生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-酵母RNA的分離、組分鑒定及含量分析.ppt

1、,酵母RNA的分離、組分鑒定 及含量測(cè)定,1、掌握稀堿法分離酵母RNA的原理與操作過(guò)程。 2、了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。 3、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理和操作方法。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?為何選用酵母為材料提取RNA? 酵母核酸中主要是RNA(2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌體易收集，RNA易分離。 從酵母中提取RNA常用方法 稀堿法:利用稀堿使細(xì)胞壁溶解,時(shí)間短，但RNA易分解。 濃鹽法:加熱條件下，利用高濃度鹽改變細(xì)胞膜的通透性，使RNA釋放出來(lái)，產(chǎn)品色澤較好。 本實(shí)驗(yàn)用0.2% NaOH 使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀 RNA 。

2、,1. 核酸分離,原理,酶促水解 化學(xué)水解: 酸水解:堿基、核糖/脫氧核糖和磷酸 堿水解:RNA存在2-OH，磷酸二酯鍵不穩(wěn)定，得單核苷酸,核酸水解方法,2. 組分鑒定,RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶堿和磷酸組成，提取得的 RNA 中加10% 硫酸煮沸即可得到這些組分的混合溶液 （$），分別進(jìn)行定性鑒定，以證明提取物是否為核酸。,原理,磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀 (1mL $ + 1mL定磷試劑)： (NH4)2MoO4 + H3PO4 (NH4)3PO412MoO3(黃色) Mo6+ SnCL2 Mo4+ Mo(MoO4)2 (蘭色),嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物 (

3、1mL $ + 過(guò)量氨水 + 1mL 0.1M的AgNO3)。, 核糖與地衣酚(orcin)試劑反應(yīng)呈鮮綠色 (1mL $ + 1mL FeCl3 + 2mL orcin水浴加熱),3. RNA含量測(cè)定,核酸（DNA和RNA）堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收，吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處，蛋白質(zhì)則在280nm波長(zhǎng)處。 當(dāng)OD2601時(shí)，dsDNA濃度約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml 純DNA：OD260/OD2801.8 (1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 純RNA：1.7 OD260/OD2802.0 （1.7時(shí)

4、表明有蛋白質(zhì)或酚污染,可以增加酚 /氯仿抽提）,OD260/OD280的比值用于估計(jì)核酸的純度,OD260/OD230估計(jì)去鹽的程度。 對(duì)于RNA純制品，其OD260/OD2802.0，OD260/OD230應(yīng)大于2。 OD260/OD2302說(shuō)明去鹽不充分, 可以再次沉淀和70%乙醇洗滌。 濃度計(jì)算： DNA樣品的濃度（g / l）:OD260稀釋倍數(shù)50/1000 RNA樣品的濃度（g / l）：OD260稀釋倍數(shù)40/1000,1提取 稱取干酵母粉0.4g，放入試管中，加入0.2% NaOH 3mL，然后放入沸水浴中提取15min。 2分離 用自來(lái)水冷卻,滴加1-4滴醋酸，調(diào)pH至6.0

5、（沉淀蛋白質(zhì)），裝入離心管配平，3000r/min離心3min，（使提取液與菌體殘?jiān)蛛x）。 3抽提 收集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，3500r/min離心5min。 4沉淀RNA 收集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加2倍體積無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，配平，3500r/min離心5min，得到RNA沉淀。 棄去上清液（棄凈），一支離心管加5mL蒸餾水回溶，以備濃度測(cè)定；另一支離心管加入5mL 10%的 H2SO4,然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，待用。,操作步驟,注意配平、對(duì)稱放置離心管,RNA的酸解 將裝有待測(cè)RNA的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液透明為止，得到RNA的水解液，期間不停晃動(dòng)，以使

6、受熱均勻。 注意 RNA加熱酸解時(shí)，一定注意觀察，本步很容易加熱過(guò)度，使透明溶液變成黑褐色，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。,5.RNA的組分鑒定,.,組分鑒定 加蒸餾水將水解液稀釋至5mL，然后按下表檢驗(yàn)項(xiàng)目所需的量分裝三支試管中，進(jìn)行組分鑒定。,待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（如量取100L RNA水溶液，加2900L 蒸餾水混勻），用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定其230nm、260nm 和280nm 的吸光度值。 可根據(jù)自己的樣品濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)。 黑體透射調(diào)零 蒸餾水透射調(diào)100 吸收調(diào)零,.,6.RNA含量測(cè)定,注意保護(hù)石英比色皿，輕拿輕放！,配平：含液離心管與外套鐵管在一起兩組配平（先選兩個(gè)外套鐵管重量接近）對(duì)稱放于離心機(jī)的鐵套中。 設(shè)置：閉蓋，選離心機(jī)設(shè)置鍵（“亮點(diǎn)”在轉(zhuǎn)速和時(shí)間的選擇上：可通過(guò)三角符號(hào)移位，然后再增減），設(shè)置數(shù)都完成后再按確認(rèn)鍵。 啟動(dòng)：使“亮點(diǎn)”回到測(cè)定位置，按啟動(dòng)鍵。轉(zhuǎn)動(dòng)期間蓋子打不開(kāi)。 若聲音很大異常。立即按停止鍵。,離心機(jī)的使用,通過(guò)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明鑒定的結(jié)果，由結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明你的提取物是什么？ 計(jì)算RNA溶液濃度及酵母RNA得率，并判斷樣品純度。 將組分定性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果交老師過(guò)目