，使死細(xì)胞率下降,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,12,4.集落形成法測(cè)定藥物對(duì)腫瘤克隆原細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 【基本原理】克隆原細(xì)胞指具有持續(xù)增殖能力的細(xì)胞。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞能連續(xù)分裂6

7、代或以上時(shí)，其后代所組成的群體（集落）含50個(gè)以上細(xì)胞。計(jì)數(shù)集落可以對(duì)克隆原細(xì)胞作定量分析。反映了單個(gè)細(xì)胞增殖潛力，能較靈敏地測(cè)定抗腫瘤藥物的活性，目前被認(rèn)為是一種較理想的檢測(cè)方法。 常用的集落形成方法可分為貼壁法及半固體培養(yǎng)基法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,13,操作步驟】 （1）貼壁集落形成：適用于幾乎所有貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。 1）生長(zhǎng)期貼壁細(xì)胞一瓶，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基稀釋成50100個(gè)細(xì)胞/ml。 2）取直徑3335mm培養(yǎng)皿（或15ml培養(yǎng)瓶）或6孔板，每組3復(fù)孔/皿，受試藥20l，稀釋后細(xì)胞懸液2ml，搖勻，5%CO2、37培養(yǎng)箱培養(yǎng)714天。 3）棄上清，PBS洗2次，

8、2ml/次，無水甲醇固定5min，靜置干燥，用吉姆薩染色或1%結(jié)晶紫染色510min后，用自來水沖洗，室溫干燥，鏡下計(jì)數(shù)75m以上的集落,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,14,2）軟瓊脂集落形成：適用懸浮和貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。 1）計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，15% NBS培養(yǎng)液配成1000個(gè)/ml細(xì)胞懸液，37溫育。 2）取3335mm培養(yǎng)皿，3復(fù)皿，加受試藥20l。 3）取37新鮮培養(yǎng)液9份，加沸水浴中融化的5%瓊脂液1份，搖勻，加入平皿，每個(gè)1ml，混勻置室溫使瓊脂凝固。 4）取預(yù)溫的細(xì)胞懸液按每9.4ml加5%瓊脂液0.6ml的比例混勻，加入已鋪底層瓊脂的平皿中，每個(gè)1ml，置室溫使瓊脂凝固。 5）將平皿置5%C

9、O2，37孵育箱中培養(yǎng)710天。 6）鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75m（50個(gè)細(xì)胞以上）的集落,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,15,結(jié)果評(píng)定】 （1）劑量反應(yīng)曲線：以集落抑制百分率與劑量對(duì)數(shù)作圖，可以得到一條S形曲線并求出藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。 （2）亦可計(jì)算各加藥組集落形成率,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,16,5、癌細(xì)胞分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 【基本原理】癌癥屬于細(xì)胞分化異常的疾病。惡性腫瘤存在著明顯的細(xì)胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等可在體外被某些化合物誘導(dǎo)分化為正常細(xì)胞或近似正常的細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤藥物研究開辟了一條新的途徑。因此，癌的分化治療已成為癌癥研究的重要前沿方向之一,抗腫瘤藥物實(shí)

10、驗(yàn)法,17,分化指標(biāo)包括形態(tài)學(xué)變化、及生化功能變化 。 人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞的分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) HL-60細(xì)胞分化為成熟度不同的粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞 硝基四氮唑藍(lán)（NBT）試驗(yàn):NBT還原能力應(yīng)大于50。 形態(tài)學(xué)變化的觀察:成熟粒細(xì)胞所占比例越高，說明分化效果越好。 吞噬功能測(cè)定:分化誘導(dǎo)劑的吞噬百分率應(yīng)在50以上,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,18,肝癌Bel 7402細(xì)胞分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 【基本原理】肝癌Bel 7402細(xì)胞甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高。-GT（半乳糖轉(zhuǎn)移酶）在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中活性逐漸上升。白蛋白（ALB）及TAT（酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶）在分化良好細(xì)胞下降。在體外測(cè)定這些蛋白的含量及

11、活性，用以判斷肝癌細(xì)胞的分化程度。 AFP及ALB測(cè)定 ：AFP、ALB放免測(cè)定試劑盒說明測(cè)定AFP及ALB含量 -GT 、TAT測(cè)定：紫外可見分光光度法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,19,第2節(jié) 腫瘤動(dòng)物模型體內(nèi)篩選方法,1.誘發(fā)腫瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)法 2.自發(fā)腫瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)法 3.移植性腫瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)法 4. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤實(shí)驗(yàn)法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,20,對(duì)誘發(fā)腫瘤的評(píng)價(jià) 誘發(fā)性腫瘤的病因與由環(huán)境因素所誘致人癌情況相似。癌細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)在兩者間亦接近，故動(dòng)物誘發(fā)腫瘤類似人體腫瘤。 但人癌原因十分復(fù)雜，誘癌劑不清，腫瘤的病理組織學(xué)與動(dòng)物不同，發(fā)生發(fā)展與動(dòng)物誘發(fā)腫瘤不完全一致。 誘發(fā)腫瘤不僅誘發(fā)需時(shí)較長(zhǎng)

12、，成癌率不高。多數(shù)內(nèi)臟腫瘤不作解剖，難以判斷是否已發(fā)生腫瘤。發(fā)生時(shí)間先后、發(fā)展速度個(gè)體差異大。 加之化學(xué)致癌物的來源比較困難，并隨著環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)對(duì)相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提出了更高的要求和限止，所以本法不宜作一般抗癌藥物篩選應(yīng)用. 對(duì)移植性腫瘤有效的藥物，可用本法進(jìn)一步驗(yàn)證其抗癌療效,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,21,對(duì)自發(fā)腫瘤總的評(píng)價(jià) 其腫瘤發(fā)生率與瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與人癌近似，生長(zhǎng)較移植腫瘤慢，對(duì)藥物敏感度不高，療程較長(zhǎng)，故便于進(jìn)行綜合化療的研究； 理論上用帶有自發(fā)腫瘤模型篩選藥物較理想。然而，動(dòng)物自發(fā)腫瘤的病因取決于的遺傳特性，與人癌病因區(qū)別較大。 很難在限定期間內(nèi)得到大量生長(zhǎng)均勻的帶瘤動(dòng)物，各動(dòng)物腫

13、瘤之間生長(zhǎng)速度差異也較大，給評(píng)價(jià)帶來困難。 此類腫瘤常用于特殊目的試驗(yàn)或作為“二級(jí)篩選”模型,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,22,對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型的評(píng)價(jià) 該模型較好地再現(xiàn)了人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的完整變化，包括機(jī)體從正常演變?yōu)榘┣安∽冞M(jìn)而發(fā)展為惡性腫瘤的全過程，該模型也為相關(guān)基因與腫瘤的關(guān)系在整體水平研究和基因藥物的研發(fā)提供了良好的手段。 但腫瘤的發(fā)生受到一個(gè)或多個(gè)基因的協(xié)同調(diào)控的，與轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型不同； 該模型同樣存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、腫瘤發(fā)生時(shí)間不齊、繁育能力較低以及成本較高等缺點(diǎn),抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,23,移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法,動(dòng)物移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法是最通用的抗腫瘤方法，比自發(fā)性、誘發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤容易造模

14、,成功率高（100），且能同時(shí)獲得大量生長(zhǎng)相對(duì)均勻腫瘤。 一般給藥7-10天，第8-11天解剖動(dòng)物。 觀察指標(biāo)：一般狀況，體重變化及死亡率，判斷藥物是否有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，為抗癌藥物臨床療效提供有意義的依據(jù)。 動(dòng)物移植性腫瘤是任何體外試驗(yàn)不能代替的,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,24,一種藥物未必對(duì)各種類型的移植性腫瘤有效，選擇某一瘤株供篩選都可能漏篩藥物。 動(dòng)物腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)與人類有較大的差距，動(dòng)物瘤株惡性程度高，生長(zhǎng)迅速，對(duì)藥物的敏感性比人類自發(fā)的癌瘤高得多，因此，對(duì)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)有抑制的藥物對(duì)人癌不一定有效。本法的命中率低,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,25,篩選藥物時(shí)最好采用三種瘤株，即肉瘤、腹水型腫

15、瘤和白血病株腫瘤。 國(guó)內(nèi)用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和L615白血病，目前L615往往以P388或L1210小鼠白血病株取代。 我國(guó)對(duì)新藥在第一輪篩選有效的基礎(chǔ)上，推薦人癌異種模型進(jìn)行第二輪篩選，即人癌進(jìn)行T細(xì)胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠異種移植模型,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,26,1.1動(dòng)物選擇 常用小鼠、大鼠和地鼠。每批實(shí)驗(yàn)用同一性別（但乳癌、卵巢癌、宮頸癌等必須用雌性）。 1.2腫瘤移植 (1)一般要求 無菌、低溫（消毒不嚴(yán)、瘤塊污染常是接種失敗的主要原因） 接種部位: 皮下接種(右前肢腋);肌肉接種(大腿肌肉部); 腹水型接種(腹腔,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,27,2)瘤塊制備：取接種7-10天、生

16、長(zhǎng)旺盛且無潰破瘤源。消毒，切開皮膚、瘤生長(zhǎng)良好（無壞死或液化），放入無菌平皿，剪成2-3mm3小塊。平皿應(yīng)置于冰上。無菌套管針抽吸或向套管針內(nèi)塞進(jìn)一小瘤塊。一般應(yīng)在30min內(nèi)接種完畢。 (3)瘤細(xì)胞懸液的制備：數(shù)個(gè)瘤塊混合，剪成小塊，用玻璃組織勻漿器研磨，生理鹽水適量稀釋成l：3或l：4的瘤細(xì)胞懸液,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,28,4)腹水型腫瘤懸液的制備 1)抽取腹水：選擇接種后7-10天瘤源動(dòng)物，腹水應(yīng)為乳白色濃稠液體(如黃色或有大量紅細(xì)胞則棄去)。 2)細(xì)胞計(jì)數(shù)：用白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)瘤細(xì)胞總數(shù)。 3)接種：腹水用無菌生理鹽水或含葡萄糖的平衡鹽水(如Hanks液、Gey液等)稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋?10

17、7 /ml ），ip每鼠0.2ml。 (5)白細(xì)胞瘤株的接種：腹水型白細(xì)胞瘤如P388及L1210的接種同腹水型腫瘤接種法,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,29,1.3 移植性動(dòng)物腫瘤的質(zhì)量鑒定 (1)每年進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤株的組織學(xué)檢查。 (2) 接種前置37培養(yǎng)箱內(nèi)以檢查細(xì)菌，霉菌;在接種和傳代過程中，必須嚴(yán)格無菌操作，防止感染。 (3)腫瘤生長(zhǎng)潛力的檢查 1)實(shí)體瘤：若對(duì)照組中20腫瘤400mg或平均重量1g；大鼠腫瘤平均重量小于2g，作廢。 2)腹水型腫瘤：對(duì)照組平均生存率應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi),抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,30,4)死亡分析：動(dòng)物體重減輕、明顯的感染等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的可靠性，必須追究原因（是否給藥劑量

18、過大等）。 (5)陽性對(duì)照：通常選用對(duì)所選瘤株敏感的已知抗腫瘤藥作陽性對(duì)照。如S180、EAC皮下型可用環(huán)磷酰胺2030mg(kgd)；L615可用5-Fu 25mg/(kgd)。 在同類型化合物抗腫瘤試驗(yàn)時(shí)，最好使用同類型臨床有效的藥物,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,31,1.4 待篩藥物的給藥途徑 化學(xué)合成藥、抗生素濾液及植物藥的提取物，通常用ip、sc或ig給藥，其他途徑有im、iv等。 1.5劑量的選擇 一日量可用l/31/5 LD50 劑量 參考同類藥物臨床劑量 參考同類藥物動(dòng)物劑量 預(yù)實(shí)驗(yàn),開始有動(dòng)物死亡計(jì)量的l/31/5為一日量,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,32,1.6動(dòng)物分組 隨機(jī) 小鼠體重相差不超

19、過4g； 每組小鼠平均體重相差不宜超過1g； 每組大鼠平均體重相差不宜超過5g,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,33,1.7療效評(píng)價(jià) (1)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià) 在治療期間給藥組死亡超過20，或平均體重(去瘤后)下降(自身對(duì)照)超過15者，表示藥物毒性反應(yīng)，減少劑量重新試驗(yàn)。 瘤重抑制率=(1-TC)100 中草藥抑制率大于30，合成藥大于40，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著差異時(shí)，認(rèn)為有苗頭，繼續(xù)重復(fù)，連續(xù)3次，療效穩(wěn)定，則評(píng)定此藥有一定療效,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,34,2)腹水型腫瘤療效評(píng)價(jià)： 逐日記錄動(dòng)物死亡情況。 對(duì)照組通常2-3周內(nèi)死完。如對(duì)照組動(dòng)物7天內(nèi)死亡20；或20存活4周以上，實(shí)驗(yàn)作廢。 治療組觀察時(shí)間一般為

20、30天或60天(生存超過此時(shí)限者，仍按30天或60天計(jì)算)。分別記錄對(duì)照組和治療組的平均生存時(shí)間，按下列公式計(jì)算生命延長(zhǎng)率： 生命延長(zhǎng)率=(TC1)100 非腹腔給藥時(shí)生命延長(zhǎng)率大于50，或腹腔給藥生命延長(zhǎng)率大于75，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著差異時(shí)，認(rèn)為有苗頭，需繼續(xù)試驗(yàn)。連續(xù)3次，療效穩(wěn)定，則評(píng)定此藥有一定療效,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,35,1.8瘤株的選擇 目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多首先經(jīng)動(dòng)物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的，從尋找新藥角度看來，按照我國(guó)目前條件和情況，篩選細(xì)胞毒類藥物時(shí)可選用肉瘤Sl80腹水型或?qū)嶓w型、艾氏癌腹水型(EAC)或?qū)嶓w型(ESC)、肝癌Hep腹水型(HAC)或?qū)嶓w型(H22)、

21、Lewis肺癌LL、白血病L1210和P388、黑色素瘤B16、肉瘤S37、腸癌C38、C26及Walker癌肉瘤W256等,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,36,從天然產(chǎn)物中尋找新抗腫瘤藥物可選用S180實(shí)體型、ESC、LL、L1210和P388、B16、HepA或S、腸癌C26、C38、子宮頸癌U14、白血病L615以及W256等。 企圖用一種模型去篩選各種不同類型的新藥，顯然是不恰當(dāng)?shù)?，因?yàn)楦鞣N動(dòng)物移植瘤對(duì)抗癌藥物的敏感性不一樣,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,37,1.9腫瘤的低溫保存 冷凍保存液可以改變細(xì)胞或瘤塊的滲透性，減少細(xì)胞內(nèi)的水分，防止水分在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶，如含15的甘油或10二甲基亞砜的培養(yǎng)基。

22、凍存時(shí)，慢凍（引起的細(xì)胞損傷最?。瑩p傷是由于在極少量未結(jié)冰水中保留了高濃度電解質(zhì)引起，因此細(xì)胞從0-20C間冷凍速度要緩慢，一般以每分鐘降1C為宜。然后再將安瓿放置于干冰(固體CO2)或液氮中保存。一般可保存6個(gè)月左右。 速融，凍存管迅速放入38-40度水浴，RPMI1640 液洗滌1-2次，接種,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,38,1.10移植性腫瘤實(shí)驗(yàn)法舉例 l.l0.1小鼠腹水型L1210模型 【基本原理】 將小鼠白血病L1210瘤細(xì)胞懸液ip小鼠，給予不同劑量抗癌活性藥物，可延長(zhǎng)荷瘤宿主的生命。 【操作步驟】 (1)無菌取DBA/2小鼠約7d的L1210腹水，生理鹽水配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為5

23、106/ml，ip小鼠0.2 ml(L1210細(xì)胞105個(gè))。每組6-10只動(dòng)物。（雄性,l8-22g，雌性17-21g，每次實(shí)驗(yàn)均用同一性別），接種當(dāng)天為d0,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,39,2) d1稱重、隨機(jī)分組，給藥，包括陰性對(duì)照(溶劑)及陽性對(duì)照藥，一般用腹腔注射(方案可有多種：僅給1次，次日給藥；每日一次，連續(xù)7天；于第1、5天或第1、5、9天每隔4天給藥一次等)。 記錄30天內(nèi)各組動(dòng)物的死亡情況，至第30天，統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的平均死亡率。 【結(jié)果計(jì)算】 根據(jù)公式計(jì)算試藥對(duì)L1210的延長(zhǎng)生命率。(L1210平均存活期8-1ld。一般腹水型腫瘤的實(shí)驗(yàn)觀察期為30d，未死亡動(dòng)物以30d計(jì),抗腫瘤

24、藥物實(shí)驗(yàn)法,40,方法評(píng)價(jià)】 (1)本法也適用P388、EAC、HepA、w256及S180等腹水型移植性腫瘤模型。 (2)給藥組第5天動(dòng)物存活數(shù)應(yīng)大于65，否則表示藥物劑量過大。 (3)若陰性對(duì)照組動(dòng)物在15d內(nèi)仍不死亡，說明實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)分析原因，重做,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,41,1.10.2 實(shí)體瘤模型以肉瘤S180皮下接種 【基本原理】皮下接種同種宿主前肢腋下S180 ，給予抗癌活性的藥物，可以抑制腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。 【操作步驟】 (1)無菌取接種于昆明小鼠約7天的S180腹水或S180腫瘤。 S180腫瘤無菌剔除包膜和壞死部分，選取完好的瘤塊，置于玻璃勻漿器內(nèi)，加入適量的生理鹽水，計(jì)數(shù)，以

25、生理鹽水配制成懸液（1107ml）， 0.2ml/只接種于小鼠前肢腋下，10只一組（雄性體重l8-22g；雌性17-21g,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,42,2) 第2天（d1）稱重、分組、給藥。 (3)第11天，動(dòng)物稱體重，取腫瘤，稱重，最計(jì)算抑瘤率。 【結(jié)果計(jì)算】 按上式計(jì)算樣本對(duì)S180的抑瘤率。 【注意事項(xiàng)】 (1)本法適用于Hep、w256及C26等實(shí)體型模型。 (2) 原則上,陽性對(duì)照組的腫瘤抑瘤率應(yīng)80。陰性對(duì)照組腫瘤為2g左右。 (3)試驗(yàn)組動(dòng)物體重不低于原始體重的20，否則表示試藥劑量過高，需降低劑量重試,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,43,1.10.3肌肉接種大鼠Walker癌肉瘤W256模型

26、【操作步驟】 (1) Wistar大鼠，55-65g。后腿肌內(nèi)接種瘤細(xì)胞懸液0.2ml(約2-4106個(gè)瘤細(xì)胞),每組用6-10只動(dòng)物. (2)接種分組給藥同前。至第8-11天，處死動(dòng)物，將雙側(cè)后肢從髓關(guān)節(jié)處剪下，分別稱重，荷瘤肢重減去正常肢重即為瘤重。 【結(jié)果計(jì)算】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式計(jì)算,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,44,注意事項(xiàng) (1)本法也適用于S180及EAC等腫瘤。 (2)接種用瘤源有兩種：一種取用腹水型瘤源，取傳代6-8天的瘤源，抽出的腹水應(yīng)帶有血性；另一種取用皮下接種的腫瘤以勻漿法制成瘤細(xì)胞懸液。 (3)對(duì)照組肌肉型平均瘤重為3-5g；皮下型平均瘤重為3-12g；腹水型平均生存l0-

27、14天。 (4)d7給藥動(dòng)物存活率65,否則劑量過大,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,45,1.10.4 足趾皮下接種小鼠Lewis肺癌模型 【基本原理】惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6，SC、IM接種對(duì)藥物的敏感性較低，自發(fā)轉(zhuǎn)移肺。接種于后足趾皮下后，待腫瘤生長(zhǎng)10d，切除帶瘤足趾稱重，計(jì)算抑制率。 【操作步驟】取皮下接種8-12d的腫瘤，制成1107/ml 懸液,足趾皮下接種5105/0.02ml，接種于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。 給藥后，次日處死動(dòng)物，將帶瘤后足趾從足關(guān)節(jié)處剪下，分別稱取荷瘤足趾重，與陰性對(duì)照組比較，計(jì)算抑瘤率。 【結(jié)果計(jì)算】計(jì)算腫瘤抑制率,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,46,

28、注意事項(xiàng)】 (1)Lewis肺癌由于其接種的部位不同，可觀察抑瘤率、生命延長(zhǎng)率、自發(fā)肺轉(zhuǎn)移。 (2)Lewis肺癌對(duì)環(huán)磷酰胺及亞硝脲敏感，對(duì)5-Fu及博來霉素的敏感性稍差。 (3) Lewis肺癌的足趾接種具有兩種意義：一是直接取荷瘤的足趾測(cè)算樣本對(duì)原發(fā)灶的抑瘤率；繼續(xù)給藥又可觀察樣本對(duì)自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的效果。 (4)本實(shí)驗(yàn)只適用于宿主為近交系的腫瘤模型，因接種的細(xì)胞量偏少，若應(yīng)用于非近交系動(dòng)物，腫瘤的生長(zhǎng)將會(huì)出現(xiàn)較大的偏差，結(jié)果難以統(tǒng)計(jì),抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,47,1.10.5 人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型 【基本原理】裸鼠又稱無胸腺小鼠，具有先天性胸腺缺失；胸腺依賴性免疫功能缺乏，其T細(xì)胞功能接近于

29、零，但B細(xì)胞功能基本正常，體內(nèi)不具排斥反應(yīng)，故是人體腫瘤異種移植的理想宿主。 異種移植于裸鼠體內(nèi)的人體腫瘤仍保持其原有的組織形態(tài)及生化功能，以及特有的染色體組型和對(duì)抗腫瘤藥原有的敏感性。 一般認(rèn)為人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型對(duì)抗癌藥的反應(yīng)與臨床有較好的相關(guān)性，對(duì)臨床療效有重要的參考價(jià)值,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,48,操作步驟】 (1)人體腫瘤異種移植于裸鼠的瘤源： 一是已建株的人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型，腹水型或?qū)嶓w型，與移植性動(dòng)物腫瘤模型一樣進(jìn)行操作。 二是培養(yǎng)的各種病理類型人體腫瘤細(xì)胞。 (2) 經(jīng)一定的潛伏期，可見腫瘤生長(zhǎng)。待腫瘤增殖至可觸及時(shí)(瘤結(jié)節(jié)約400mg)，將動(dòng)物隨機(jī)分組，進(jìn)行治療

30、。亦可在腫瘤接種后次日即分組治療,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,49,結(jié)果計(jì)算】 (1)計(jì)算給藥組腫瘤抑制率、生命延長(zhǎng)率。其計(jì)算方法同移植性動(dòng)物腫瘤模型。 (2)裸鼠因皮膚無毛，可便于用卡尺從體外測(cè)量腫瘤的體積，易于動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)，比較治療組和對(duì)照組腫瘤增殖曲線的變化。每次測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)根據(jù)下列公式計(jì)算腫瘤體積(V)：V=(Lw2)/2,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,50,注意事項(xiàng)】 (1)裸鼠因T細(xì)胞免疫缺陷的特性，故對(duì)外界的環(huán)境非常敏感，因此裸鼠一定要飼養(yǎng)于無特殊病原體(SPF)的環(huán)境，至少需飼養(yǎng)于層流架內(nèi)，其飼養(yǎng)籠需附帶有濾膜的蓋。所接觸和使用的器具、飼料、飲水、墊料、籠具均預(yù)先用高壓

31、滅菌處理過。所用的試藥也應(yīng)無菌處理。實(shí)驗(yàn)操作也應(yīng)在層流柜內(nèi)進(jìn)行。 (2) 價(jià)格比較昂貴，實(shí)驗(yàn)所需代價(jià)高。一般要在試藥通過動(dòng)物移植性腫瘤有效的基礎(chǔ)上再進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn),抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,51,3)異種移植于裸鼠體內(nèi)的人體腫瘤因仍保持其原有的腫瘤特性，故其生長(zhǎng)周期相對(duì)較動(dòng)物腫瘤模型為長(zhǎng)，因此，有關(guān)給藥的方案，尤其是給藥的時(shí)間和周期因瘤株而異,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,52,1.10.6小鼠腎囊膜下腫瘤移植法 1.10.7抗轉(zhuǎn)移模型的舉例 1.10.7.1 Lewis肺癌自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型 1.10.7.2 B16小鼠黑色素瘤人工肺轉(zhuǎn)移模型 1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾內(nèi)移植后肝轉(zhuǎn)移模型 1.10.8癌侵襲

32、的動(dòng)物模型 1.10.8 .1癌骨侵襲大鼠walker-256模型 1.10.8 .2腎侵襲小鼠宮頸癌U14模型 1.10.9原位移植癌動(dòng)物模型 1.10.9.1小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤G422腦原位瘤試驗(yàn)法 1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌試驗(yàn)法 1.10.9.3人胃癌SGC一7901裸鼠原位接種模型 ， 1.10.10 W256肝內(nèi)接種介入治療的模型 1.10.11癌分化誘導(dǎo)的動(dòng)物模型等,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,53,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,54,四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型（Tumor models of transgenic animal）是指通過重組DNA技術(shù)將外源腫瘤基因

33、或相關(guān)基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組，使之穩(wěn)定表達(dá)并能遺傳給后代的一類腫瘤動(dòng)物模型。轉(zhuǎn)基因方法主要有顯微注射法、精子載體法、電轉(zhuǎn)移、胚胎干細(xì)胞移植法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、人工酵母染色法等多種方法。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的腫瘤模型可為腫瘤研究提供理想的動(dòng)物模型，為深入研究其發(fā)病機(jī)制以及基因藥物的等創(chuàng)造了前所未有的條件，為人類精確地研究基因與疾病的相關(guān)關(guān)系提供了可能。但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型也存在一定的穩(wěn)定性，長(zhǎng)期繁育傳代過程中會(huì)發(fā)生性狀的改變，甚至丟失。胚胎或精子的冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用可避免這種現(xiàn)象的發(fā)生。并在發(fā)育和研究中加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)特性觀察，同時(shí)利用PCR技術(shù)檢測(cè)外源腫瘤基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)，以防外

34、源腫瘤基因的丟失。 （一）乙型肝炎病毒（HBV）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腫瘤模型 （二）乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,55,三、體外腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測(cè)模型 （一）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Wound healing assay） 【基本原理】上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞等，在生理狀態(tài)下，常形成單層或者復(fù)層上皮細(xì)胞。在病理狀態(tài)下，細(xì)胞遷移的時(shí)候則以側(cè)向運(yùn)動(dòng)為主。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是將細(xì)胞單層培養(yǎng)在培養(yǎng)板上，待細(xì)胞融合后機(jī)械性地使小片細(xì)胞脫落，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞向無細(xì)胞的劃痕區(qū)域遷移情況的實(shí)驗(yàn)，很好的模擬了這種側(cè)向遷移運(yùn)動(dòng)，一直被用來檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,56,操作步驟】 （1） 準(zhǔn)備

35、：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和Marker筆操作前要在超凈臺(tái)內(nèi)紫外照射30min。 （2） 用Marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃?rùn)M線，大約每隔0.51cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線 （3） 向孔中加入約106個(gè)細(xì)胞，因細(xì)胞增殖能力不同而略有不同，37, 5% CO2孵育過夜，使細(xì)胞貼壁，鋪滿板底即可。 （4） 第二天，用200l的槍頭在細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕，槍頭應(yīng)盡量垂直于孔背后的橫線，可用直尺比著，槍頭要垂直。 （5） 用PBS洗滌細(xì)胞3次，清除劃下的細(xì)胞，然后加入低血清培養(yǎng)液（含1%2%FBS），放入孵箱，37, 5% CO2孵育。 （6） 在024h內(nèi)取不同的時(shí)間點(diǎn)

36、拍照，通過計(jì)算劃痕區(qū)域內(nèi)無細(xì)胞區(qū)的面積統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移情況。 【結(jié)果判定】比較各組劃痕區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目多少、計(jì)算劃痕區(qū)域內(nèi)無細(xì)胞區(qū)的大小或面積。 【注意事項(xiàng)與模型評(píng)價(jià)】劃痕法的優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，細(xì)胞外圍環(huán)境簡(jiǎn)單，容易控制。劃痕法的不足：對(duì)細(xì)胞的要求高，適用的細(xì)胞系范圍較窄。劃痕實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞本身具有較強(qiáng)的遷移能力，且對(duì)無血清的培養(yǎng)環(huán)境有較強(qiáng)的忍受力，因此只適用于上皮、纖維樣細(xì)胞系和部分腫瘤細(xì)胞系,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,57,二）Transwell （Boyden小室）實(shí)驗(yàn) Transwell準(zhǔn)確的說應(yīng)該是一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)的主要材料是Transwell小室或Boyden小室，是一類有通透性的

37、杯狀的裝置，杯子底層的一張有通透性的膜，這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.112.0m，根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究,抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,58,1.Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 【基本原理】腫瘤侵襲基底膜被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞最初穿過基底膜是它們侵入淋巴系統(tǒng)或血管床的開始，隨后腫瘤細(xì)胞通過血行散播或淋巴轉(zhuǎn)移進(jìn)入靶器官/組織，最終形成轉(zhuǎn)移灶。 為了體外分析評(píng)估腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，人們研發(fā)了多個(gè)系統(tǒng)來評(píng)估細(xì)胞侵襲穿

38、過基底膜的能力。一些實(shí)驗(yàn)利用組織的基底膜提取物，例如羊膜、雞絨(毛)膜尿囊膜、晶狀體囊膜和膀胱壁等。然而，由于組織本身的異質(zhì)性，這些基質(zhì)的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性并不理想。而且，提取這些基質(zhì)通常需要很長(zhǎng)時(shí)間，技術(shù)上也很復(fù)雜。因此，人們研制出了同質(zhì)性更好的細(xì)胞外基質(zhì)來用于體外侵襲實(shí)驗(yàn)的研究。 其中應(yīng)用最廣泛的就是Matrigel從一種富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的小鼠EngelbrethHolmSwarm肉瘤中提取的可溶性的基底膜。它主要包含層黏連蛋白型膠原、硫酸類肝素蛋白多糖等多種基底膜組分。在實(shí)驗(yàn)室里，Matrigel加工應(yīng)用起來相對(duì)簡(jiǎn)單。 這部分的侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是細(xì)胞黏附在基質(zhì)膠上，侵襲進(jìn)入和穿過基質(zhì)，繼而朝向趨

39、化因子的方向遷移的能力。這些步驟被證明是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié),抗腫瘤藥物實(shí)驗(yàn)法,59,操作步驟】 （1） Matrigel膠包被小室的制備 1）解凍未開封的Matrigel溶液，置于冰上放入冰箱里，至少6h，推薦過夜解凍。遇冷所有的細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell小室或Boyden小室、無菌吸量管、小管。除非有所提示，否則所有的步驟都應(yīng)該在無菌條件下進(jìn)行。 2）搖動(dòng)瓶子使Matrigel更好溶解。吸取適量Matrigel稀釋到所需要濃度。起始濃度可選擇1.2 mg/ml,0.6 mg/ml,0.3 mg/ml等，溶解于無血清培養(yǎng)基中。吸出5ml待用，剩余Matrigel應(yīng)立即儲(chǔ)存在20。 3）室溫?zé)o菌環(huán)境下，小心的吸取Matrigel溶液于小室膜的上方，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)小室，確保膜的上表面