第二章基因工程的載體和工具酶

1、第二章 基因工程的載體和工具酶第一節(jié) 載體而目的基因本身無法進(jìn)行復(fù)“載體 ”及其“寄主細(xì)胞引言 基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)， 制和表達(dá)、不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于 來實(shí)現(xiàn)。作為基因克隆的載體必須具備以下特性： 載體必須是復(fù)制子。具有合適的篩選標(biāo)記，便于重組子的篩選。具備多克隆位點(diǎn)（MCS）,便于外源基因插入。自身分子量較小，拷貝數(shù)高。在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。一、質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（1） 質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露的雙鏈環(huán)狀（少數(shù)為線形和 RNA） DNA 分子。廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中， 比病毒更簡單。 在霉菌、 藍(lán)藻、 酵

2、母和一些動植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了 質(zhì)粒， 目前對細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入， 特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。 大腸桿菌的質(zhì)粒主要有 F質(zhì)粒（F因子）、R質(zhì)粒（抗藥性因子）和 Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）三種。（2） 質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的 2-3種蛋白質(zhì)分子，最大 的達(dá)到 200kb。（ 3 ）質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中 “友好 ”地“借居”，離開了寄主它本身無法復(fù)制；同時(shí)質(zhì)粒往 往有宿主專一性，如大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)不一定能在其它生物細(xì)胞中繁殖。（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stigent pla

3、smid ），拷貝數(shù)為1-3 ；松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid） ,拷貝數(shù)為 10-60。不過即使是同一質(zhì)粒， 其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生 長環(huán)境也可能有很大的變化。（5）質(zhì)粒的不親和性 兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。載體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有 tra 基因；能通過結(jié)合作用從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。 非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含 tra 基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)移。（ 7）質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種，（二）質(zhì)粒 DNA 的制備 有多種分離質(zhì)粒的方法，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過濾法

4、等。 目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒 DNA 。這個(gè)方法主要包括培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒 DNA 與染色體 DNA 分開及除去蛋白質(zhì)和 RNA 。1. 堿變性法質(zhì)粒提取的原理： 根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 與線性染色體 DNA 片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展 出來的。在pH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的 DNA會被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不 會被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性 pH 值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而 cccDNA 可以準(zhǔn)確 迅速復(fù)性， 通過離心去除線性染色體，獲得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得 質(zhì)粒 DNA 。2. 堿變性法提取質(zhì)粒的步

5、驟：(1) 取 1.5 毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；(2) 加入 100 微升冰冷的溶液 I，(50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA ) 渦旋震蕩懸浮菌液。(3) 加入200微升新配制的溶液II , (0.2M NaOH , 1.0%SDS)緩緩混勻置室溫 5分鐘。(4) 加入150毫升冰冷的溶液III ,(醋酸鉀29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸餾水至100毫 升)顛倒離心管 10次后，冰浴 5分鐘。(5) 離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA 。(三) 質(zhì)粒載體的改造去掉不必要的 DNA

6、 區(qū)段。減少限制酶的識別位點(diǎn)，一種酶只保留一個(gè)。(單一的限制性酶切位點(diǎn))。加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。對質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。1、質(zhì)粒 pBR322 結(jié)構(gòu)：( 1 )氨芐青霉素抗性基因( ampr 或 Apr)內(nèi)部有 3 種限制酶單一識別位點(diǎn) 。( 2)四環(huán)素抗性基因( tetr 或 Tcr)內(nèi)部有 7 種，啟動區(qū)內(nèi)有 2 種限制酶單一識別位點(diǎn) 。( 3) DNA 復(fù)制起點(diǎn)( ori)pBR322 質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：( 1 )具有較小的分子量。4363bp , 2.6X 106Da,(2) 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。(3) 具較

7、高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可累積10003000個(gè)拷貝。(4) 對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個(gè)能切割的位點(diǎn)。2、pUC 質(zhì)粒載體1987 年， J.Messing 和 J.Vieria 采用 MCS 技術(shù)在 pBR322 基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 結(jié)構(gòu)：( 1 )來自于 pBR322 的 Ori(2) 氨芐青霉素的抗性基因 (ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化(3) LacZ 基因編碼3 半乳糖酶的a 肽鏈即氨基末端。( 4) MCS 區(qū)段是一段用于插入外源 DNA 片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位 點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在整個(gè)載體中是唯一的。與

8、 pBR322 相比， pUC 質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：(1)具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)女口 pUC8為2 750bp, pUCI8為2 686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制 rop基因的缺失，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500700個(gè)拷貝(2 )適用于組織化學(xué)法檢測重組體通過G-互補(bǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子。(3)具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段(MCS)可以定向克隆防止載體自我連接。二、噬菌體載體(一) -噬菌體載體1. 噬菌體的生物學(xué)特性烈性噬菌體：只具有溶菌生長周期溫和噬菌體：具有溶源生長周期和溶菌生長周期溶菌周期指噬菌體將 DNA注入寄主細(xì)胞后很快環(huán)化，然后進(jìn)行自我復(fù)制、蛋白衣殼合 成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細(xì)胞

9、破裂而釋放出大量的子代噬菌體。溶源周期中，注入寄主細(xì)胞的噬菌體DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。整合了一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌被稱為溶源性細(xì)菌。在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體 DNA被稱為原噬菌體。2. 噬菌體的生物學(xué)特性組成：蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。DNA長度為48502bp，在分子兩端各有 12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)其注入到寄主 細(xì)胞中后，可以迅速通過這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補(bǔ)形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點(diǎn)(cohesive end site).是一個(gè)溫和噬菌體一般以溶源生長進(jìn)行增殖，

10、脅迫條件下也會進(jìn)入溶菌生長周期。復(fù)制溶源周期隨溶源細(xì)菌染色體一起復(fù)制溶菌周期的早期是 9 復(fù)制，晚期進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制基因組成DNA至少包括61個(gè)基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活 動的必須基因，另一部分約1 /3為非必須區(qū)段。3. 噬菌體載體的類型插入型 (Insertion vectors )這種載體僅僅有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。如：入 gt10、 入 gt11克隆能力小，不到 10kb置換型 (Replaceme nt vectors)這種載體具有兩個(gè)對應(yīng)的酶切克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的入DNA區(qū)段是入噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Cha

11、ron 4載體克隆能力大，2025kb(二) M13噬菌體1、絲狀噬菌體 M13噬菌體的生物學(xué)特性是單鏈閉合環(huán)狀噬菌體只能感染雄性細(xì)菌， 外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb,可分為10個(gè)區(qū)和507 bp基因間 隔區(qū)（IS區(qū)），該區(qū)可以接受外源 DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體 能用于單鏈DNA載體的重要前提。復(fù)制與增殖（圖）2.M13噬菌體載體的構(gòu)建 在IS區(qū)內(nèi)插入LacZ基因 在標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝MCS區(qū)段所以能通過 :.互補(bǔ)在X-Gal/ IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了M13mp8、9和M13mp18、19 等這類載體的突出優(yōu)點(diǎn)在于其既可以提供單鏈DNA，也可

12、以提供雙鏈的 DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表現(xiàn)不穩(wěn)定，在噬菌體增殖過程中容易發(fā)生缺失。所以一般克隆 的片段在1kb之內(nèi)，克隆300-400bp的片段十分穩(wěn)定。（三）柯斯質(zhì)粒載體1. 柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)柯斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，cosmid 是 cos site carrying plasmid 的縮寫?？滤官|(zhì)粒的大小為 4-6kb,由3部分組成：A. 多克隆位點(diǎn)區(qū)B. 含有cos位點(diǎn)的 DNA區(qū)C. 復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性標(biāo)記區(qū)2. 柯斯質(zhì)粒載體的特性1、 具有噬菌體的特性 柯斯質(zhì)粒連接上適宜長度的外源DNA后可以在體外包裝成噬

13、菌體顆粒，并能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)寄主細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞的DNA也能環(huán)化和復(fù)制，但是不會形成新的噬菌體顆粒，也不能發(fā)生溶菌現(xiàn)象。2、 具有質(zhì)粒載體的特性能象質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，且?guī)в锌剐赃x擇標(biāo)記基因，有些還帶有插入失活型的多克隆位點(diǎn)，為重組體的篩選提供了方便。3、 高容量的克隆能力cos質(zhì)粒本身很小，只有復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記和cos位點(diǎn)等構(gòu)成，所以其克隆上限可達(dá) 45kb左右。不過由于包裝的限制，其克隆片段至少要達(dá)到30kb。四種常用載體的比較質(zhì)粒入噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w克隆DNA大片段 *+-構(gòu)建基因組文庫-+-構(gòu)建DNA文庫+-常規(guī)的亞克隆化+-構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+-序列分析+-+單鏈探針+*

14、-+外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+-第二節(jié) 基因操作的工具酶一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)當(dāng)入（k）噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而 E.coliB 的 DNA 中雖然也存在這種特異序列，但可在 EcoB 甲基化酶的作用下， 催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM ）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。最早分離出的限制內(nèi)切酶是在 1968年，Meselson和Yuan,大腸桿菌B和K菌株，EcoB 和 EcoK， 是 I 型的，沒有實(shí)用價(jià)值。首個(gè) II 型限制內(nèi)切酶是在

15、 1970年,由 H.O.Smith 等從 Heamophilus influenzae 的 Rd 菌 株中 Hind II 。使得 DNA 分子的體外精確切割成為可能。從此, 相關(guān)研究展開。 如 NEB 公司的提取和克隆。 目前已純化出 3000 種限制性內(nèi)切酶 中,其中有 30%是在 NEB 發(fā)現(xiàn)的 。限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease ）：是一類能夠識別雙鏈 DNA 分子中的某 種特定核苷酸序列, 并由此切割 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。 切開的是 3, 5磷酸二酯鍵。（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類分為 I 型、 II 型和 III 型。（三）限制性核酸

16、內(nèi)切酶的命名1、 寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3 個(gè)斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱,如大腸桿菌 Escherichia coli 表示為 Eco , 流感嗜血 菌 Haemophilus influenzae 表示為 Hin ；2、 用一個(gè)正體字母表示菌株的類型,比如EcoR、Hind；3、 如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系,則用羅馬數(shù)字標(biāo)出, 比如 Eco R I、 Hind III。（四）II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性1、識別位點(diǎn)的特異性每種酶都有其特定的 DNA識別位點(diǎn)，通常是由 48個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序 列）。2、識別序列的對稱性靶序列通

17、常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu),即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性交錯(cuò)切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的 DNA 分子）。與 II 型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念粘性末端： cohesive ends 是指 DNA 分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延 伸末端結(jié)構(gòu),它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來。平末端：Blunt end在識別序列對稱處同時(shí)切開 DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。 則不易于重新環(huán)化。同裂酶： isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。不同同裂 酶對位點(diǎn)的甲基化敏感性有差別。同尾酶： isocaudamer

18、s 識別的靶序列不同,但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切 酶。女口 BamH I、BclI、BglII和Xho I是一組同尾酶。注 意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接, 但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性 末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。（五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)一個(gè)限制酶單位（U ）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度， 通常為37C） 下，1h內(nèi)中完全降解1乜 DNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有： DNA的純度 DNA的甲基化程度 酶切反應(yīng)的溫度（通常為37 C ） DNA的分子結(jié)構(gòu) 核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液在非最適的”反應(yīng)

19、條件下，有些核酸內(nèi)切限制酶識別序列的特異性便會發(fā)生松動”從其正確”識別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子，這種現(xiàn)象叫星號活性。用*表示。二、DNA連接酶及其應(yīng)用（一）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。首個(gè)DNA連接酶（ligase）大腸桿菌DNA連接酶，是1967年發(fā)現(xiàn)的，是大腸桿菌 基因編碼。1970年，發(fā)現(xiàn)了 T4DNA連接酶，由大腸桿菌 T4噬菌體基因編碼的。（二）DNA連接酶作用特點(diǎn)1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3 - OH和5 P,而且這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰；2. 在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。E.coli DNA連接

20、酶-連接具互補(bǔ)堿基黏性末端（最初研究表明），現(xiàn)在研究可連接平末 端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。T 4DNA連接酶連接具互補(bǔ)堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。（三）DNA連接酶的反應(yīng)條件影響連接效率的因素有：1. 溫度（通常在 4-15 C ）2. ATP 的濃度（10 卩 M/ L - 1 JM / L ）3. 連接酶濃度（一般平末端大約需12U,黏性末端僅需0.1U）4. 反應(yīng)時(shí)間（通常連接過夜）5. 插入片段和載體片段的摩爾比（1 : 15 : 1）（四）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案1. 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。2

21、. 10卩l(xiāng)體積反應(yīng)體系中：取載體 50-100ng,加入一定比例的外源 DNA分子（一般線性載 體DNA分子與外源 DNA分子摩爾數(shù)為1 : 15 ： 1）,補(bǔ)足ddH20至8卩I。3. 輕輕混勻，稍加離心，56C水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。4. 加入含 ATP的10X Buffer 1卩l(xiāng), T4 DNA連接酶合適單位，用ddH2O補(bǔ)至10卩l(xiāng)，稍 加離心，在適當(dāng)溫度（一般 14-16C）連接8-14hr。三、DNA聚合酶及其應(yīng)用（一）大腸桿菌DNA聚合酶I是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌 E。Coli細(xì)胞中分離出來的。它是一種多功能性 的酶，包括 3種不同的酶活力：A

22、. 5f 3聚合酶活性（模板，帶3 OH游離基團(tuán)的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。B. 雙鏈特異性的5t 3核酸外切酶活性。C. 3 5核酸外切酶活性。從游離的雙鏈或單鏈 DNA的3端降解。不過對于雙鏈的降解可被 5 -3的多聚活性 所抑制。主要是校正作用。大腸桿菌DNA聚合酶I的三種用途1利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的DNA探針禾U用其5 -3 的外切酶活性及其聚合酶活性。2用于DNA連接前的大缺口填充利用5 -3 的聚合酶活性。3用于DNA的序列分析利用5 -3 的聚合酶活性。（二）Klenow片段酶Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子， 分子

23、量為76KD 。酶催活性：5 t3的聚合酶活性3 t5的核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途（利用 5 t3的聚合酶活性）： 修補(bǔ)限制性酶消化 DNA形成的3 隱蔽末端標(biāo)記DNA片段的末端底物用a 32P dNTPscDNA克隆中第二鏈 cDNA的合成DNA序列的測定（三）T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶是從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，1. 酶催活性：5 t 3的聚合酶活性3 t 5 的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶I的活性高200倍。比Klenow 片段酶強(qiáng)1001,000倍。因此，可以綜合利用這兩種活性進(jìn)行取代合成反應(yīng)：如果反應(yīng)體系中僅存在一種 dNTP或沒有底物時(shí)，這時(shí)T4DNA聚合酶就會表現(xiàn)出3 t 5 外切酶活力，從雙鏈 DNA的3開始降解，直到露出底物 dNTP相同的堿基。然后 就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。2. T4DNA聚合酶的用途（1）利用取代合成反應(yīng)制備探針（2）標(biāo)記具有平末端的或具有 3-隱蔽末端的 DNA片段 利用較強(qiáng)的3 t 5 外切酶活性和 5t 3聚合活性（3）用于DNA序列分析（四）逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴