應用微生物：第三章 第一講 現(xiàn)代生物農藥

1、第三章 微生物現(xiàn)代農業(yè),第一講 現(xiàn)代生物農藥,生物農藥的興起 生物農藥：生物體產(chǎn)生的、具有防治病蟲害和雜草功能的一類物質的總稱。 主要種類： 微生物殺蟲劑（殺蟲除害） 農用抗生素（殺菌除?。?微生物除草劑（利用病原微生物除雜草,生物農藥優(yōu)點： 對人、畜及害蟲天敵無毒害 對病蟲害作用特異性 易生物降解、不長期滯留、不積累 “綠色生物農藥” 缺點： 殺滅病蟲害窄譜 見效慢，有時比化學農藥貴 微生物農藥發(fā)展方向： 用DNA重組技術改造生物農藥，提高殺蟲滅病活性，使其廣譜，降低成本,第一節(jié) 細菌殺蟲劑,一、微生物殺蟲劑的類型 細菌殺蟲劑 真菌殺蟲劑 放線菌殺蟲劑 病毒殺蟲劑 二、細菌殺蟲劑 芽孢桿菌屬

2、(Bacillus) 昆蟲病原菌90多種，分布 腸桿菌屬(Enterobacter) 假單胞菌屬(Pseudomonas,各種殺蟲劑的機理、類型都不盡相同,三、最重要的細菌殺蟲劑 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuriengiensis, Bt) 1、Bt殺蟲因子 營養(yǎng)細胞分泌殺蟲蛋白(VIP) 芽孢 外毒素(分泌胞外)，個別亞種產(chǎn)生 內毒素(伴胞晶體)，被昆蟲幼蟲吞食后, 在其腸道內轉化為殺蟲毒素 2、Bt對昆蟲致病機制,Bt,營養(yǎng)細胞(vegetative cell,芽孢,昆蟲吞食,腸道萌發(fā),大量Bt,穿透腸壁進入血液,昆蟲敗血癥,伴胞晶體(無毒性,昆蟲吞食腸道內pH7.58.0,前

3、毒素(2.5105,巰基 乙醇還原酶,VIP,外毒素(有的菌株) (分泌胞外) 腺嘌呤核苷酸衍生物 RNA聚合酶競爭性抑制,干擾昆蟲發(fā)育 干擾激素合成,SH,SH,SH,SH,兩個亞基分子(1.3105,特異性蛋白酶,幼蟲發(fā)育畸形 幼蟲不正常化蛹 對人畜有毒性 產(chǎn)生外毒素的菌株不能作為生物農藥 外毒素非選擇性毒性,SH,SH,活性毒素分子(6.8104,ATP,Na,活性毒素分子,在膜受體插入,離子通道,鱗翅目幼蟲,小腸上皮細胞,昆蟲停止進食 脫水死亡,伴胞晶體蛋白或原毒素轉化為活性毒素分子的條件： 堿性條件pH 7.58.0 對原毒素分子進行化學修飾特異性蛋白酶只有昆蟲幼中腸道內有此條件，并

4、有活性毒素分子特異受體 活性毒素分子只對特異性昆蟲幼蟲有毒害，對人畜無毒害（伴胞晶體蛋白為選擇性毒性,3. Bt亞種對昆蟲的致毒譜 Bt對昆蟲致病主要是內毒素 “殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal protein):Icp” 以色列亞種：對雙翅目(蚊子幼蟲)致毒 庫斯塔克亞種：對鱗翅目(蛾、蝴蝶幼蟲)致毒 擬象行亞種：鞘翅目(馬鈴薯瓢蟲、棉象蟲)致毒 4. Bt殺蟲晶體蛋白(Icp)的多樣性及分類 按昆蟲致毒特異譜分類： Cry：對鱗翅目致毒 Cry：對鱗翅目、雙翅目致毒 Cry：對鞘翅目致毒 Cry ：對雙翅目致毒,殺蟲晶體蛋白亞類： CryA, CryB晶體蛋白氨基酸序

5、列不同 CryAa, CryAb a.b表示基因核苷酸序列略有差異 5.殺蟲晶體蛋白的結構域 Cry殺蟲晶體蛋白分子的結構域,I,III,II,receptor,II,III,I,所有Bt殺蟲晶體蛋白皆有相同結構域，以形成膜離子通道，而識別、親和受體結構域（II、III）不同，呈現(xiàn)昆蟲致毒特異性,6 殺蟲晶體蛋白對昆蟲幼蟲腸道致病,二. 在營養(yǎng)期表達殺蟲毒蛋白工程菌株,plasmid,毒性蛋白基因,蠟狀芽孢桿菌質粒 promotor terr基因表達組成型啟動子,Bt營養(yǎng)細胞,生活史全過程皆表達殺蟲晶體蛋白,導入,導入,不形成芽孢的Bt突變體細胞,生活史中不形成芽孢，全過程表達殺蟲晶體蛋白 合

6、成效率高，表達量高,融合蛋白供檢測用，使用時能切下剩下的蛋白,P-aiz毒素基因-ten毒素基因,轉化,E.coli-Bt 穿梭質粒,Bt subsp isr,陽性轉化子 殺蟲譜：殺白菜粉蝶、殺甲蟲、滅蚊,三. 擴大殺蟲譜工程菌株,Bt subsp aizawai（鳣澤亞種） 殺鱗翅目害蟲 Tenebrionis（擬步甲） 殺鞘翅目害蟲 Israelensis （以色列） 殺雙翅目害蟲,四. 滅蚊工程菌株,五. 轉基因抗蟲植物,Bt毒性蛋白對寄生植物體內或根部害蟲無殺滅作用 將Bt毒蛋白基因轉入植物 載體：Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) 土壤農桿菌（Ag

7、robacterium tumerfaciens,含Ti質粒土壤農桿菌讓植物致病過程,含Ti質粒土壤農桿菌讓植物致病過程,農桿菌侵染植物第一步：吸附于植物表面?zhèn)?在植物傷口分泌的乙酰丁香酮、-羥基乙酰丁香酮的作用下，農桿菌從傷口進入植物,乙酰丁香酮,羥基乙酰丁香酮,酚類小分子物質誘導vir基因表達vir基因表達產(chǎn)物誘導TDNA單鏈拷貝 TDNA單鏈在vir基因產(chǎn)物協(xié)助下整合進入植物細胞核染色體 TDNA細胞分裂素基因、生長素基因在植物細胞過量表達，誘發(fā)冠癭瘤形成 冠癭瘤合成分泌冠癭堿，作為農桿菌在植物體內生長的碳源和氮源，土壤農桿菌利用Ti質粒和植物形成寄生關系，并用獨特機制操縱植物細胞 T

8、i質粒作為向植物細胞轉移外源基因的載體 可行性： TDNA片段在vir基因表達產(chǎn)物協(xié)助誘導下，可單鏈復制，并轉移插入植物細胞核染色體。TDNA可作為插入外源基因轉入植物細胞載體,其它抗蟲基因,由于每種抗蟲基因都有各自的局限性，所以發(fā)現(xiàn)新的抗蟲基因并按需要整合共表達是一種必要的策略。 抗真菌的殼多糖酶（chiitinase）和核糖體滅活蛋白 (RIP) 基因產(chǎn)物也具有抗蟲效果。另外，從胡蜂、蝎子、蜘蛛毒液中分離到的小肽（3040Aa）也具抗蟲效果。 非蛋白類殺蟲物質：澗樹中的殺蟲印苦澗子素(azadirachtin) 許多水果和蔬菜存在非蛋白物質檸烯（limonene），轉入它們的合成酶,六、轉

9、基因殺蟲微生物,根際害蟲咬食植物根部，將Bt毒蛋白基因轉移根際微生物，并大量繁殖,失活Tn5,Bt毒蛋白基因,plasmid,導入,染色體,P.fluorescens,自溶,害蟲吞食,攜帶Bt殺蟲毒蛋白基因工程菌株，根際害蟲幼蟲吞食工程菌,P.fluorescens,利用該方法殺滅煙草天蛾幼蟲已經(jīng)成功應用！ 但是，Bt毒性蛋白對光敏感，光照會失去殺蟲活性。 美國Mycogen公司發(fā)明的“生物微束化技術”能解決這一問題,P. fluorescens Bt殺蟲毒蛋白工程菌株,發(fā)酵工程增殖細胞,毒蛋白,加熱與碘液處理殺死細胞,細胞壁作微束,微束包裹毒蛋白,生物微束化殺蟲劑 抗光能力大大加強，有效殺蟲

10、期延長兩周,第二節(jié) 病毒殺蟲劑,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)昆蟲病毒1200多種 中國分離昆蟲病毒200多種 昆蟲病毒包涵體：單個或幾個昆蟲子代病毒包埋在由蛋白質組成由一定形態(tài)的包涵體內而釋放 在體外昆蟲病毒以包涵體形式存在,一、用作殺蟲劑的主要昆蟲病毒,1、核型多角體病毒（NPV，nucleopolyhedrosis virus,病毒：桿狀、雙股DNA、核內組裝 染色體：多角形、內包幾個病毒 寄主昆蟲：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、脈翅目,2、顆粒體病毒（GV，granulosis virus,病毒：桿狀、雙股DNA、核或質內組裝 包涵體：圓形、包裹一個病毒 寄主昆蟲：鱗翅目,3 質型多角體病毒（CPV, cytopl

11、asmic polyhedrosis virus,病毒：二十面體、單股DNA、胞質內組裝 包涵體：多角形、內包幾個病毒 寄主昆蟲：鱗翅目、等翅目,4 昆蟲病毒對寄主昆蟲致毒作用 自然條件下所有昆蟲病毒主要靠幼蟲取食感染 在幼蟲腸道內包涵體被堿性消化液溶解，釋放活性病毒侵染中腸上皮細胞（NPV）或脂肪體等敏感組織細胞（GV）。幼蟲死亡，釋放子代包涵體病毒,二、昆蟲病毒殺蟲劑工業(yè)化生產(chǎn),棉鈴蟲NPV制劑生產(chǎn)工藝 1、棉鈴蟲幼蟲工業(yè)化飼養(yǎng)與繁殖 棉鈴蟲幼蟲人工飼料： 黃豆粉（熟）20g、玉米粉30g、大麥粉30g、Vc 1g、干酵母 8g、棉油 0.5ml、50,醋酸6ml、甲醛0.8ml、苯甲酸鈉

12、0.5g、瓊脂3.5g、水180ml,消毒滅菌 成蟲 卵 幼蟲 蛹 成熟幼蟲 幼蟲 2、幼蟲人工感染NPN 3-4齡棉鈴蟲幼蟲 幼蟲感染NPN 釋放子代NPN(每頭病蟲均產(chǎn)40-60億個多角體顆粒) 再感染幼蟲 NPN大量增殖,孵化,3-4天,5-6天,1-2天,4-5天,12-14天,加有NPN,飼料喂養(yǎng),3、收獲NPN 含NPN蟲殘體與殘粒 過篩 加水 離心 上清NPN 誘餌劑:引誘幼蟲吞食NPN 保護劑:活性炭和熒光素鈉(抗U.V) 增效劑,4、殺蟲劑型配制,5、NPV或GV等桿狀病毒殺蟲劑的主要缺陷 殺蟲慢：蟲死亡需要幾天或幾星期 殺蟲譜窄：寄主昆蟲專一性強 毒力低：野外條件下易失活,

13、三、用DNA重組技術改造桿狀病毒殺蟲劑 1、引入外源毒蛋白基因增強桿狀病毒毒性 導入北非蝎子昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因,P 多角體蛋白基因,EcoR I,EcoR I,桿狀病毒DNA,EcoR I,EcoR I,EcoR I,質粒插入,plasmid,重組,質粒序列,側翼病毒序列,Bal3修飾,多角體蛋白基因,P,北非蝎子神經(jīng)毒素基因,重組,質粒序列,側翼病毒序列,側翼病毒序列,同源重組,攜帶神經(jīng)毒素重組桿狀病毒,感染昆蟲細胞,子代桿狀病毒（無多角體）表達昆蟲特異性毒素，昆蟲麻痹死亡,用蒲氏螨（pyemotes tritisi）神經(jīng)毒素結構基因取代桿狀病毒多角體蛋白基因，第一個應用成功重組病毒，重

14、組病毒喂養(yǎng)大蠟螟幼蟲，死亡率較野生型病毒提高55。 2、改變昆蟲正常生長周期的重組桿狀病毒 孵化幼蟲 成熟幼蟲 昆蟲保幼激素活性高：幼蟲階段長，對作物危害大 活性低：幼蟲階段短，對作物危害小 甲酯型保幼激素 利尿激素和抗利尿激素（調節(jié)體內水平衡） 利尿激素基因 煙草天蛾,昆蟲保幼激素控制,縮短幼蟲期與進食期，降低對作物危害，重組桿狀病毒只限于一齡幼蟲感染，對晚齡幼蟲效果不顯著,煙草夜蛾,分離、純化出保幼激素酯酶,氨基酸測序,引物合成,以其染色體DNA為模板,PCR擴增,保幼激素酯酶基因,P,重組桿狀病毒DNA,感染,白菜金翅葉蛾的一代幼蟲,3、對桿狀病毒基因組進行修飾和加工 不同種野生型桿狀病

15、毒之間存在許多同源序列每一種桿狀病毒有寄主專一性相關基因 兩種野生型桿狀病毒在某些特殊情況下感染同一宿主,苜蓿銀蚊蛾NPV,宿主專一性基因,甜菜夜蛾NPV 宿主專一性基因,可侵染甜菜夜蛾幼蟲和苜蓿銀蚊蛾幼蟲,重組桿狀病毒擴大抗蟲譜,第三節(jié) 真菌殺蟲劑,昆蟲病源真菌最多：60以上，750多種 孢子傳播易導致昆蟲真菌病流行 孢子可在昆蟲體內萌發(fā)侵染，也可通過取食 致病真菌分布： 接合菌亞門：蟲霉目 半知菌亞門：絲孢目,主要昆蟲病原真菌及常見寄生宿主,蟲 霉 目,蟲霉屬 蟲疫霉屬 耳霉屬 團孢霉屬,蚜蟲、蠅、蝗蟲、燈蛾、金龜子 蚜蟲、葉蟬、金龜子 蚜蟲 蟬,半 知 菌 亞門,絲 孢 目,白僵菌屬 綠

16、僵菌屬 擬青霉屬 頭孢菌屬 野村菌屬 枝孢霉屬 鐮孢菌屬,鱗翅目、半翅目、鞘翅目 直翅目、半翅目、鞘翅目 直翅目、半翅目、鞘翅目 蚜蟲、蚧殼蟲 鱗翅目 蚧殼蟲 蚜蟲、棉鈴蟲、葉蟬、褐飛虱,蟲霉屬：蚜霉、蠅霉、蝗蟲霉等統(tǒng)稱蟲霉屬 蟲霉屬生活史（殺蟲過程,昆蟲體壁,菌絲,結合孢子,休眠,分生孢子梗（孢束梗,無性孢子,萌發(fā),有性孢子,萌發(fā),蟲霉菌以宿主昆蟲為營養(yǎng)物進行生長繁殖，無性孢子、有性孢子在昆蟲體表萌發(fā)，菌絲進入體內，菌絲生長在昆蟲體內,原生質球,原生質球,2、“僵病”真菌殺蟲劑 絲孢菌目：白僵菌（Beauveria bassiana） 綠僵菌（Metarhizium anisopliae）

17、白僵菌：主要真菌殺蟲劑，先分泌白僵菌素殺死宿主昆蟲，后在蟲體內生長繁殖而變成白色僵蟲，目前應用最廣的昆蟲病原真菌。 白僵菌能侵染的宿主：鱗翅目、直翅目、同翅目、鞘翅目，以及螨類,菌絲體,芽生孢子 節(jié)孢子 內生孢子 分生孢子梗 分生孢子,單倍體丟失,單倍體化,二倍體核,準性生殖,無性生殖,要經(jīng)過特殊的誘導才能實現(xiàn) 大大加速了白僵菌的變異過程,子囊孢子,子囊,有性生殖,減數(shù)分裂,白僵菌用于防治松毛蟲、松針毒蛾、油桐蚜蟲、茶葉毒蛾、大豆食心蟲、楊樹天牛等害蟲，同時也能構感染家蠶 利用枝狀孢霉大面積防治突圓蚧； 大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)階段制備真菌制劑： 1、在適宜的溫度下在斜面上培養(yǎng)原始菌種（約10天） 2

18、、轉入液體搖瓶培養(yǎng)（約30天） 3、在固體培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)或進行液體深層發(fā)酵（約6天） 4、收集培養(yǎng)產(chǎn)物或發(fā)酵產(chǎn)物進行干燥處理 5、粉碎過篩 6、經(jīng)質量檢測后形成產(chǎn)品 固體擴大分生孢子；液體深層節(jié)孢子（產(chǎn)量高、但不耐干燥、易失活、儲藏不易,第四節(jié) 動物殺蟲劑 一、原生動物殺蟲劑 微孢子蟲：鱗翅目、直翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目、蜉蝣目的多種昆蟲。 蝗蟲微孢子蟲、行軍蟲微孢子蟲、云杉卷葉蛾微孢子蟲。 微孢子蟲可通過取食、皮膚或卵感染宿主。 二、線蟲殺蟲劑 新線蟲： 索線蟲,第五節(jié) 植物病害的微生物防治 植物致病菌（細菌、真菌、病毒等）導致植物病害，用微生物產(chǎn)生的抗生素或細菌素殺滅植物致病

19、菌。 機理： 1、拮抗作用，釋放化學物質 2、寄生作用：干擾抑制宿主正常生理活動 3、競爭作用：爭奪營養(yǎng)和生存空間 4、保護作用：外生菌根，保護少受病害侵染,一、農用抗生素 抗生素新門類：抑制或殺滅植物病原菌的農用抗生素，主要來源放線菌“streptomyces” 主要植物病害防治所需抗生素及其來源,二、 防治植物病蟲害的細菌素 細菌素：一種細菌的某些株系產(chǎn)生的、對該種細菌的另一些株系或關系較近的它種細菌有殺傷作用的抗菌物質。 Agrobacterium radiobacter K84 放線農桿菌K84菌株,分泌農桿菌素,酰嘌呤脫氧阿拉伯糖甘氨酸磷酸鹽（agrocin84） A. radiob

20、acter K84 菌劑，施與桃樹根際土壤，抑制A. tumefaciens，防治桃樹根癌病,agrocin 84為應用最成功的細菌素 多年施用A. radiobacter K84 菌劑，發(fā)現(xiàn)防治桃樹根癌病效果降低，為什么？ 研究發(fā)現(xiàn),conjugation,tra,A. Radiobacter K84,antiG,pAgK84,A. tumefaciens,經(jīng)接合轉移，A. tumefaciens獲得pAgK84，對agrocin84產(chǎn)生抗性,刪除pAgk84中的tra基因（5.7kb） A. radiobacterk 84菌劑：合成分泌agrocin84 pAgk84不能轉移。 第一個商品化的遺傳改造微生物殺菌劑Nogall,antiG,三、抗病的轉基因植物,1、抗病毒轉基因植物 植物的交叉保護作用。1