雞體抗傳染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA調(diào)控機制

1、雞體抗傳染性法氏囊病病毒天然免疫基因的miRNA調(diào)控機制傳染性法氏囊病 (InfectiousBursalDisease,IBD) 是由傳染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。天然免疫 (innateimmunity) 是機體防御病原體感染的第一道防線, 在啟動機體的獲得性免疫應(yīng)答中起著十分重要的作用。microRNA (miRNA)是一種 21-25nt 的小分子 RNA,是基因表達的調(diào)控子 , 本研究以 IBDV 為模式病毒 , 探討了 miRNA在機體中調(diào)控干擾素、 p53 和模式識別受體抗 IB

2、DV 天然免疫的分子機制。 1 傳染性法氏囊病病毒對雞法氏囊組織中干擾素和 p53 轉(zhuǎn)錄的影響為了分析傳染性法氏囊病病毒(IBDV) 感染雞體內(nèi)干擾素和p53轉(zhuǎn)錄水平差異變化 , 用 IBDV 弱毒 (B87) 和強毒 (QL/12) 分別感染 4 周齡 SPF雞 , 每隔 12h 時 (12 84h) 取 3 只雞的法氏囊組織混合勻漿, 用熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測其感染前后干擾素 (IFN) 和 p53 的 mRNA水平 , 同時分析法氏囊組織的病理變化和病毒載量。結(jié)果顯示 :QL/12 組 ,IFN- 和 IFN- mRNA水平隨著時間的增加逐漸升高 ,48h 達到峰值

3、, 隨后降低 ;IFN- mRNA水平隨著時間的增加逐漸升高 ,60h 達到峰值 , 隨后逐漸降低 ;p53 mRNA含量迅速升高 ,60h 達到峰值 ( 比正常 SPF雞高約90 倍), 隨后降低。 B87 組 ,IFN- mRNA水平先降低后升高 (48h 達到最低值 ), 而IFN- mRNA水平變化不規(guī)則 ,72h 含量最高 ;IFN-ymRNA水平先逐漸升高后降低(72h 達到峰值 );p53 mRNA 含量變化較小 ,36h 含量最高 ( 比正常 SPF雞高約 5倍 );QL/12 組誘導(dǎo)法氏囊組織產(chǎn)生的 IFN mRNA (IFN- 、 IFN- 和 IFN- mRNA)以及 p

4、53 mRNA 水平均顯著高于 B87-IBDV 組。病理組織學(xué)檢查可見 : 與正常對照組相比 ,QL/12 組法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的損傷 ,B87 組法氏囊組織未見明顯的組織病變。qRT-PCR檢測 IBDV 病毒載量 ,QL/12 組法氏囊組織中病毒含量 48h 達到峰值 (8.4 106copies/mg), 而 B87組法氏囊組織中病毒含量72h 達到峰值 (6.6 104copies/mg) 。本研究為分析雞體內(nèi)IFN 和 p53 介導(dǎo)的抗 IBDV 天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。 2 雞 p53 抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制及gga-miR-2127 對其調(diào)控機制傳染性法氏囊病 (

5、Infectious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。腫瘤抑制蛋白 p53 能夠抑制多種病毒的復(fù)制, 但對 IBDV復(fù)制的影響仍然不清楚。本研究以 IBDV 為模式病毒 , 采用體外感染模式 , 在 IBDV 感染的 DF-1 細胞中 ,p53 的表達水平和活性均顯著升高。p53 過表達可以抑制IBDV 的復(fù)制 , 并激活雞體抗病毒天然免疫基因(IPS-1 、IRF3、PKR、OAS、Mx)的表達水平上調(diào) ;p53 抑制表達則得到相反的結(jié)果; 表明 p5

6、3可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV 感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-2127 可以作用于 p53 的 3UTR;qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-2127 可以使 p53 的蛋白水平表達降低 , 但mRNA水平?jīng)]有變化 ;gga-miR-2127 過表達可以使雞體的抗病毒天然免疫基因表達降低 ,IBDV 復(fù)制水平升高。本研究表明 :gga-miR-2127 可以作用于 p53 的 3UTR調(diào)控 p53 的表達來發(fā)揮抗 IBDV 感染的作用。 3 gga-miR-9* 靶向 IRF2 促進傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的分子機制為研究gg

7、a-miR-9* 對傳染性法氏囊病病毒 (IBDV) 復(fù)制的影響 , 本研究用化學(xué)合成的方法合成gga-miR-9* 的模擬物 gga-miR-9*mimics, 轉(zhuǎn)染 DF-1 細胞 ,24 h 后, 接種 IBDV, 48 h 后, 收集細胞培養(yǎng)上清液 , 測定 IBDV 的滴度 , 結(jié)果顯示 ,gga-miR-9* mimics 能夠促進 IBDV的復(fù)制。通過對病毒感染后的IFN 檢測分析 , 發(fā)現(xiàn) gga-miR-9* 可負調(diào)控干擾素 (IFN)的產(chǎn)生 ; 進一步用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析驗證,gga-miR-9*可靶向調(diào)控干擾素調(diào)控基因2(IRF2) 。用 wester

8、n blot和 qRT-PCR 分析 ,gga-miR-9* mimics 轉(zhuǎn)染的 DF-1 細胞中 IRF2 蛋白和 mRNA水平均比正常DF-1 細胞顯著降低 , 將細胞中的 IRF2 基因敲除 ,IBDV 復(fù)制滴度 (10625TCID50/0.1mL) 顯著高于 miRNA對照組 (105 25TCID50/0.1mL),表明細胞gga-miR-9* 促進 IBDV復(fù)制的分子作用機理是在IRF2 基因轉(zhuǎn)錄后水平上抑制細胞天然免疫功能而發(fā)生的。4 傳染性法氏囊病病毒感染對雞細胞模式識別受體及抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響為研究傳染性法氏囊病病毒 (IBDV) 感染對雞細胞模式識別受體 (PRRs)

9、及天然免疫抗病毒基因轉(zhuǎn)錄的影響 , 本實驗分別用 IBDV 弱毒感染 DT40細胞和強毒感染SPF雞, 以定量 PCR (qRT-PCR)檢測感染細胞和法氏囊組織中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和 LGP2)及天然免疫抗病毒基因 (IPS-1 、IRF3、PKR、OAS、Mx)的 mRNA轉(zhuǎn)錄變化。在 IBDV感染 DT40細胞的 2h 到 24h 內(nèi),chMDA5、chTLR3、chLGP2、 IRF3、 PKR、 OAS、Mx 的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升 , 分別為 324 、22、 61、 29、16、225 000 和 18 700倍。當用 siRNA 分別敲除 D

10、T40 細胞中 chMDA5、chTLR3 和 chLGP2 時,IPS-1 、IRF3、PKR、 OAS和 Mx在 IBDV感染后的 2h 到 24h 差異變化不顯著。在IBDV感染 SPF雞法氏囊組織細胞中 ,chMDA5和 chTLR3的表達顯著降低 , 而 chLGP2表達沒有顯著差異 ,IRF3 、 PKR、OAS和 Mx的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。TLR4和 TLR7在 IBDV的體外和體內(nèi)感染試驗中均未檢測到, 而 IPS-1 在 IBDV的體外和體內(nèi)感染試驗中均變化不顯著。本實驗結(jié)果表明,chMDA5、chTLR3和chLGP2在識別 IBDV的感染中起著關(guān)鍵作用 ,IBDV 感染嚴重

11、抑制了雞細胞模式識別受體 chMDA5和 chTLR3的轉(zhuǎn)錄 , 并且提示其抑制作用在體內(nèi)與體外可能存在不同的分子機制。5 gga-miR-142-5p 調(diào)控 chMDA5抑制傳染性法氏囊病病毒復(fù)制的機制傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病病毒引起的一種高度危害養(yǎng)雞業(yè)的傳染病。chMDA5在識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)及激活宿主的天然免疫應(yīng)答中具有重要的作用,但 chMDA5識別 IBDV 的分子機制仍然不清楚。本研究以 IBDV 為模式病毒 , 采用體外感染模式 , 在 IBDV 感染的 DT40細胞中 ,chMDA5的表達水平顯著升高。 chMDA5過表達可以抑制 IBDV 的復(fù)制 , 并激活I(lǐng)FN- promoter和 Mx promoter 活性 ,chMDA5抑制表達則得到相反的結(jié)果; 且chMDA5激活 IFN- promoter活性主要是通過 IRF7 通路 ; 表明 chMDA5可以激活雞體的抗病毒天然免疫反應(yīng)發(fā)揮抗IBDV 感染作用。用生物信息學(xué)方法和雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)gga-miR-142-5p 可以作用于 chMDA5的 3UTR; qRT-PCR和免疫印跡分析表明gga-miR-142-5p 可以使chMDA5的蛋白水平表達降低 , 但 mRNA水平?jīng)]有變化 ;gga-miR-