鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1的生物學(xué)特性及體內(nèi)具抗菌活性噬菌體篩選方法的建立

1、鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1 的生物學(xué)特性及體內(nèi)具抗菌活性噬菌體篩選方法的建立細(xì)菌對抗菌藥物耐藥性的不斷加劇嚴(yán)重威脅著公眾健康, 這是全世界共同關(guān)注的重大問題。尤其是鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌以及銅綠假單胞菌, 對所有常規(guī)使用抗生素全耐藥菌株的出現(xiàn), 使臨床醫(yī)生處于無藥可選的困境。更為嚴(yán)峻的是 , 目前處于臨床試驗階段的新抗菌藥物種類非常有限, 其中大多數(shù)仍是對傳統(tǒng)藥物的結(jié)構(gòu)修飾物。新型抗生素的研發(fā)遠遠落后于細(xì)菌耐藥性的變異。人們意識到 , 抗生素治療細(xì)菌感染的時代已接近終點, 尋找新的治療手段勢在必行。噬菌體以其殺菌特異性強, 、自然資源豐富、無毒無害以及易于生產(chǎn)和工程改造等優(yōu)點 , 為人類開發(fā)

2、新型抗菌藥物提供有效手段。然而 , 用噬菌體防治細(xì)菌感染就必須先從環(huán)境中分離篩選到能高效殺滅各種致病菌的噬菌體 , 并對這些噬菌體的生物學(xué)特性進行研究, 這是決定噬菌體治療成敗的基礎(chǔ)和前提。鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌, 因其耐藥性日趨嚴(yán)重 , 甚至已出現(xiàn)“全耐藥”菌株而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。但目前國內(nèi)外對鮑曼不動桿菌噬菌體的研究卻非常有限。本文采用鮑曼不動桿菌臨床分離株為宿主菌, 從環(huán)境中成功分離到一株全新的能夠高效裂解此菌的噬菌體 , 命名為 ZZl 。本文目的是研究噬菌體ZZ1 的生物學(xué)特性 , 包括基因組測序和全基因組生物信息學(xué)的分析。同時 , 通過觀察尾靜脈注射ZZ1 對

3、全身感染小鼠的治療效果來評價其應(yīng)用價值。本文為采用噬菌體制劑防治細(xì)菌感染奠定實驗基礎(chǔ)。材料與方法 1 鮑曼不動桿菌噬菌體 ZZ1 的分離及其生物學(xué)特性的研究采集污水樣品, 以鮑曼不動桿菌臨床分離株為指示菌分離噬菌體；挑取單個透明噬菌斑, 進行多次單斑分離以純化噬菌體；采用液體增殖和平板固體增殖的方法增殖噬菌體ZZ1；采用 PEG8000共沉淀、氯仿抽提的方法濃縮噬菌體ZZ1 顆粒；采用氯化銫密度梯度離心法純化噬菌體 ZZ1 顆粒；透射電鏡觀察噬菌體ZZ1形態(tài)；通過雙層平板法測定噬菌體ZZ1效價 , 調(diào)查噬菌體 ZZ1 的噬菌譜 , 并用通用引物擴增16s rRNA,測序后進行 Blastn比對

4、鑒定其宿主種類 , 繪制噬菌體 ZZ1 的一步生長曲線 , 檢測噬菌體 ZZ1 對溫度、pH等理化因素的穩(wěn)定性 , 測定噬菌體 ZZ1 殺滅其宿主菌的最佳溫度范圍。采用 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取噬菌體 ZZ1基因組；用DNase(RNase Free), RNase A (DNase Free)和 Hind 的酶解作用鑒定基因組類型；用 Covaris S220 將噬菌體 ZZ1DNA隨機打成約 500bp 長的片段 ,T4DNAPolymerase 、 Klenow Fragment 以及 T4PolynucleotideKinase 進

5、行 5末端的修平和磷酸化 , Klenow Fragment exo-進行 3末端加 A, T4DNA ligase連接通用接頭、PCR擴增構(gòu)建噬菌體 ZZ1測序文庫；Hiseq2000 上機測序 ,Velvet1.2.08進行序列拼接。 2 鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1全基因組生物信息學(xué)分析應(yīng)用GeneMarkS軟件和 fgenesVO軟件預(yù)測 ZZ1的蛋白編碼區(qū)； 采用本地 BlastP 對所預(yù)測到的基因進行功能預(yù)測, 利用 Batch CD-search 預(yù)測蛋白保守區(qū)；用ProtParam tool預(yù)測 ZZ1 蛋白的分子量和等電點；用DNAStar Lasergene7.1 軟件預(yù)測 Z

6、Z1 基因的 GC含量；用在線軟件 TMpred預(yù)測蛋白跨膜區(qū)；用 Mauve2.2.0和 CoreGenes3.5 分別在核酸水平以及蛋白水平進行全基因組比較分析；用GenSkew分析 ZZ1基因組 GC偏移和預(yù)測復(fù)制起點；用 tRNAscan-SE1.21和 ARAGORN進行 tRNA預(yù)測 ,Blastn對預(yù)測的 tRNA進行相似性比對； 密碼子偏嗜性分析采用EMBOSS (6.2.0) 軟件包中的 CUSP和 CAI 程序。3 鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1體內(nèi)失活因素及體外篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的建立及其初步評價調(diào)查小鼠體內(nèi)影響噬菌體ZZ1 活性的因素 , 包括采用噬菌斑減少中和試驗

7、檢測小鼠血清中是否存在能中和噬菌體ZZ1 的天然抗體；觀察分析噬菌體 ZZ1在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué), 明確網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對ZZ1活性的影響；比較噬菌體 ZZ1 在補體滅活血清以及補體未滅活血清中對其敏感宿主菌AB09V的殺滅作用 , 分析血清補體對 ZZ1 體內(nèi)抗菌活性的影響。選擇其他4 株新分離到的噬菌體 (F19、PG3、PG17和 L2), 體外實驗中觀察到他們分別可以特異性感染并高效殺滅 4 株不同的多重耐藥致病菌( 肺炎克雷伯菌 KP-19, 陰溝腸桿菌 EC3,陰溝腸桿菌 EC17和銅綠假單胞菌 PA2)。利用血清中噬菌體的殺菌實驗從這4 株噬菌體中初步篩選出可能具有治療作用的噬菌體

8、 , 進一步觀察血清中殺菌呈陽性的噬菌體通過尾靜脈注射后對全身感染致死量其宿主菌的小鼠的治療效果, 初步評價血清中噬菌體殺菌實驗篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的效果。 結(jié)果 1 鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1 的生物學(xué)特性噬菌體 ZZ1 在鮑曼不動桿菌 AB09V的菌苔上形成直徑為1-2mm的透明噬菌斑 , 表現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬斑特征； 透射電鏡觀察顯示ZZ1 有一個較長的二十面體立體對稱的頭部 ( 約 100nm長 80nm寬 ) 和一個可以伸縮的尾部 ( 約 120nm長), 此為有尾噬菌體目肌尾病毒科噬菌體的典型形態(tài)；噬菌譜調(diào)查結(jié)果顯示ZZ1 對本研究涉及的非鮑曼不動桿菌無裂解作用, 僅對 2

9、3 株鮑曼不動桿菌中的3- 株顯示裂解作用 , 在相同培養(yǎng)條件下 , 這 3 株宿主菌對 ZZ1 的敏感程度由大到小依次為AB09V.AB0901和 AB0902。一步生長曲線顯示ZZ1 感染 AB09V后其潛伏期約為 9min, 爆發(fā)量約 200PFU/細(xì)胞。理化因素穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明,ZZ1 可以耐受較寬的酸堿環(huán)境(pH4-9) 以及50和 60范圍的較高溫度。噬菌體 ZZ1在 35 39均可保持穩(wěn)定的最佳抗菌活性, 噬菌體 ZZ1 的基因組核酸不能被 RNase A (DNase Free) 降解 , 但可被 DNasel (RNase Free) 和 Hind降解 , 因此其基因組核酸

10、類型為dsDNA。對構(gòu)建好的噬菌體ZZ1基因組測序文庫進行雙端測序獲得總的讀長數(shù)目為937,400 個, 平均讀長為 250bp, 最后應(yīng)用velvet軟件拼接出一條長為166,801bp 的噬菌體基因組 , 其兩端帶有 114bp 的重復(fù)序列。2 鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1全基因組生物信息學(xué)分析ZZ1基因組非重疊序列全長 166,687bp, 平均 GC含量為 34.4%, 低于鮑曼不動桿菌GC含量 (38.9%39.2%)；ZZ1基因組共預(yù)測到256 個 CDS和 8 個 tRNA,基因組平均每 lkb 編碼 1.5個基因 , 基因密度約為 93.6%, 基因長度范圍為34aa1303aa,

11、 平均 203aa。 256個預(yù)測蛋白中 , 有 95 個(37.1%) 可注釋出功能 , 這些蛋白均是 T4-like蛋白 , 包括36 個噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白 ,21 個參與 DNA復(fù)制、重組、修復(fù)、包裝和加工處理的功能蛋白 ,11 個參與核酸代謝的蛋白 ,5 個參與噬菌體裝配調(diào)節(jié)的蛋白,7 個參與轉(zhuǎn)錄的蛋白 ,3 個參與翻譯的蛋白 ,3 個參與裂解宿主菌的蛋白,5 個參與關(guān)閉或改變宿主菌代謝的蛋白 ,2 個參與細(xì)菌與噬菌體相互作用的蛋白, 其余 2 個為移動元件。在 161 個功能未知的 ZZ1預(yù)測蛋白中 , 有 37 個具有跨膜區(qū) , 有 23 個具有保守的結(jié)構(gòu)域。其中 ZZ1 的 CDS0

12、11被預(yù)測出屬多重耐藥超家族 , 其編碼的蛋白具有四個跨膜區(qū)。此外 , 在 ZZ1 的基因組中并未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因和毒力因子。噬茵體ZZ1 與GenBank中其他 4 株不動桿菌屬噬菌體 (Acj9 、Acj61 、Ac42 和 133) 以及大腸桿菌噬菌體 T4 的比較基因組學(xué)研究揭示出11 組不同長度的局部同線塊(localcolinear block, LCB),其中有 7 組 LCB (>10kb) 為 6 株噬菌體所共有。BlastP 和 CoreGenes分析顯示： ZZ1 的預(yù)測蛋白中有 110 個( 占總基因數(shù)的43%)與 T4 蛋白具有顯著相似性 (Evalue<

13、10-6);ZZ1 與 Acj9 、Acj61 、133 以及 Ac42 含有的同源基因總數(shù)分別為179、164、157 和 143 個, 分別占噬菌體ZZ1總預(yù)測蛋白數(shù)的69.9%、64.1%、61.3%和 55.9%；這些結(jié)果表明ZZ1 與這 5 株噬菌體有共同的祖先 , 因此 , 噬菌體 ZZ1 屬于 T4-like噬菌體家族。 GCskew 預(yù)測結(jié)果顯示 ZZ1 的復(fù)制起點在 nt81009, 復(fù)制終點在 nt1 。其中復(fù)制起點與 8 個 tRNA所在的位置非常接近； ZZ1 編碼 tRNA的種類和數(shù)量雖與其他鮑曼不動桿菌編碼的tRNA均不同 , 但其 tRNA與他們編碼的 tRNA卻

14、有著不同程度的核酸序列相似性, 這些高度保守的 tRNA可能具有某些可通過垂直進化遺傳下來的重要的生物學(xué)功能。 此外 , 雖然 ZZ1編碼的 tRNA有一半以上 (5/8)攜帶的密碼子是噬菌體ZZ1 總蛋白高頻使用的密碼子, 但其他 4 株不動桿菌屬噬菌體的 tRNA所攜帶的密碼子與噬菌體本身高頻使用的密碼子一致的并不到總tRNA的 50%。3 鮑曼不動桿菌噬菌體ZZ1體內(nèi)失活因素及體外篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的建立及其初步評價噬菌體ZZ1對絕對致死量的 AB09V感染小鼠無治療效果(p>0.05)。ZZ1 體內(nèi)失活原因的研究調(diào)查結(jié)果顯示, 小鼠血清中不存在可中和噬菌體 ZZ1 的天

15、然抗體 ,ZZ1 的失活與小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對噬菌體的清除也無直接關(guān)系 , 但血清補體與 AB09V的相互作用完全抑制了ZZ1 的吸附活性 , 這是導(dǎo)致ZZ1 在小鼠體內(nèi)失去抗菌活性的主要原因。因此 , 體外觀察噬菌體在離體組織( 如血清、抗凝全血、或其他組織的勻漿)中的抗菌活性可作為篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體的有效方法。為初步評價在離體組織中噬菌體殺菌實驗篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的效果, 本實驗隨機選擇了 4 株新分離到的在體外能高效殺滅其敏感宿主菌的噬菌體(F19 、PG3、PG17和L2), 在小鼠血清中具有殺菌作用的噬菌體共3 株, 分別是 F19、PG3和 PG17。這 3 株噬菌體

16、對全身感染絕對致死量細(xì)菌的小鼠的治療結(jié)果表明, 感染小鼠1 周內(nèi)的存活率在F19 噬菌體治療組為100%(8/8), 在 PG3噬菌體治療組為87.5%(7/8),在 PG17噬菌體治療組為87.5%(7/8) 。3 株噬菌體在小鼠各臟器對其敏感宿主菌的殺滅實驗結(jié)果顯示, 噬菌體治療組小鼠各組織臟器含活菌量與無噬菌體治療對照組相比均有明顯降低(p<0.001)。此外 , 熱滅活噬菌體對感染小鼠均無治療作用( 存活率為 0%,0/8), 小鼠各組織臟器含菌量與無噬菌體治療對照組相比也均無明顯變化(p>0.05),說明小鼠各臟器活菌數(shù)的減少與噬菌體的非特異性免疫增強作用無關(guān)。這些結(jié)果均證明：3 株血清中殺菌呈陽性反應(yīng)的噬菌體通過尾靜脈注射后對全身感染絕對致死量其宿主菌的小鼠具顯著治療效果。此結(jié)果初步證實了本研究所建立的在離體組織中噬菌體的殺菌實驗篩選體內(nèi)具抗菌活性噬菌體方法的有效性。結(jié)論1. 噬菌體 ZZ1是一株有尾噬菌體目肌尾病毒科的裂解性噬菌體。鮑曼不動桿菌 AB09V是其最為敏感的宿主菌 , 在其菌苔上形成直徑為1-2mm的透明噬菌斑 , 感染潛伏期為 9min, 爆發(fā)量為 200PFU/cell;ZZ1 在極端溫度和極端 pH 的環(huán)境下具有較強的穩(wěn)定性, 在 35 39均可顯示最佳的抗菌