專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用-知識點總結(jié)

1、專題二 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 知識點2.1 微生物的實驗室培養(yǎng)1培養(yǎng)基是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。2. 培養(yǎng)基按物理性質(zhì)分為液體培養(yǎng)基（應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)）、固體培養(yǎng)基（應(yīng)用于微生物的分離和鑒定）和半固體培養(yǎng)基（常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等）。按成分分為合成培養(yǎng)基（用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，成分種類比例明確，用于微生物的分離鑒定）和天然培養(yǎng)基（用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，用于實際工業(yè)生產(chǎn)）。按用途分為選擇培養(yǎng)基（加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要微生物生長，促進所需微生物的生長）和鑒別培養(yǎng)基（根據(jù)微生物的特點，加入

2、某種指示劑或化學(xué)藥品，來鑒別不同類別的微生物）。3.培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括：水、無機鹽、碳源、氮源和生長因子等。碳源包括CO2、NaHCO3等無機碳源和糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。氮源包括N2、NH3、NO3-、NH4+等無機氮源和蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨等有機氮源。只有固氮微生物才能利用N2。4.培養(yǎng)基還需滿足pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的要求。例：培養(yǎng)乳酸桿菌需添加維生素；培養(yǎng)霉菌需將pH調(diào)至酸性；培養(yǎng)細菌需將pH調(diào)至中性或微堿性；培養(yǎng)厭氧型微生物需提供無氧的條件。5.無菌操作技術(shù)包括：對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和

3、消毒。將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。6.消毒與滅菌的區(qū)別是：消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子），包括煮沸消毒法，巴氏消毒法 （酒精、氯氣、石炭酸）和紫外線消毒法。滅菌指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子，包括灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。7.滅菌方法：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；培養(yǎng)基、無菌

4、水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈 。8.制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（1）方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。（2）倒平板操作的步驟包括：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在酒精燈火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。將錐形瓶的瓶口迅速通過火焰（灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基）。將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，再將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約1020mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。等待平板冷卻凝固然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上（目的：使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培

5、養(yǎng)基，造成污染）。9.倒平板時若不慎將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底上，則這個平板不能用來培養(yǎng)微生物，原因是空氣中的微生物會在皿蓋與皿底上生長。10.純化大腸桿菌的原理是：用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種，使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落（生態(tài)學(xué)上稱種群），以達純化菌種的目的。11.平板劃線操作時第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)的原因是：前者避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物，后者殺死上次劃線殘留在環(huán)上的菌種，使菌種逐漸變少以便得到單個菌落。在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)的原因是及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。在灼燒接種環(huán)之后，

6、要等其冷卻后再進行劃線的原因是避免接種環(huán)溫度太高而殺死菌種。12.涂布平板操作的步驟包括：將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻810s。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。13.菌種的保存：頻繁使用，臨時保存接種到固體斜面培養(yǎng)基，在4下保存。長期保存菌種用甘油管藏的方法。2.2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1.尿素是重要的農(nóng)業(yè)氮肥，不能直接被植物吸收。土壤中有一類細菌能合成脲酶，將尿素分解成氨，被植物吸收利用。尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的。2.實驗室中微生物篩選的原理是：人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營

7、養(yǎng)、溫度、PH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。3.在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。4.測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。5.稀釋涂布平板法常用來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。原理是：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準確，一般選擇3-5個菌落數(shù)在30300

8、的平板進行計數(shù)，并取平均值。6.統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上看到的只是一個菌落，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。7.設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。8.實驗設(shè)計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。9.土壤取樣：鏟去表層土，在距地表約38cm的土壤層從富含有機物、潮濕、pH7的土壤中取樣。10.

9、樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍（細菌一般選用104、105、106；放線菌一般選用103、104、105；真菌一般選用102、103 、104）的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板。11.不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30-37 1-2天；放線菌25-285-7天；霉菌25-283-4天。12.每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、唯獨及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌

10、落特征（形狀、大小、隆起程度和顏色基本一致）13. 每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V） M （C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml）；M：代表稀釋倍數(shù)）14.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑變紅，可初步鑒定該種細菌能分解尿素為氨。2.3 分解纖維素的微生物的分離1.纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。2.纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維

11、素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。3.當在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，它能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈就可以來篩選纖維素分解菌，這種方法叫做剛果紅染色法。4.剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理：剛果紅（染料）可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。5.實驗流程：土壤取樣選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定）梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

12、挑選產(chǎn)生透明圈的菌落6.為確定得到的是纖維素分解菌，需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。7.由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。8.將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。9.剛果紅染色法種類：一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)；另一種是在倒平板時就加入剛果紅。前者的缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物