分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義掌握質(zhì)粒DNA小量快速提取法；了解 DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定原理。質(zhì)粒( plasmid )是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子。其分子量大小在1200kb之間。是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA分子，質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌 細(xì)胞中，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳 信息。質(zhì)粒一般獨(dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可整合到細(xì)菌染色體中，它離開宿主的細(xì)胞就不能 存活，而它控制的許多生物學(xué)功能卻賦予宿主細(xì)胞某些表型。所有分離質(zhì)粒DNA勺方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和 裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁

2、，十二烷基硫酸鈉( Sodium dodecylsulfate, SDS )可使細(xì)胞壁裂解。細(xì)菌經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑( SDS處理 后，細(xì)菌 DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。再經(jīng)酒精沉淀、洗滌處理，可得到質(zhì)粒 DNA。共價(jià)閉環(huán) DNA( covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱 cccDNA 質(zhì)粒以超螺旋形式存在。若兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的 張力，這種松弛型的DNA分子叫作開環(huán) DNA( open circular DNA, 簡(jiǎn)稱ocDNA。在電泳時(shí)，同 一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，

3、它比其開環(huán)和線狀 DNA勺泳動(dòng)速度都快，因此在本 實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn) 3 條區(qū)帶。 限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)研究中的一種工具酶，這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí) 別雙鏈DNA分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi)，切斷DNA的雙鏈，形成一定長(zhǎng)度的 DNA片段。如：EcoRI和Hi nd?的識(shí)別序列和切口是：EcoR?： G?AATTCHind?： A?AGCTT限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒 DNA有多少切口，就能產(chǎn)生多少酶切片段，因此鑒定 酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷酶切口的數(shù)目，從片段的遷移率可以大 致判斷酶切片段大小的差別。用已知分子量的線狀 DNA為對(duì)照

4、，通過電泳遷移率的比較，就 可以粗略推測(cè)分子形狀相同的未知DNA的分子量。1主要設(shè)備 (Equipments)(1) 塑料離心管1.5mLX 30(2) 塑料離心管架X 1(3) 微量加樣器10卩L、100卩L、1 000 Z 各一支(4) 常用玻璃儀器及滴管等( 5)臺(tái)式高速離心機(jī)( 16 000r/min )(6) 電泳儀(7) 電泳槽(8) 樣品槽模板2材料 (Materials) ：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌3試劑 (Agents)(1) 溶液？： pH8.0 GET 緩沖液(50mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCl )；用前加溶菌酶 4mg/m

5、L。(2) 溶液？:1mol/L NaOH 40卩l(xiāng) , 5%SDS 40卩l(xiāng) ,蒸餾水120卩l(xiāng)，臨用時(shí)配 制。O) 2 (3)溶液？： pH 4.8 乙酸鉀溶液(60mL 5mol/L KAc, 11.5mL冰乙酸， 28.5mL H(4) 苯酚/氯仿(1?1, V/V):苯酚需在160?重蒸，加入抗氧化劑8-羥基喹 啉，使其濃度為 0.1%，并用 Tris-HCl 緩沖液平衡兩次。氯仿中加入異戊醇，氯仿 /異戊醇 ( 24?1， V/V)。(5) pH 8.0 TE 緩沖液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA 其中含有 RNA酶( RNase) 20卩 g/mLo(6)

6、 TAE電泳緩沖液：(7) DNA染色試劑Sybr Green或EB染色液：(8) 10X上樣緩沖液(9) DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(DNA Marker)1 培養(yǎng)細(xì)菌 (cultivation of bacteria)將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌于培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)2. 細(xì)菌中質(zhì)粒 DNA勺快速提起(Rapid Isolation of Plasmid DNA FromBacteria )(1) 取液體培養(yǎng)菌液1.5 mL置小離心管中，10 000r/min離心1min去掉上清 液。加入150卩L的溶液？，充分混懸細(xì)菌，在室溫下放置 10min。(2) 加入200 L新配置的溶液？。加蓋，顛倒5次使之混勻。

7、冰上放置5 min。(3) 加150yL冷卻的溶液？，加蓋后顛倒5混勻，冰上放置15 min。10 000r/min 離心 5 min ，上清液倒入另一離心管中。(4) 向上清液中加入等體積苯酚 /氯仿，震蕩混勻， 10 000r/min 離心 2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。(5) 向上清液中加入等體積無水乙醇，混勻，室溫放置2 min。離心5 min， 倒去上清乙醇溶液，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。(6) 加1mL 70匯醇，震蕩并離心，倒去上清液，晾干，加入20 L的TE緩 沖液，使DNA完全溶解，待用。3. 質(zhì)粒 DNA的限制酶切(Restriction Digestio

8、n of Plasmid DNA)取潔凈消毒 1.5ml 離心管 1 支，分別加入下列成分：自提樣品質(zhì)粒：10卩L10X酶切緩沖液：2卩L限制性內(nèi)切酶：24 u加雙蒸水至總體積20卩L,小心混勻，置于37?水浴中，酶解1h,反應(yīng)終止 后，各酶切樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆谩?. DNA瓊脂糖凝膠電泳(Agarose Gel Electrophoresis of DNA)(1) 瓊脂糖凝膠的制備：稱取 0.4g 瓊脂糖，置于三角瓶中，加入 50 mL TAE緩沖液，置微波爐加熱全部融化后，取出搖勻，此為 0.8%的瓊脂糖凝膠(2) 瓊脂糖凝膠板的制備：將膠模兩端用膠帶封閉，水平放置，插入上樣 梳。待瓊脂

9、糖凝膠液將冷卻至 65?左右時(shí)，小心倒入膠模中，使膠液緩慢展開，直到在整 個(gè)玻璃板表面形成均勻的膠層，室溫下靜置 20 min ，待凝固完全后，輕輕拔出上樣梳，在 膠板上即形成相互隔開的樣品槽。(3) 取3支1.5ml離心管，分別加入 DNA marker 10卩L、全部酶切 DNA未 酶切的質(zhì)粒DNA L,再向各管中加入上樣緩沖液 2卩L, Sybr Green 2卩L,混 勻。( 4)加樣：用微量加樣器將上述 3 種樣品分別加入凝膠樣品小槽內(nèi)。每次加 完一個(gè)樣品,要用蒸餾水反復(fù)洗凈微量加樣器,以防止相互污染。(5) 電泳加完樣品后的凝膠板，立即通電。樣品進(jìn)膠前，應(yīng)使電流控制在 20mA樣品

10、進(jìn) 膠后電壓控制在6080V,電流為4050 mA。當(dāng)指示劑色帶移動(dòng)至距離膠板12cm 處，停止電泳。(6) 將電泳后的膠板在紫外檢測(cè)儀下觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出綠色的熒光條帶。1 細(xì)菌染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離的主要依據(jù)是什么？實(shí)驗(yàn)二PCR技術(shù)及應(yīng)用PCR Technique and Its Applications掌握PCR基本原理和方法；熟悉PCF技術(shù)的應(yīng)用。（Principles）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction , PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的

11、分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCF由模板高溫變性、引物與模板退火和引物鏈沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA尋以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNAS高溫下（通常為93?-94?）使其變性為單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物（單鏈 DNA在其合適的復(fù)性溫度下分別 與待擴(kuò)增模板DNA勺兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的 長(zhǎng)短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72?將單核苷酸從引物的3端開始摻入，按5 ?3方向延伸，合成與DNA莫板互補(bǔ)的新鏈。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或 DNA片段，并能輕易在50100Z反 應(yīng)體積中，對(duì)皮克（pg

12、）級(jí)含量的目的基因擴(kuò)增得到微克級(jí)（卩g）的特異性DNA 片段。因此，PCF技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它 不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá) 調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸 多方面。1 主要設(shè)備 （Equipments）(1) PCF儀( 2)臺(tái)式高速離心機(jī)( 16 000r/min )(3) 微量加樣器10卩L、100卩L、1 000 Z 各一支( 4)電泳儀、電泳槽2材料 (Materials)(1) 薄壁反應(yīng)管0.2mLX 20(2) 塑料離心管架X 1( 4)

13、常用玻璃儀器及滴管等3試劑 (Agents)( 1 ) DNA 模版( 2)對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物(3) 2mM dNTPmix 含 dATP dCTP dGTP dTTP各 2mM (4) 10X PCR Buffer(5) Taq DNA聚合酶(6) DNA染色試劑 Sybr Green1 在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml 離心管中。10X PCR buffer 5 卩 ldNTP mix (2mM 4 卩 l引物 1 (10pmol)2 卩 l引物 2 (10pmol)2 卩 lTaq聚合酶 (2U/y l )1卩l(xiāng)DNA模板(1ng/ 卩 l )1 卩 l加ddH2O至

14、50卩l(xiāng)，稍加離心混勻。視PCF儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2 設(shè)定反應(yīng)程序，將上述混合液置 PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為93?預(yù)變性2min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93? 30s ? 58? 30s ? 72? 30s，循環(huán)20-25次，最后在 72? 保溫 5min。3.結(jié)束反應(yīng)，PCF產(chǎn)物放置于4?待電泳檢測(cè)或-20?長(zhǎng)期保存。4 . PCR勺電 泳檢測(cè)：取10卩1擴(kuò)增產(chǎn)物，加1卩l(xiāng) DNA染色試劑Syber Green，電泳檢測(cè)。在波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，觀察染色后的電泳膠板。DNA存在處顯示出綠色勺熒光條帶。(Cautions)1. PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA虧染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。2 .所有試