生物化學：02蛋白質(zhì)化學4

1、第五節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),一、 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。 * 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 顆粒表面電荷 水化膜,水化膜,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜,利用透析(dialysis)可以把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開,二、蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)和等電點,蛋白質(zhì)的兩性電離 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI) 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負

2、離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點,蛋白質(zhì)分子中的可解離基團,幾種蛋白質(zhì)的等電點,每種蛋白質(zhì)都有其特有的等電點分離、鑒定 等電點和蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸的種類有關(guān),三、 蛋白質(zhì)的變性作用和復性,蛋白質(zhì)的變性(denaturation) 在某些物理和化學因素作用下，蛋白質(zhì)三維構(gòu)象被破壞，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。變性的本質(zhì)是次級鍵的破壞（包括二硫鍵），不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),導致蛋白質(zhì)變性的因素,物理因素：加熱、高壓、劇烈攪拌、超聲波、紫外照射等 化學因素：酸、堿、有機溶劑（苯酚、乙醚等）、變性劑（尿素、鹽酸胍等）、去垢劑（SDS ：十二烷

3、基硫酸鈉,蛋白質(zhì)溶解度下降或易于沉淀。 變性使得埋藏在分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團暴露 出來，易被蛋白酶水解。 變性使得蛋白質(zhì)的生物活性喪失,變性蛋白質(zhì)的特性,蛋白質(zhì)復性(renaturation,變性蛋白在去除變性因素后可重新恢復到天然構(gòu)象，恢復其生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復性,四、蛋白質(zhì)的沉淀（ protein precipitation,蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性受到破壞，蛋白質(zhì)從溶液中析出的特點。分為可逆沉淀作用和不可逆沉淀作用,可逆沉淀作用,蛋白質(zhì)沉淀后除去蛋白沉淀因素（透析）恢復溶解狀態(tài) 鹽溶作用：多數(shù)蛋白質(zhì)在稀鹽中溶解度增加 鹽析作用：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量鹽（硫酸銨）蛋白質(zhì)溶解度逐漸下降,

4、不可逆沉淀作用,重金屬沉淀：堿性條件下：氨基酸-重金屬離子+ 生物堿試劑（可引起生物堿沉淀的試劑）沉淀：酸性條件下：氨基酸+酸根- 有機溶劑沉淀：脫水；降低介電常數(shù) 加熱變性沉淀：變性、凝固,五、蛋白質(zhì)的紫外吸收,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定,第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化和測定,一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,材料的選擇（新鮮、目的蛋白含量高） 分離過程中避免一切可能引起變性的條件 蛋白質(zhì)的純化一般在低溫下進行（4oC） 分離前建立有效的檢測方法 了解目的蛋白的特性（穩(wěn)定性） 蛋白的儲存

5、：-20oC 或4 oC， 冷凍干燥，避免反復凍融,二、蛋白質(zhì)分離純化的基本步驟,1. 細胞破碎 機械破碎（勻漿、 研磨、組織搗碎等）； 滲透壓法 ； 凍融法 ； 超聲波法 ； 酶解法等,2. 蛋白質(zhì)的抽提,分離蛋白質(zhì)與細胞其他組分 選擇合適的抽提液，包括：pH、離子強度、及其它組分（還原劑、酶抑制劑、SDS、Triton） 避免蛋白質(zhì)變性,3. 蛋白質(zhì)的分離分離目的蛋白與雜蛋白,等電點沉淀法：蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最??；不同蛋白質(zhì)等電點不同 鹽析法：不同蛋白質(zhì)對中性鹽濃度變化的反應不同；常用中性鹽為(NH4)2SO4、NH4Cl等 有機溶劑沉淀法：降低介電常數(shù)；破壞水化層；常用乙醇、丙酮,4

6、. 蛋白質(zhì)的純化,蛋白質(zhì)分離純化主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)、電荷情況、等電點、分子的大小、形狀、溶解度、穩(wěn)定性、吸附性質(zhì)（包括與其它小分子的親合力等）以及蛋白質(zhì)的光吸收性質(zhì)（280 nm）等,1）凝膠過濾(gel filtration,凝膠過濾色譜亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。凝膠色譜的機理是分子篩效應,凝膠過濾的作用機制,常用凝膠,葡聚糖凝膠（商品名Sephadex） 聚丙烯酰胺凝膠(商品名Bio-GelP) 瓊脂糖凝膠(商品名因生產(chǎn)廠家而 不同,凝膠過濾的過程,凝膠過濾的要點,根據(jù)分離樣品分子量，選擇合適的介質(zhì)：Sephade

7、x G-50分子量范圍150020000 ; Sephadex G100 分子量范圍4000-150000 柱床要用緩沖液平衡穩(wěn)定（體積、流速、可反復使用） 上樣量體積不能大,2）離子交換層析（ion exchange chromatography,離子交換層析法是利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。電荷不同的蛋白質(zhì)，對離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質(zhì)就能依次從層析柱中分離出來,支持介質(zhì)（纖維素、凝膠等） 交換劑類型：陰離子交換劑、陽離子交換劑 常用陽離子交換劑羧甲基纖維素（CM-C）；陰離子交換劑二乙氨基乙基纖維素（DEAE-C,3）親和層析,利用目的蛋白跟它

8、的固相化的配基之間的特異親和力來跟其他蛋白分開的,配基（ligand）選擇,抗原抗體，酶抑制劑，酶底物， 激素受體，金屬結(jié)合蛋白螯和劑， 含巰基蛋白Hg或含巰基分子， 凝集素糖蛋白,配基的偶聯(lián),三、蛋白質(zhì)分子量的測定,1.凝膠過濾法 Vo=外水體積 :柱床中凝膠顆粒外空隙間水體積 Ve=洗脫體積,外,2. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE,電泳:蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elctrophore

9、sis),聚丙烯酰胺凝膠,丙烯酰胺+雙丙烯酰胺三維網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu),TEMED：四甲基乙二胺 AP：過硫酸銨 Acr：丙烯酰胺,Acr：丙烯酰胺 Bis：雙丙烯酰胺,十二烷基硫酸鈉,SDS的作用 SDS與蛋白分子成比例結(jié)合帶負電荷復合物，消除不同蛋白間原有電荷差,3. 超速離心,超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。 高速：25000rpm 超速：50000-120000rpm,四、蛋白質(zhì)的純度鑒定,1. 電泳,等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF,通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分 離蛋白質(zhì)的電泳方法。pH梯度以兩性電解質(zhì)ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形