第三章食品微生物檢驗(yàn)的試劑及配制

1、,第三章食品微生物檢驗(yàn)的常用試劑及配制,了解染色的基本原理。 掌握常用染料的性質(zhì)及其染色的配制技術(shù)。 熟悉常用試劑、緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度的配制技術(shù)。 了解培養(yǎng)基的種類及一些常見培養(yǎng)基的用途，掌握一般培養(yǎng)基的配制技術(shù)。,第一節(jié) 染料及染液配制技術(shù),一、染色原理 微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué) 因素的作用而進(jìn)行的。 物理因素：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。 化學(xué)因素：正負(fù)離子之間的相互吸引等。,二、染料的種類,染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型： 1. 酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸等。 2. 堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠

2、、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 3. 中性（復(fù)合）染料：如伊紅美蘭等，瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等（常用于細(xì)胞核染色）。 4. 單純?nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudanb)的染料,染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法 染料,細(xì)菌染色用的染料 酸性染料（陰離子染料）：染色離子帶陰電荷，能與帶陽電的物質(zhì)結(jié)合，使之著色。降低菌液的pH而使細(xì)菌帶陽電時(shí)，就可用酸性染料染色。（伊紅、剛果紅） 堿性染料（陽離子染料）：與帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合，細(xì)菌一般帶負(fù)電，所以細(xì)菌染色所用的染料，常用堿性染料（堿性復(fù)紅、美藍(lán)）。 復(fù)

3、合染料：堿性染料與酸性染料的結(jié)合物（伊紅美藍(lán)、伊紅天青）。 單純?nèi)玖希翰荒芘c被染物生成鹽類,堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。因細(xì)菌蛋電質(zhì)等電點(diǎn)較低，當(dāng)它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用堿性染料(如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等)使其著色。 酸性染料的離子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH值下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。 中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。,三、常用染液的配制,1. 常用染料的溶解度 表3-1 2. 常用染料的配制,第二節(jié) 常用試劑的配制

4、技術(shù),一、緩沖液的配制技術(shù),二、物質(zhì)的量濃度溶液的配制技術(shù),1.溶液濃度表示法 2.物質(zhì)的量濃度溶液的配制方法 3.溶液 濃度的調(diào)整 4.常用酸堿的物質(zhì)的量濃度計(jì)算,三、pH指示劑的配制技術(shù),四、血清學(xué)反應(yīng)試劑制備技術(shù),血清學(xué)實(shí)驗(yàn)在第五章講解,五、生化試劑制備技術(shù)及試驗(yàn)法,什么是微生物生化試驗(yàn)? 指通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細(xì)菌的類別、屬種的試驗(yàn)。 由于細(xì)菌各自酶系統(tǒng)不同，新陳代謝的產(chǎn)物也有所不同，而這些產(chǎn)物又各具有不同的生物化學(xué)特性。為此，可利用生物化學(xué)的方法來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的細(xì)菌。,細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查法,1. 在培養(yǎng)物中加入某種底

5、物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基的pH值變化。 2. 在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細(xì)菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應(yīng)。 3. 根據(jù)酶作用的反應(yīng)特性，測定酶的存在。 4. 根據(jù)細(xì)菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細(xì)菌的生長情況。,生化試驗(yàn)的注意事項(xiàng),1.待檢菌應(yīng)是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18-24h。 2.待檢菌應(yīng)是純種培養(yǎng)物。 3.遵守觀察反應(yīng)的時(shí)間。觀察結(jié)果的時(shí)間，多為24或48小時(shí)。 4.應(yīng)做必要的對照試驗(yàn)。 5.提高陽性檢出率，至少挑取2-3個(gè)待檢的疑似菌落分別進(jìn)行試驗(yàn)。,生化試驗(yàn)分類 （一）糖（醇）類代謝試驗(yàn) （二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn) （三）有機(jī)酸鹽和銨鹽代謝試驗(yàn) （四）酶類試驗(yàn),（一）糖

6、（醇）類代謝試驗(yàn),1.糖醇類發(fā)酵試驗(yàn) 2.V-P試驗(yàn) 3.甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn) MR,1. 糖醇類發(fā)酵試驗(yàn),原理：不同的細(xì)菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解12種糖醇 ，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)這些特點(diǎn)，可鑒別細(xì)菌。,糖發(fā)酵試驗(yàn)原理,不同微生物發(fā)酵糖的能力各異，產(chǎn)生的分解產(chǎn)物也不同，可以作為細(xì)菌分類鑒定的手段。,大腸埃希菌/產(chǎn)氣腸桿菌,葡萄糖,CH3COCOOH,HCOOH,甲酸解氫酶,H2,+,CO2,傷寒沙門菌,葡萄糖,CH3COCOOH,HCOOH,指示劑：溴麝香草酚藍(lán)pH7.2(藍(lán)),舉例,常用的

7、糖醇,單糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 雙糖：乳糖、蔗糖、麥芽糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇類：甘露醇、山梨醇、肌醇、衛(wèi)茅醇,2）試驗(yàn)方法,(1)試劑：糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，常用的指示劑主要有 酚紅、溴麝香草酚藍(lán) 顏色反應(yīng)較敏感，但穩(wěn)定性較差。 溴甲酚紫和酸性復(fù)紅 比較穩(wěn)定，特別是對發(fā)酵遲緩的細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)間較長，宜選則二者。 (2)培養(yǎng)基：液體糖發(fā)酵管，半固體糖發(fā)酵管，固體糖發(fā)酵管，雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管。,2）試驗(yàn)操作方法,以無菌操作的方法將經(jīng)分離培養(yǎng)的純種細(xì)菌用接種針或環(huán)移取，接種于糖發(fā)酵管中，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。置361.0 置溫箱內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)一定

8、時(shí)間(數(shù)小時(shí)至二周)培養(yǎng)，然后每天觀察結(jié)果。,1.糖發(fā)酵試驗(yàn)要注意杜氏小管的置入方法； 2.在接種后，輕緩搖動(dòng)試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。,注意事項(xiàng),杜氏小管灌裝,灌裝不好會(huì)使杜氏小管中有氣泡，影響觀察結(jié)果。 首先將試管中裝滿培養(yǎng)液，然后用醫(yī)用注射器吸取一定量培養(yǎng)液，排空其中空氣，將針頭伸到杜氏小管底部(防止氣泡產(chǎn)生)，緩緩將培養(yǎng)液推入杜氏小管直到凸起(表面張力作用)，再至過量以至培養(yǎng)液潤濕杜氏小管外表，因培養(yǎng)液具有一定粘滯力，它可使?jié)駶櫟亩攀闲」苜N著試管放入時(shí)慢慢滑到試管底部，而不撞破試管底部。,氣泡,導(dǎo)管,氣泡,陽性,陽性,陰性,培養(yǎng)基變?yōu)辄S色,培養(yǎng)基未變色、無氣泡產(chǎn)生,結(jié)果記

9、錄： 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示 產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“”表示 不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示,2.V-P試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇 試驗(yàn)）,1）原理：某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。,V.P. 試驗(yàn)(伏普試驗(yàn)),用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。,某些細(xì)菌在糖代謝過程中，經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸。 因不同細(xì)菌所含酶不同，進(jìn)一步對丙酮酸的代謝也不同。,大腸埃希菌,產(chǎn)氣腸桿菌,VP試驗(yàn)陰性。,VP試

10、驗(yàn)（V）實(shí)驗(yàn)原理,舉例,應(yīng)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本試驗(yàn)常與MR試驗(yàn)一起使用，一般情況下，前者為陽性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細(xì)菌不一定都這樣規(guī)律。,2）V.P.試驗(yàn),取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，1號(hào)接種大腸桿菌，2號(hào)接產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌。 37培養(yǎng) 48h后，加入40%KOH 510滴，然后再加入等量的5%-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫30min，以加快反應(yīng)速度。 觀察培養(yǎng)基的顏色變化。,3）結(jié)果觀察與記錄 （1）發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者，為陽性， 記V-P+ （2）發(fā)酵管為黃色或銅綠色者，為陰性，記 V-P-,注意事項(xiàng),VP實(shí)驗(yàn)一定要注意開蓋振蕩

11、！且反應(yīng)時(shí)間較長。,中文名稱： 大腸埃希菌,菌株保藏編號(hào)： CVCC 3038 特征特性： 非抗酸性 化能異養(yǎng) 最適溫度37.pH7.27.4 不利用檸檬酸鹽 可發(fā)酵多種碳水化合物如：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇 接觸酶陽性、氧化酶陰性、脲酶陰性.MR試驗(yàn)陽性、VP試驗(yàn)陰性 屬名： Escherichia 種名加詞： coli,3.甲基紅（MR）試驗(yàn),1）原理：腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。為甲基紅試驗(yàn)陽性 ；有的細(xì)菌使丙酮酸

12、脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性。,檢測不同細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力。,大腸埃希菌,葡萄糖,產(chǎn)氣腸桿菌,指示劑：,分解,甲基紅pH5.4(橘黃色)。,甲基紅試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理,pH4.5,pH5.4,舉例,2）試驗(yàn)方法：,挑取新鮮的待試培養(yǎng)物少許，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，于361 或30 （以30 較好）培養(yǎng)35天，從第48h起，每日取培養(yǎng)液1ml，加入甲基紅指示劑12滴，立即觀察結(jié)果。,3）結(jié)果觀察與記錄,（1）呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+； （2）呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-，從發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，

13、即可判定結(jié)果。,MR-VP試驗(yàn)原理及照片,V-P,1.靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn) 2.H2S試驗(yàn) 3.尿素酶試驗(yàn),（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn),1.吲哚試驗(yàn) （靛基質(zhì)試驗(yàn)）,1）原理：某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。,史上最快最全的網(wǎng)絡(luò)文檔批量下載、上傳、處理，盡在：,40,吲哚試驗(yàn),色氨酸分解反應(yīng)： 吲哚反應(yīng)：,不同微生物所含酶系統(tǒng)不同，某些細(xì)菌含有色氨酸酶，能夠分解培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中的色氨酸。,大腸埃希菌,色氨酸,產(chǎn)氣腸桿菌,色氨酸酶,+H2O,檢測：,玫瑰吲哚,+H2O,玫瑰紅色,吲哚試驗(yàn)陽性+,吲

14、哚試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理,吲哚陰性 -,舉例,2）試驗(yàn)方法：,取3支胰蛋白水培養(yǎng)基培養(yǎng)基，1號(hào)接種大腸桿菌，2號(hào)接種產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌。 37培養(yǎng)24h48h。 沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄 呈現(xiàn)玫瑰紅色,為陽性反應(yīng),記+ 無紅色者,為陰性反應(yīng),記-,靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片,靛基質(zhì)+,2.硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn),1）原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S， H2S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或鐵離子生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鑒別細(xì)菌。,2）方法與結(jié)果 (1)瓊脂穿刺法： 培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養(yǎng)基。 操作：將試驗(yàn)細(xì)菌以接種針

15、沿管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37 24-48h培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。 結(jié)果：培養(yǎng)基變黑色為陽性。當(dāng)產(chǎn)生硫化氫量少時(shí)，為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時(shí)，一定要沿培養(yǎng)基管壁進(jìn)行。 (2)醋酸鉛試紙法： 培養(yǎng)基：含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基、浸有醋酸鉛的濾紙條。 操作：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，37培養(yǎng)24-48h。 結(jié)果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。,3）結(jié)果觀察與記錄,培養(yǎng)基底部呈黑色，為陽性，記+ 培養(yǎng)基底部無黑色，為陰性，記-,3. 尿素分解試驗(yàn) 尿素酶（Urease）試驗(yàn),1）原理：有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使培養(yǎng)基中的酚

16、紅指示劑呈粉紅色。培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色，為陽性。以此鑒別細(xì)菌。,1）未接種 2）尿素酶陽性 3）尿素酶陰性,2）試驗(yàn)方法：,挑取大量培養(yǎng)1824h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2、4和24h分別觀察一次結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色為陽性，顏色不變者為陰性。如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。,尿素酶試驗(yàn)圖,陽性,3）結(jié)果觀察與記錄 培養(yǎng)基呈粉紅色，為陽性，記 + 培養(yǎng)基顏色不變，為陰性，記 -,（三） 呼吸酶類試驗(yàn),氧化酶試驗(yàn) 過氧化氫酶試驗(yàn) 硝酸鹽還原試驗(yàn) 氰化鉀試驗(yàn),1. 氧化酶試驗(yàn),1）原理: 氧化酶使細(xì)胞色素C氧化后，氧化型細(xì)胞色素C再使鹽酸二甲

17、基對苯二胺氧化，使生成玫瑰紅色到暗紫色的醌類化合物,再和-萘酚結(jié)合,生成吲哚酚藍(lán),呈藍(lán)色反應(yīng)，為陽性。,氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗(yàn)時(shí)，此酶首先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)c桿菌科陰性，弧菌科，非發(fā)酵菌陽性（個(gè)別除外），奈瑟菌屬均陽性。 試驗(yàn)方法 取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深； 再加-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。,用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，前者陽性，而后者

18、陰性。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽性。 異常結(jié)果： 奈瑟菌屬有腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等9種致病菌，引起流行性腦脊髓膜炎 上呼吸道癥狀：鼻咽炎等全身感染癥狀：高熱、出血點(diǎn)或瘀血點(diǎn)，腦膜炎癥狀：頭痛、嘔吐、頸項(xiàng)強(qiáng)直;引起淋病，引起新生兒淋病性眼結(jié)膜炎。,氧化酶試驗(yàn)注意事項(xiàng)： 試驗(yàn)時(shí)應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽性。 10g/L鹽酸四甲基對苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對苯二胺水溶液為無色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)經(jīng)常更換新試劑，并盛于棕色瓶中，若試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。,試劑,1%鹽酸二甲基對苯二胺 1% -萘酚-乙醇液,藍(lán)色為+,不變色或?yàn)榉奂t色為-,2. 過氧化氫酶試驗(yàn),1）原

19、理： 某些細(xì)菌可分泌過氧化氫酶，加入過氧化氫后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，即為陽性反應(yīng)。,2）試驗(yàn)方法,用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑1-2滴在培養(yǎng)物上,再加入1% -萘酚-乙醇液1-2滴, 在30秒內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。 3）結(jié)果觀察與記錄 在30秒內(nèi)呈藍(lán)色反應(yīng),為陽性,記 + 不變色或?yàn)榉奂t色者,為陰性,記 -,2）試驗(yàn)方法,取固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，置于潔凈玻片上（或試管），滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，或在瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過氧化氫液，立即觀察結(jié)果。,3）結(jié)果觀察與記錄,產(chǎn)生氣泡者，為陽性，記+ 不產(chǎn)生氣泡者，為陰性，記-,3.硝酸鹽還原試驗(yàn),1）原理：某些細(xì)菌具

20、有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在酸性條件下，亞硝酸鹽可生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再與-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。,試劑,A、對氨基苯磺酸試劑 B、-萘胺試劑,2）試驗(yàn)方法,取待檢菌新鮮純培養(yǎng)物，在硝酸鹽培養(yǎng)基上接種，在361 培養(yǎng)14天，每天取2mL培養(yǎng)液,加入A、B試劑的等量混合物各二滴混勻，立即觀察結(jié)果。,3）結(jié)果觀察與記錄,呈現(xiàn)紅色，為陽性，記+ 若無紅色出現(xiàn)，為陰性，記-,4. 氰化鉀試驗(yàn),1）原理： 氰化鉀是細(xì)菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細(xì)菌的生長,但有的細(xì)菌在一定濃度的氰化鉀存

21、在時(shí)仍能生長,以此鑒別細(xì)菌.,2）試驗(yàn)方法,取培養(yǎng)2024h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌落1環(huán)，接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即以橡膠塞塞緊，361 培養(yǎng)24 48h，觀察結(jié)果。,3）結(jié)果觀察與記錄,對照管有菌生長，試驗(yàn)管有菌生長為陽性，記+。 對照管有菌生長，試驗(yàn)管無菌生長為陰性。記-。,（四）毒性酶類試驗(yàn),溶血試驗(yàn) 血漿凝固酶試驗(yàn),1. 溶血試驗(yàn),1）原理： 某些細(xì)菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解，不同的細(xì)菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細(xì)菌。,2）試驗(yàn)方法,平板法 試管法,平板法,將培養(yǎng)物接種于血平板培養(yǎng)基上，361 培養(yǎng)24 48h，觀察結(jié)果。,溶血試驗(yàn)的溶血類型及

22、現(xiàn)象,（1） （甲型）溶血: 菌落周圍出現(xiàn)較窄的半透明的草綠色溶血環(huán)。 （2） （乙型）溶血: 菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)。 （3）（丙型）溶血: 菌落周圍無溶血環(huán)。,甲型（-）溶血,乙型（-）溶血,丙型（-）溶血, （乙型）溶血,試管法,將待檢菌培養(yǎng)液與等量的2%羊血球混合，在361 培養(yǎng)16 18h，觀察結(jié)果。如溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀。,3）結(jié)果觀察與記錄,有溶血現(xiàn)象，為陽性，記+； 無溶血現(xiàn)象，為陰性，記 -,2. 血漿凝固酶試驗(yàn),1）原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細(xì)菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而

23、使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象,為陽性。,2）試驗(yàn)方法,（1）玻片法： 取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔（人）血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5 min內(nèi),如血漿內(nèi)出現(xiàn)團(tuán)塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁，則為陽性;如兩者呈均勻混濁，無凝固則為陰性。,有凝塊,均勻混濁,血漿,生理鹽水,血漿凝固酶試驗(yàn),（2）試管法,取滅菌小試管3支，各加入血漿無菌水(1:1) 0.5ml，1支加入被檢菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（或濃菌懸液）0.5ml；其余2支作對照管，1支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽性對照;另1支加入營養(yǎng)肉湯或0.9氯化鈉溶0.5ml作空白對照

24、。將3管同時(shí)放37溫箱或水浴中培養(yǎng)，每0.5 h觀察一次， 4 h 內(nèi)無凝固現(xiàn)象者，觀察直至24小時(shí)。,陽性反應(yīng),陰性反應(yīng),不凝固,少量、零散凝固,明顯的塊狀凝固,巨大塊凝固,完全凝固，倒置不流動(dòng),金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn),3）試管法的結(jié)果觀察與記錄,空白對照管的血漿流動(dòng)自如，陽性對照管血漿凝固。 試驗(yàn)管血漿凝固者為陽性； 均無凝固則為陰性。,其他,檸檬酸鹽利用試驗(yàn),1.有機(jī)酸鹽的利用試驗(yàn),枸櫞酸鹽利用試驗(yàn),1）原理： 某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解枸櫞(檸檬)酸鹽生成碳酸鹽；同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)色，為陽性。,腸桿菌科各

25、種細(xì)菌利用檸檬酸鹽的能力不同，有的菌可利用檸檬酸鈉作為碳源，有的則不能。,大腸埃希菌,產(chǎn)氣腸桿菌,大腸埃希菌不能利用檸檬酸鹽，故不能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性。,產(chǎn)氣腸桿菌能在以檸檬酸鹽為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽產(chǎn)生CO2，再生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑BTB由綠色變?yōu)樗{(lán)色。,枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）實(shí)驗(yàn)原理,舉例,2）試驗(yàn)方法,挑取待檢菌，在西蒙檸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面上密集劃線接種，在361 培養(yǎng)14天，每天觀察結(jié)果。,3）結(jié)果觀察與記錄,斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基斜面變?yōu)樗{(lán)色或深藍(lán)色，為陽性，記+； 無菌苔生長，培養(yǎng)基斜面仍為綠色

26、者，為陰性，記-,檸檬酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片,陽性+,2.三糖鐵（TSI）試驗(yàn),1）三糖鐵試驗(yàn)的原理,如果細(xì)菌可利用乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)基全部變黃；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面最后為紅色，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，仍保持黃色。 如果細(xì)菌又能分解含硫化合物，產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基底部變黑。,制好的培養(yǎng)基,對照管,斜面紅色，底面黃色,培養(yǎng)基全黃色,斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S,斜面紅色，底部黃色，產(chǎn)生H2S,底面黃色，并產(chǎn)生CO2,2）試驗(yàn)方法,以接種針挑取

27、待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置361培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。,已知大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌原理？,2志賀氏菌3沙門氏菌4大腸桿菌,下面照片所示2-3-4，可能是大腸桿菌、沙門氏菌還是志賀氏菌？,2志賀氏菌3沙門氏菌4大腸桿菌,思考題,提問： 志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生H2S。在培養(yǎng)基上應(yīng)該產(chǎn)生什么現(xiàn)象？ 大腸桿菌，能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，大多數(shù)能分解乳糖，不產(chǎn)生H2S。在培養(yǎng)基上應(yīng)該是什么現(xiàn)象？ 沙門氏菌，能分解葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，大多數(shù)產(chǎn)生H2S，多數(shù)產(chǎn)氣，在培養(yǎng)基上應(yīng)該是什么現(xiàn)象？,第三節(jié) 培養(yǎng)基,培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖

28、或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。 要求：應(yīng)具備6大營養(yǎng)要素；物質(zhì)比例合適；必須滅菌。 營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機(jī)鹽和水,微生物的六大營養(yǎng)素,一、培養(yǎng)基的成分與分類,細(xì)胞的組成成分 提供細(xì)胞代謝的介質(zhì) 直接參與代謝過程 降低細(xì)胞內(nèi)溫度 維持生物大分子的 天然構(gòu)象,合成含氮物質(zhì) 提供能量,構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì) 提供能量,構(gòu)成細(xì)胞的組成成分； 作為酶的組成成分； 維持酶的活性； 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓； 作為某些自養(yǎng)菌的能源。,1.培養(yǎng)基的成分,維持細(xì)菌的代謝、繁殖,2.培養(yǎng)基的分類 按成分的不同分 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基 按培養(yǎng)基

29、用途 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基,二、培養(yǎng)基pH的測定與調(diào)整,測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2。調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。 一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會(huì)比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適。,二、培養(yǎng)基pH的測定與調(diào)整,測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2。調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。 當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。 一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會(huì)

30、比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適。因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測定，并記下每次pH的測定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié)。 測定時(shí)，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用酸度計(jì)校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。,三、常用培養(yǎng)基的制備技術(shù),1.玻璃器皿的清洗 制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。 （1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121高壓蒸汽滅菌3min后烘干，備用。 （2）

31、試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報(bào)紙包扎好，121高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。 （3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端 ，然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。 還可以160干熱滅菌2h后，備用。,2.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng),（1）培養(yǎng)基配方的選定 （2）培養(yǎng)基的制備記錄 （3）培養(yǎng)基成分的稱取 （4）培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 （5）培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正 （6）培養(yǎng)基的過濾澄清 （7）培養(yǎng)基的分裝 （8）培養(yǎng)基的滅菌 （9）培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 （10）培養(yǎng)基的保存,培養(yǎng)基的分裝,2.培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng),（1）培養(yǎng)基配

32、方的選定 同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會(huì)有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。 （2）培養(yǎng)基的制備記錄 每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號(hào)，最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。 （3）培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方做出記號(hào)，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左

33、側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。,4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動(dòng)、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。 5、培養(yǎng)基p

34、H的初步調(diào)正 因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會(huì)有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。因此，對這個(gè)步驟，操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。 6、培養(yǎng)基的過濾澄清 液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。 瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉

35、的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。如過濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至5560C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入12個(gè)雞蛋的蛋白，強(qiáng)力振搖35分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。,7、培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基

36、時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。 8、培養(yǎng)基的滅菌 一般培養(yǎng)基可采用121C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。 某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。 瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即

37、取出，冷至55-60時(shí)，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。 9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。 將全部培養(yǎng)基放入361C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。 用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種12管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)，如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。 10、培養(yǎng)基的保存 培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標(biāo)簽,（4）培養(yǎng)

38、基各成分的混合和熔化,溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。 在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置1015min，攪拌，振蕩，或延長時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養(yǎng)成分被破壞。,大微DW-9型微生物試劑分液器是一款精密輸送液體的電子蠕動(dòng)泵分液系統(tǒng)，是大微科技專為微生物實(shí)驗(yàn)室中各種試劑溶液(培養(yǎng)基、緩沖液、稀釋液等)的精確計(jì)量和分裝而設(shè)計(jì)，它可以使您頻繁的重復(fù)分液操作變得輕松、高效！配備不同直徑的分液管，在得到多種分裝量

39、范圍的同時(shí)，保證精確的分液精度。儀器一機(jī)多用，1臺(tái)設(shè)備，即可實(shí)現(xiàn)“傾注平板制備”和“試管分裝”等多種用途；被廣泛應(yīng)用于各種食品、藥品企業(yè)、政府檢測機(jī)構(gòu)和科研單位的專業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室。 3. 可簡易編程，能夠在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)分注預(yù)設(shè)容量的液體，同時(shí)顯示分注累積容量。 4. 分裝快速，1L溶液分裝到100個(gè)試管中，最快僅需2分鐘。,（3）培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準(zhǔn)和確認(rèn)。每次使用前后，均要對分配器的管道系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管。 固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。 平皿：傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3

40、4h，如用塑料平皿須在35培養(yǎng)箱 中倒置3060min。讓水蒸汽自然蒸發(fā)。 斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染。 高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。 分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)最佳）進(jìn)行滅菌處理。液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。 培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅

41、菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基采用121、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應(yīng)延長至20min。含糖培養(yǎng)基115、68.85kPa滅菌30min。含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80100、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱5658水浴1h，連續(xù)56d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細(xì)菌過濾器，過濾除菌。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)到全部殺滅微生物。以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過驗(yàn)證確認(rèn)，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時(shí)宜

42、采用115、68.85kPa滅菌30min為好。,稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。 調(diào)pH值：用1N NaOH或1N HCl調(diào)pH，用pH試紙對照。 加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水。 分裝：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，掛上標(biāo)簽（必須用鉛筆寫），注明何種培養(yǎng)基。 滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。,2.培養(yǎng)基的制備,3.食品檢驗(yàn)常用培養(yǎng)基的制備技術(shù),（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 瓊脂 20g 自來水 1000mL pH 7.2

43、7.4 滅菌 12115min,用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌,馬鈴薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）瓊脂培養(yǎng)基 （用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基） 其配方如下： 去皮馬鈴薯（或鮮豆芽） 200g 蔗糖（或葡萄糖） 20g 自來水 1000mL 瓊脂 20g pH 自然 滅菌： （含蔗糖） 1.05kg/cm2 20min （含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min,（2）PDA培養(yǎng)基,（3）淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號(hào)） 配方如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 瓊脂 20g

44、自來水 1000mL 滅菌： 121 15min,用于分離和培養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。,無菌水為下一次微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。 100mL三角燒瓶（裝有玻璃珠），裝自來水45.0mL，試管中裝9.0mL自來水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角燒瓶和試管須預(yù)先塞好棉塞，并經(jīng)干熱滅菌。,無菌水的制備,棉塞的制作,培養(yǎng)基制備技術(shù) -培養(yǎng)基分類,根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分： ）天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成

45、的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學(xué)成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號(hào)等因素的影響。 ）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。 ）半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)

46、驗(yàn)室中使用最多。 根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分： ）液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。 ）固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得十分廣泛。 ）半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.21%之間。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來保藏菌種。,培養(yǎng)基制備技術(shù) 培養(yǎng)基的分類,根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分： (1)通用培養(yǎng)基：培養(yǎng)異氧細(xì)菌最常用的培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；配制適合于厭氧菌生長的培養(yǎng)基時(shí)，通常須在培養(yǎng)基中加入適量的還原劑如巰基醋酸鈉、維生素C或半胱氨酸來降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，以利于厭氧菌的生長。 (2)鑒別培養(yǎng)基：是一類在成分中加有能與目的菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只需用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌落的培養(yǎng)基。(伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂、微生物快速顯色培養(yǎng)基） (3)選擇性培養(yǎng)基：根