豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的擴散及膨潤土促其耐藥基因轉(zhuǎn)移機制的研究

1、豬源產(chǎn) ESBL大腸桿菌的擴散及膨潤土促其耐藥基因轉(zhuǎn)移機制的研究超廣譜 - 內(nèi)酰胺酶 (extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)是一類能夠水解青霉素 , 第一代、第二代、第三代頭孢菌素及氨曲南等抗生素的一種酶,能夠被酶抑制劑所抑制 , 但對頭霉素、碳青霉烯類抗生素敏感。攜帶這種酶的細菌可以水解相應(yīng)的抗生素從而導(dǎo)致治療失敗。近年來 , 產(chǎn) ESBL微生物在世界范圍內(nèi)不斷出現(xiàn), 廣泛分布于醫(yī)院臨床、社區(qū)環(huán)境以及畜牧環(huán)境中。該酶主要存在于大腸桿菌以及克雷伯氏菌, 給公共健康帶來了極大的威脅。包括三種主要的類型TEM,SHV以及 CTX-M,通常位于可移動遺傳片

2、段上。另外 , 菌株的克隆性傳播是ESBL基因擴散的另一重要途徑。近年來 , 養(yǎng)殖環(huán)境中由于抗生素的大量使用甚至濫用, 越來越多的 ESBLs在養(yǎng)殖環(huán)境中出現(xiàn)。這些動物源性的產(chǎn)ESBL的大腸桿菌會通過各種途徑向環(huán)境中擴散 , 甚至通過動物產(chǎn)品進入食物鏈, 給公共衛(wèi)生帶來了潛在的威脅。目前 CTX-M是不同環(huán)境中主要的流行類型。主要發(fā)現(xiàn)于質(zhì)粒上, 在不同的細菌之間 , 基因能夠水平轉(zhuǎn)移進行傳遞, 從而進行耐藥的擴散。接合轉(zhuǎn)移使其進行散播的主要方式, 通常受到環(huán)境等其他因素的影響。膨潤土是以蒙脫石為主要成分的粘土類物質(zhì), 我國產(chǎn)量豐富 , 主要成分為 SiO2 和Al2O3。膨潤土由于具有吸附性好

3、、粘附性、含礦物質(zhì)等特性, 廣泛用于畜禽及水產(chǎn)動物飼料添加劑用以吸附動物消化道內(nèi)的有毒物質(zhì), 延長飼料通過動物消化道的速度 , 防止畜禽類非細菌性腹瀉。 然而 , 膨潤土是否會對耐藥基因的轉(zhuǎn)移造成影響,引起了人們的廣泛關(guān)注。為了解目前我國的養(yǎng)豬環(huán)境中產(chǎn)ESBL大腸桿菌的流行情況及其對周圍環(huán)境的影響 , 以及飼料添加劑對ESBL基因在細菌之間接合轉(zhuǎn)移的影響極其機制, 我們展開了以下的研究。 1. 養(yǎng)豬環(huán)境中豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的流行情況及分子特點的研究為了解產(chǎn)ESBL大腸桿菌在山東地區(qū)的流行情況及其對環(huán)境的影響, 我們從山東地區(qū)的 10 個豬場中采集豬場糞便樣品, 豬場內(nèi)外的空氣樣品 , 水和

4、淤泥樣品以及土壤樣品 , 分離產(chǎn) ESBL的大腸桿菌 , 并對其特點進行分析。我們從六個豬場中共分離的到119 株產(chǎn) ESBL的大腸桿菌他們分別來自不同的糞便樣品和環(huán)境樣品 , 另外四個豬場中沒有得到產(chǎn)ESBL的大腸桿菌。同一場中來源于糞便和環(huán)境樣品的產(chǎn)ESBL大腸桿菌在耐藥表型方面顯示極高的相關(guān)性 ,ESBL基因以 CTX-M和 TEM為主 , 同一場中不同來源的分離株 ctx-m 亞型種類相同 , 而不同場之間的分離株卻不具備這種相似性。這表明 , 產(chǎn) esbl 大腸桿菌在該地區(qū)流行較為嚴重 , 且會對周圍環(huán)境造成影響。2. 養(yǎng)殖場中糞便的利用引起的產(chǎn) esbl 大腸桿菌對土壤的污染情況研

5、究我們以產(chǎn)esbl 大腸桿菌為指示菌 , 分別從糞便、堆肥及土壤中采集樣品以進一步研究產(chǎn)esbl 大腸桿菌對土壤環(huán)境的影響。共分離得到 42 株產(chǎn) esbl 大腸桿菌 , 其中有 29 株來自于糞便樣品 ; 分離率為72.5%,3 株來自于堆肥 , 分離率為 15%;10 株來自于場外農(nóng)田中采集的土壤樣品,分離率為 12.5%。來自于豬場的樣品及來自于土壤的樣品都顯示了多重耐藥, 攜帶 ctx-m 和 tem, 主要為 ctx-m-14 和 ctx-m-15 亞型 , 復(fù)制子類型以 f 為主 , 多種復(fù)制子并存 , 且 eric-pcr結(jié)果顯示三株土壤分離株與糞分離株的同源性高于90%,這表明

6、他們可能來自于同一株大腸桿菌。以上結(jié)果說明了土壤中的產(chǎn)esbl 大腸桿菌很可能來源于糞便。3. 飼料添加劑膨潤土對耐藥基因ctx-m-15 水平傳播的促進作用研究ctx-m-15 是主要的流行亞型 , 因此我們以攜帶 ctx-m-15 的 f16 為供體菌 , 它能夠?qū)︻^孢噻肟產(chǎn)生耐藥性但對卡那霉素敏感 , 攜帶卡那抗性的bl21(de3) 為受體菌建立了體外轉(zhuǎn)移模型,研究飼料添加劑膨潤土對這種耐藥基因轉(zhuǎn)移的促進作用。結(jié)果顯示該基因可在不同的大腸桿菌之間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移, 而飼料添加劑膨潤土能夠提高攜帶ctx-m-15 的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率高達4-20 倍。且接合效率受溫度及膨潤土濃度的影響。當膨潤土

7、的濃度為100g/ml 時, 這種促進作用最明顯。 4. 膨潤土刺激下ctx-m-15 耐藥基因水平傳播的差異蛋白質(zhì)組研究為研究飼料添加劑膨潤土對ctx-m-15 基因的促轉(zhuǎn)移機制 , 我們采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究膨潤土是否存在條件下 , 接合菌的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。將膨潤土培養(yǎng)條件下的混合菌提取蛋白進行雙向電泳, 尋找差異表達蛋白。將雙向電泳中的2 倍以上 ,p 值小于 0.05 的差異點用于質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示有 48 個蛋白進行了差異表達, 有 29 個發(fā)生差異表達的蛋白得以成功鑒定。生物信息學(xué)分析顯示這些蛋白包括25 種酶及 4 個蛋白質(zhì) , 參與多種生物學(xué)過程 , 包括糖酵解、壓力應(yīng)激、轉(zhuǎn)運

8、、蛋白合成、其他物質(zhì)的合成、碳水化合物的代謝、乳糖代謝、抗生素抗性、甘油代謝、生物膜的形成及細胞趨性。在這些鑒定得到的蛋白中, 主要是參與各種生物學(xué)過程的酶。這4 個主要蛋白 , 分別為外膜通道蛋白、 abc 周質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、 mipa 互作蛋白及 abc 運輸 atp 結(jié)合蛋白。5. 膨潤土刺激下 ctx-m-15 水平傳播蛋白的轉(zhuǎn)錄水平及其作用研究根據(jù)Genebank上這這四個蛋白的序列, 分別設(shè)計了四個基因tolC,malE,mipA及 ybi T的實時熒光定量引物及全基因擴增引物, 對其進行轉(zhuǎn)錄水平的研究。結(jié)果顯示他們在膨潤土存在條件下 , 供體菌 , 受體菌及接合菌中RNA表達量都呈明顯上升趨勢 , 與蛋白變化水平相一致。且在受體菌中變化幅