雞體抗傳染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA調(diào)控機(jī)制

1、雞體抗傳染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA調(diào)控機(jī)制傳染性法氏囊病 (InfectiousBursalDisease,IBD) 是由傳染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。天然免疫 (innateimmunity) 是機(jī)體防御病原體感染的第一道防線, 在啟動(dòng)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答中起著十分重要的作用。microRNA (miRNA)是一種 21-25nt 的小分子 RNA,是基因表達(dá)的調(diào)控子 , 本研究以 IBDV 為模式病毒 , 探討了 miRNA在機(jī)體中調(diào)控干擾素、 p53 和模式識別受體抗 IB

2、DV 天然免疫的分子機(jī)制。 1 傳染性法氏囊病病毒對雞法氏囊組織中干擾素和 p53 轉(zhuǎn)錄的影響為了分析傳染性法氏囊病病毒(IBDV) 感染雞體內(nèi)干擾素和p53轉(zhuǎn)錄水平差異變化 , 用 IBDV 弱毒 (B87) 和強(qiáng)毒 (QL/12) 分別感染 4 周齡 SPF雞 , 每隔 12h 時(shí) (12 84h) 取 3 只雞的法氏囊組織混合勻漿, 用熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測其感染前后干擾素 (IFN) 和 p53 的 mRNA水平 , 同時(shí)分析法氏囊組織的病理變化和病毒載量。結(jié)果顯示 :QL/12 組 ,IFN- 和 IFN- mRNA水平隨著時(shí)間的增加逐漸升高 ,48h 達(dá)到峰值

3、, 隨后降低 ;IFN- mRNA水平隨著時(shí)間的增加逐漸升高 ,60h 達(dá)到峰值 , 隨后逐漸降低 ;p53 mRNA含量迅速升高 ,60h 達(dá)到峰值 ( 比正常 SPF雞高約90 倍), 隨后降低。 B87 組 ,IFN- mRNA水平先降低后升高 (48h 達(dá)到最低值 ), 而IFN- mRNA水平變化不規(guī)則 ,72h 含量最高 ;IFN-ymRNA水平先逐漸升高后降低(72h 達(dá)到峰值 );p53 mRNA 含量變化較小 ,36h 含量最高 ( 比正常 SPF雞高約 5倍 );QL/12 組誘導(dǎo)法氏囊組織產(chǎn)生的 IFN mRNA (IFN- 、 IFN- 和 IFN- mRNA)以及 p

4、53 mRNA 水平均顯著高于 B87-IBDV 組。病理組織學(xué)檢查可見 : 與正常對照組相比 ,QL/12 組法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的損傷 ,B87 組法氏囊組織未見明顯的組織病變。qRT-PCR檢測 IBDV 病毒載量 ,QL/12 組法氏囊組織中病毒含量 48h 達(dá)到峰值 (8.4 106copies/mg), 而 B87組法氏囊組織中病毒含量72h 達(dá)到峰值 (6.6 104copies/mg) 。本研究為分析雞體內(nèi)IFN 和 p53 介導(dǎo)的抗 IBDV 天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。 2 雞 p53 抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制及gga-miR-2127 對其調(diào)控機(jī)制傳染性法氏囊病 (

5、Infectious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。腫瘤抑制蛋白 p53 能夠抑制多種病毒的復(fù)制, 但對 IBDV復(fù)制的影響仍然不清楚。本研究以 IBDV 為模式病毒 , 采用體外感染模式 , 在 IBDV 感染的 DF-1 細(xì)胞中 ,p53 的表達(dá)水平和活性均顯著升高。p53 過表達(dá)可以抑制IBDV 的復(fù)制 , 并激活雞體抗病毒天然免疫基因(IPS-1 、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表達(dá)水平上調(diào) ;p53 抑制表達(dá)則得到相反的結(jié)果; 表明 p5

6、3可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV 感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127 可以作用于 p53 的 3UTR;qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-2127 可以使 p53 的蛋白水平表達(dá)降低 , 但mRNA水平?jīng)]有變化 ;gga-miR-2127 過表達(dá)可以使雞體的抗病毒天然免疫基因表達(dá)降低 ,IBDV 復(fù)制水平升高。本研究表明 :gga-miR-2127 可以作用于 p53 的 3UTR調(diào)控 p53 的表達(dá)來發(fā)揮抗 IBDV 感染的作用。 3 gga-miR-9* 靶向 IRF2 促進(jìn)傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的分子機(jī)制為研究gg

7、a-miR-9* 對傳染性法氏囊病病毒 (IBDV) 復(fù)制的影響 , 本研究用化學(xué)合成的方法合成gga-miR-9* 的模擬物 gga-miR-9*mimics, 轉(zhuǎn)染 DF-1 細(xì)胞 ,24 h 后, 接種 IBDV, 48 h 后, 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液 , 測定 IBDV 的滴度 , 結(jié)果顯示 ,gga-miR-9* mimics 能夠促進(jìn) IBDV的復(fù)制。通過對病毒感染后的IFN 檢測分析 , 發(fā)現(xiàn) gga-miR-9* 可負(fù)調(diào)控干擾素 (IFN)的產(chǎn)生 ; 進(jìn)一步用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析驗(yàn)證,gga-miR-9*可靶向調(diào)控干擾素調(diào)控基因2(IRF2) 。用 wester

8、n blot和 qRT-PCR 分析 ,gga-miR-9* mimics 轉(zhuǎn)染的 DF-1 細(xì)胞中 IRF2 蛋白和 mRNA水平均比正常DF-1 細(xì)胞顯著降低 , 將細(xì)胞中的 IRF2 基因敲除 ,IBDV 復(fù)制滴度 (10625TCID50/0.1mL) 顯著高于 miRNA對照組 (105 25TCID50/0.1mL),表明細(xì)胞gga-miR-9* 促進(jìn) IBDV復(fù)制的分子作用機(jī)理是在IRF2 基因轉(zhuǎn)錄后水平上抑制細(xì)胞天然免疫功能而發(fā)生的。4 傳染性法氏囊病病毒感染對雞細(xì)胞模式識別受體及抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響為研究傳染性法氏囊病病毒 (IBDV) 感染對雞細(xì)胞模式識別受體 (PRRs)

9、及天然免疫抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響 , 本實(shí)驗(yàn)分別用 IBDV 弱毒感染 DT40細(xì)胞和強(qiáng)毒感染SPF雞, 以定量 PCR (qRT-PCR)檢測感染細(xì)胞和法氏囊組織中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和 LGP2)及天然免疫抗病毒基因 (IPS-1 、IRF3、PKR、OAS、Mx)的 mRNA轉(zhuǎn)錄變化。在 IBDV感染 DT40細(xì)胞的 2h 到 24h 內(nèi),chMDA5、chTLR3、chLGP2、 IRF3、 PKR、 OAS、Mx 的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升 , 分別為 324 、22、 61、 29、16、225 000 和 18 700倍。當(dāng)用 siRNA 分別敲除 D

10、T40 細(xì)胞中 chMDA5、chTLR3 和 chLGP2 時(shí),IPS-1 、IRF3、PKR、 OAS和 Mx在 IBDV感染后的 2h 到 24h 差異變化不顯著。在IBDV感染 SPF雞法氏囊組織細(xì)胞中 ,chMDA5和 chTLR3的表達(dá)顯著降低 , 而 chLGP2表達(dá)沒有顯著差異 ,IRF3 、 PKR、OAS和 Mx的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。TLR4和 TLR7在 IBDV的體外和體內(nèi)感染試驗(yàn)中均未檢測到, 而 IPS-1 在 IBDV的體外和體內(nèi)感染試驗(yàn)中均變化不顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,chMDA5、chTLR3和chLGP2在識別 IBDV的感染中起著關(guān)鍵作用 ,IBDV 感染嚴(yán)重

11、抑制了雞細(xì)胞模式識別受體 chMDA5和 chTLR3的轉(zhuǎn)錄 , 并且提示其抑制作用在體內(nèi)與體外可能存在不同的分子機(jī)制。5 gga-miR-142-5p 調(diào)控 chMDA5抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的機(jī)制傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。chMDA5在識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)及激活宿主的天然免疫應(yīng)答中具有重要的作用,但 chMDA5識別 IBDV 的分子機(jī)制仍然不清楚。本研究以 IBDV 為模式病毒 , 采用體外感染模式 , 在 IBDV 感染的 DT40細(xì)胞中 ,chMDA5的表達(dá)水平顯著升高。 chMDA5過表達(dá)可以抑制 IBDV 的復(fù)制 , 并激活I(lǐng)FN- promoter和 Mx promoter 活性 ,chMDA5抑制表達(dá)則得到相反的結(jié)果; 且chMDA5激活 IFN- promoter活性主要是通過 IRF7 通路 ; 表明 chMDA5可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV 感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-142-5p 可以作用于 chMDA5的 3UTR; qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-142-5p 可以使chMDA5的蛋白水平表達(dá)降低 , 但 mRNA水平?jīng)]有變化 ;gga-miR-