DIG試劑盒說明書(CSPD)中文翻譯版講解

1、只用于生命科學(xué)研究，不能用于診斷程序僅用于體外實驗DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit 采用地高辛-dUTP進(jìn)行隨機(jī)引物DNA標(biāo)記，堿性標(biāo)記，利用CSPD化學(xué)發(fā)光檢測，隨時即用。貨號：11 585 614 910此試劑盒儲存條件：-15到-25。此試劑盒可對10ng-3gDNA進(jìn)行12次標(biāo)記反應(yīng)，可檢測1010cm2面積的雜交膜24張。指導(dǎo)手冊2005.12 版1 前言1.1 內(nèi)容表1 前言1.1 內(nèi)容表1.2 試劑盒成分2.介紹2.1 產(chǎn)品簡介3. 操作步驟和所需材料3.1 在你開始前3.2 流程圖3.3 地高辛標(biāo)記DNA

2、3.4 標(biāo)記效率的確定3.5 DNA的轉(zhuǎn)移和固定3.6 雜交3.7 免疫檢測3.8 DNA印記的洗脫和再雜交4. 附錄4.1 故障排除4.2 參考文獻(xiàn)4.3 訂購信息1.2 試劑盒的成分瓶號標(biāo)記內(nèi)容包括功能1DIG-高效引物50L 地高辛標(biāo)記的高效引物5濃度的標(biāo)記混合物：優(yōu)化的濃度的隨機(jī)引物，核苷酸，地高辛標(biāo)記的dUTP（堿標(biāo)記的），Klenow酶和緩沖液成分隨時可用澄清的粘液用于DNA的高效隨機(jī)引物標(biāo)記2DIG標(biāo)記的對照DNA20L5g/mL 質(zhì)粒pBR328 DNA （用Bam HI線性化）澄清溶液用于確定標(biāo)記效率3DNA稀釋緩沖液3管1mL50g/mL魚精DNA,10mM Tris-HC

3、l,1mM EDTA, pH8.0 在25澄清溶液4抗地高辛的堿性磷酸酶結(jié)合物50L750U/mL從羊中獲取的，F(xiàn)ab段，結(jié)合堿性磷酸酶澄清溶液5CSPD隨時可用50mL CSPD澄清溶液6封閉液4100mL10濃度黃色，粘液7地高辛雜交顆粒100mL地高辛雜交液共4瓶，用于DNA雜交附加儀器與所需試劑除了上表中列出的試劑外，你必須準(zhǔn)備一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要準(zhǔn)備的設(shè)備概要。在每個操作程序的前面提供了詳細(xì)的信息。操作程序儀器設(shè)備試劑3.3 DIG-DNA標(biāo)記水浴滅菌的雙蒸水0.2M pH8.0 滅菌的EDTA3.4 標(biāo)記效率的半定量帶正電荷的尼龍膜*地高辛洗滌和封阻緩沖組

4、合*或者洗滌緩沖液馬來酸緩沖液檢測緩沖液3.5 DNA轉(zhuǎn)移和固定紫外光盒或者商業(yè)化可用于紫外交聯(lián)的其他設(shè)備20SSC或者10SSC3.6 雜交尼龍膜，帶正電荷*雜交袋*，或者耐熱的塑料袋或者滾筒瓶注意：當(dāng)用地高辛雜交緩沖液工作時，不要用開口的托盤。3.7 免疫檢測耐熱的塑料袋或者滾筒瓶雜交袋*地高辛洗滌和封阻緩沖液組合*，或者洗滌緩沖液馬來酸緩沖液檢測緩沖液3.8 DNA 斑點(diǎn)的脫色和重新標(biāo)記探針大的托盤水浴10SSC10%SDS0.2M NaOH*標(biāo)記的產(chǎn)品可以從Roche Applied Science 獲得。2.介紹2.1 產(chǎn)品概況實驗原則此試劑盒采用DIG(地高辛)，一種甾類半抗原，s

5、teroid hapten去標(biāo)記DNA探針用于雜交和后續(xù)的免疫檢測1,2,3。步驟描述DNA 標(biāo)記根據(jù)隨機(jī)引物標(biāo)記技術(shù)采用地高辛標(biāo)記引物獲得了地高辛標(biāo)記的DNA探針。地高辛標(biāo)記的高效引物是一種專門生產(chǎn)的反應(yīng)混合物，其中含有地高辛dUTP,堿性標(biāo)記（圖1）和所有的試劑，包括隨機(jī)引物標(biāo)記所必須的酶，已預(yù)先混合優(yōu)化的5濃度反應(yīng)緩沖液。雜交根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，地高辛標(biāo)記的探針可以與固定在膜上的核酸雜交。采用堿標(biāo)記形式的地高辛-11-dUTP能夠更加容易和有效的被洗脫下來，使固定在膜上的核酸可以與其他的地高辛標(biāo)記探針再次雜交。免疫檢測雜交探針可以用抗地高辛的堿性磷酸酶進(jìn)行免疫檢測，F(xiàn)ab段，然后采用即時可用的

6、化學(xué)發(fā)光底物CSPD可以看到雜交結(jié)果。采用堿性磷酸酶可以對CSPD進(jìn)行，酶的脫磷酸化，導(dǎo)致在最大波長477nm處有光的發(fā)射（圖2），這一現(xiàn)象可以用適合的圖像儀或者X光片進(jìn)行記錄。膠片的曝光時間范圍只在5-30分鐘內(nèi)。圖1 DIG-dUTP ，堿性標(biāo)記圖2 CSPD反應(yīng)應(yīng)用地高辛標(biāo)記DNA探針可以用于： 所有類型的濾膜雜交總基因組DNA中單拷貝基因的檢測，甚至對于高度復(fù)雜的生物體也可以進(jìn)行檢測，如人，大麥和小麥。樣品材料至少100bp的DNA片段線性的質(zhì)粒，cos質(zhì)粒或者DNA超螺旋的DNA實驗時間 此表格列出了每一步實驗所需的反應(yīng)時間。步驟反應(yīng)時間DNA標(biāo)記1小時-過夜雜交 6小時或者過夜免疫

7、檢測1.5小時化學(xué)熒光信號檢測5-30分鐘檢測數(shù)量一個試劑盒足夠用于:12個標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記反應(yīng)，每個反應(yīng)的膜板DNA不超過3g；并可以檢測24張1010cm2的雜交膜。質(zhì)量控制根據(jù)操作步驟中的說明對未標(biāo)記的對照DNA pBR328進(jìn)行標(biāo)記，并按照下面的標(biāo)準(zhǔn)檢測操作方法在點(diǎn)雜交中用50ng的異源的DNA稀釋0.1pg 同源DNA,用即時可用的CSPD，X光片曝光30分鐘進(jìn)行檢測。試劑盒的儲存和穩(wěn)定性未開封的試劑盒在保質(zhì)期內(nèi)可以穩(wěn)定的存放在-15到-25（保質(zhì)期印在標(biāo)簽上）。在干冰中運(yùn)輸。一旦開封，請根據(jù)下表選擇適宜的儲存條件。試劑盒成分儲存條件抗地高辛堿性磷酸酶結(jié)合物（4號管）2-8穩(wěn)定。注意：不要

8、凍存CSPD 隨時即用 (5號管)2-8，避光保存。封阻液（6號管）未開封時 15-25 穩(wěn)定。一旦開封，應(yīng)分裝并儲存在-15到-25或者無菌條件下2-8間可以穩(wěn)定保存1個月。工作溶液都應(yīng)是新鮮配制的。地高辛雜交顆粒儲存在15-25一旦開封，無菌條件下溶液可以穩(wěn)定存在1個月。地高辛高效引物混合物保質(zhì)期12個月，-15到-25。避免反復(fù)凍融。靈敏度和特異性采用southern雜交從0.3g人胎盤 DNA（經(jīng)Bgl 或EcoR酶切）中檢測到單拷貝基因（組織纖溶酶原激活因子tPA）。優(yōu)點(diǎn)此表描述了這個試劑盒的優(yōu)點(diǎn)和特征優(yōu)點(diǎn)特征精確、快速預(yù)先已混好的地高辛高效引物混合物減少了標(biāo)記DNA 時手動操作的時

9、間，同時提高了產(chǎn)量，重復(fù)性好靈敏在復(fù)雜的總?cè)薉NA及植物基因組中能夠檢測到單拷貝基因。省時地高辛標(biāo)記的探針可以至少儲存一年。雜交溶液可以重復(fù)利用3-5次，重復(fù)次數(shù)主要取決于每次雜交中產(chǎn)生信號的標(biāo)記探針的量。3 實驗步驟和所需材料3.1 在你開始前主要的操作要求此表中描述了地高辛標(biāo)記和檢測中主要的提示：要求指引在清潔的條件下進(jìn)行操作高壓滅菌地高辛系統(tǒng)的試劑過濾滅菌的溶液包括：SDS,吐溫20，并應(yīng)該加入到已滅菌的溶液中。用干凈的孵育托盤每次使用前都要嚴(yán)格地清洗實驗托盤處理膜的要求帶無粉手套處理膜的時候，只能夠用干凈的鑷子夾膜的邊緣3.2 流程圖3.3部分地高辛標(biāo)記DNA3.4部分標(biāo)記效率的檢測3

10、.5部分DNA固定3.6部分雜交3.7部分免疫檢測3.8部分洗脫和DNA斑點(diǎn)與另一探針的雜交3.3 地高辛標(biāo)記DNA介紹隨機(jī)引物標(biāo)記的DNA帶有地高辛-11-dUTP,這一標(biāo)記采用的是地高辛高效引物試劑，這是一種含有隨機(jī)六碳糖，dNTP混合物的5濃度標(biāo)記混合物，其中dNTP混合物包括堿性標(biāo)記的地高辛-11-dUTP，標(biāo)記級的Klenow酶和適合的反應(yīng)緩沖液。附加設(shè)備和所需試劑此表中列出了成分，儲存條件和除了試劑盒成分外所需試劑的用途。溶液成分儲存條件/穩(wěn)定性用途水高壓滅菌的雙蒸水15-25，穩(wěn)定稀釋DNAEDTA(乙二胺四乙酸)0.2M EDTA,pH 8.015-25，穩(wěn)定終止標(biāo)記反應(yīng)模板D

11、NA下表中列出了模板DNA所需特征： 特征詳細(xì)信息純度模板DNA應(yīng)該采用the High Pure Plasmid Isolation Kit進(jìn)行制備。當(dāng)采用其他商業(yè)化的純化試劑盒進(jìn)行純化時，我們建議額外進(jìn)行一次苯酚/氯仿抽提以去除殘余的蛋白質(zhì)。在標(biāo)記之前如果對模板進(jìn)行限制酶切或者其他酶的修飾作用，那么此步驟也是需要進(jìn)行的。大小為了獲得理想的結(jié)果，模板DNA應(yīng)該線性化，且大小應(yīng)該在100bp以上。如果模板DNA大于5kb，那么在標(biāo)記之前應(yīng)該采用限制性酶切序列為4個核苷酸的限制性酶（如Hae ）對模板進(jìn)行酶解。數(shù)量上面步驟描述原則上10ng-3g的模板均可以標(biāo)記上，然而請仔細(xì)查看在給定的表中，用

12、于你的雜交實驗所需的探針?？梢愿鶕?jù)提供的操作方法放大總體積和成分用量來獲得更大量的標(biāo)記探針。如果要檢測復(fù)雜基因組中的單拷貝基因，需標(biāo)記的模板DNA用量至少300ng（探針濃度：25ng/mL 雜交液）。標(biāo)記從瓊脂糖凝膠上分離的DNA如果你想要完成基因組的southern 雜交，你應(yīng)該利用瓊脂糖凝膠電泳將插入載體的模板DNA從載體上分離出來。 為了從凝膠中分離DNA,你可以用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒(the Agarose Gel DNA Extraction Kit)進(jìn)行大小在400bp-5kbp范圍內(nèi)DNA片段的回收。 這一試劑盒既可以用于標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠也可用于低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。然后，不需

13、要進(jìn)一步純化即可對DNA片段進(jìn)行高效的地高辛標(biāo)記。然后標(biāo)記好的探針應(yīng)該用高效的PCR產(chǎn)物純化試劑盒（High Pure PCR Product Purification Kit）進(jìn)行純化，以去除殘留的瓊脂糖顆粒。步驟此步驟用于標(biāo)記10ng-3g DNA ?？梢酝ㄟ^擴(kuò)大所有成分和體積標(biāo)記更大量的DNA（最高達(dá)10g）。步驟操作1向一個反應(yīng)管仲中加入1g模板DNA（線性或超螺旋）和高壓滅菌的雙蒸水，終體積達(dá)16L。2沸水浴10分鐘以變性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全變性對于標(biāo)記的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-High Prime(1號管)，并取4L加入到變性DNA中，混合并簡

14、單離心。37孵育1小時或者過夜。注意：較長的孵育時間（最高達(dá)20小時）能夠提高地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量（見下表）4加入2L 0.2M EDTA(pH8.0) 和/或 65加熱10分鐘終止反應(yīng)。注意：采用地高辛高效引物獲得的地高辛標(biāo)記片段的長度范圍可以從200bp到1000bp甚至更長，這主要取決于原始模板DNA的長度。標(biāo)記反應(yīng)的產(chǎn)量表1：此表向您展示了在適宜條件下地高辛高效引物標(biāo)記的產(chǎn)量。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中每個實驗采用1g DNA 作為模板。1小時內(nèi)，大約有15%的核苷酸參與到了0.8g新合成的地高辛標(biāo)記DNA中。20小時后消耗了大約38%的核苷酸。模板DNA1h20h 10 ng45 ng600 n

15、g30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500 ng300 ng450 ng2000 ng1000 ng850 ng2300 ng3000 ng1350 ng2650 ng使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量進(jìn)行反應(yīng)，并檢測反應(yīng)1小時和反應(yīng)20小時的差異。地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量由放射線示蹤器進(jìn)行測定，并通過斑點(diǎn)雜交進(jìn)行證實 （10個獨(dú)立標(biāo)記實驗的平均值）。圖3 來自于不同量模板DNA的地高辛標(biāo)記DNA在37孵育1小時和20小時后的產(chǎn)量3.4 標(biāo)記效率的確定介紹地高辛標(biāo)記DNA產(chǎn)量的確定對于獲得最佳的，具有可重現(xiàn)性的雜交結(jié)果十分重要。在雜交混合物中

16、探針濃度過高容易產(chǎn)生背景，而太低濃度則容易導(dǎo)致信號弱。實驗原則檢測標(biāo)記探針質(zhì)量的好方法是直接檢測法。步驟描述1將地高辛標(biāo)記DNA的一系列稀釋梯度點(diǎn)到一小塊帶正電荷的尼龍膜上。尼龍膜部分區(qū)域已經(jīng)點(diǎn)好一系列稀釋梯度的地高辛標(biāo)記的對照DNA（2號管）作為標(biāo)準(zhǔn)。2采用anti-DIG-AP結(jié)合物(4號管)和隨時即用的CSPD對尼龍膜進(jìn)行免疫檢測。所需附加溶液的制備請找出下表中的成分和所需制備的試劑。下表中的緩沖液也可以在地高辛洗滌和封阻緩沖液無DNA酶和RNA酶系列產(chǎn)品中獲得。請注意：標(biāo)記效率確定實驗中檢測部分所需的試劑和工作試劑應(yīng)與你的雜交實驗（請看3.7章）中化學(xué)發(fā)光檢測使用的試劑一致。這些試劑可

17、以大量制備，在第3.7章中也將用到。溶液成分/制備儲存/穩(wěn)定性用途洗滌緩沖液0.1M馬來酸0.15M NaClpH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,穩(wěn)定去除未結(jié)合的抗體馬來酸緩沖液0.1M馬來酸0.15M NaCl用NaOH(固體)調(diào)節(jié)pH值到7.5(20)15-25,穩(wěn)定封阻液的稀釋檢測緩沖液0.1M Tris-HCl0.1M NaClpH 9.5(20)15-25,穩(wěn)定調(diào)整pH值到9.5試劑盒工作溶液的制備下表中列出試劑盒工作溶液的制備方法：溶液成分/制備方法儲存/穩(wěn)定性用途封阻溶液用馬來酸緩沖液按照1：10的比例將10封阻液（6號管）稀釋成1工作溶液一直新鮮

18、制備封阻膜上非特異結(jié)合位點(diǎn)抗體溶液每次使用前將原始管仲的anti-digoxigenin-AP(4號管)10000rpm離心5分鐘。然后從表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：10000（75mU/mL）的比例稀釋anti-digoxigenin-AP2-8，12h與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合稀釋系列根據(jù)合成核苷酸的預(yù)期產(chǎn)量開始下面的的系列稀釋，標(biāo)記的探針和地高辛標(biāo)記的對照DNA（2號管）應(yīng)該稀釋到1ng/L。利用第3.3章中圖表可以最好的估計出在你的探針中地高辛標(biāo)記DNA的預(yù)期產(chǎn)量。產(chǎn)量取決于起始時的模板量和孵育時間。注意：表1中給出的產(chǎn)量是采用高純度的DNA模板在最佳條件下生產(chǎn)出的。按照下表中

19、的描述對你標(biāo)記的探針和你的對照DNA進(jìn)行一系列的梯度稀釋。管DNA(L)來自于管#DNA 稀釋緩沖液（3號管）(L)稀釋比例終濃度1稀釋的原液1ng/L2514951：10010pg/L3152351：3.33pg/L452451：101pg/L553451：100.3 pg/L654451：100.1 pg/L755451：100.03 pg/L856451：100.01 pg/L90-50-0操作步驟下面的步驟描述的是直接檢測。注意：在全部的步驟中，用足夠的緩沖液體積完全覆蓋膜。步驟操作1分別從你標(biāo)記的探針和標(biāo)記對照DNA的2-9號管中取出1 L點(diǎn)在尼龍膜上2通過紫外交聯(lián)或者120烘烤30

20、分鐘的方法將核酸固定在膜上3將膜轉(zhuǎn)移到一個裝有20mL 馬來酸緩沖液的塑料容器中在15-25中振蕩孵育2分鐘4在10mL 封阻液中孵育30分鐘5在10mL 抗體溶液中孵育30分鐘6用10mL洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15分鐘7在10mL檢測緩沖液中平衡2-5分鐘8將膜上帶有DNA的一面朝上，放在一個折疊夾上（或者雜交袋），向膜上加入0.1mL的隨時即用的CSPD(即從5號管中滴4滴)。立即折疊夾的另一面蓋到膜上，均勻的鋪平底物，且膜上不能有氣泡。15-25中孵育5分鐘9除去多余的液體，將折疊夾的邊緣都封好注意：在暴露過程中膜干了會導(dǎo)致黑背景的產(chǎn)生。10在15-25中，采用圖像儀曝光大約5-20分

21、鐘，或者用X光片曝光15-25分鐘。注：化學(xué)發(fā)光持續(xù)至少48小時。在檢測反應(yīng)開始后的幾小時里信號是不斷增強(qiáng)的，將達(dá)到一個閾值，這時信號強(qiáng)度幾乎可以持續(xù)到接下來的24-48小時。很多曝光都可以在此理想的信號強(qiáng)度下完成多。結(jié)果分析比較對照與你的標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)生的點(diǎn)的強(qiáng)度差異，并計算出地高辛標(biāo)記DNA的量。如果你的探針稀釋后量達(dá)0.1pg的點(diǎn)與對照DNA的點(diǎn)均可見，那么說明標(biāo)記的探針達(dá)到了預(yù)期的標(biāo)記效率（見第3.3章中表1），能夠滿足雜交所需的探針濃度。3.5 DNA的轉(zhuǎn)移和固定轉(zhuǎn)移方法和膜凝膠電泳的標(biāo)準(zhǔn)操作方法，膠的變性和中和均參照參考文獻(xiàn)中Sambrook等的文章。膠中不加入EB會更好，因為EB可能

22、引起背景不均勻的問題。所有普通類型的DNA轉(zhuǎn)移方法都適用于后續(xù)的地高辛雜交實驗（7，8）在你們的實驗中，用20SSC采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)印的方法就愛那個DNA轉(zhuǎn)印到帶有正電荷的尼龍膜上可以獲得最好的結(jié)果。注意：堿性轉(zhuǎn)移（如在0.4M NaOH中）不適用于地高辛標(biāo)記分子量marker的轉(zhuǎn)移。固定操作將DNA固定到膜上可以通過下面的任何一種操作：如果你想采用那么紫外交聯(lián)的方法（尼龍膜）將膜放到已經(jīng)用10SSC 浸透的Whatman 3MM濾紙上。洗滌之前次啊用紫外交聯(lián)這塊濕潤的膜紫外交聯(lián)后，將膜放入雙蒸水中簡單沖洗一下，然后自然晾干。120，烘烤（尼龍膜）在2SSC簡單的洗滌一下膜將尼龍膜放在120下烘烤

23、30分鐘或者根據(jù)操作說明的要求進(jìn)行操作。80，烘烤（尼龍膜）在2SSC簡單的洗滌一下膜將尼龍膜放在80下真空烘烤2小時膜的儲存請根據(jù)下表選擇膜的儲存方法。如果那么你想繼續(xù)實驗立即將這個膜進(jìn)行預(yù)雜交如果你想稍后進(jìn)行實驗?zāi)敲磳⒏稍锏哪Υ嬗?-83.6雜交需要的附加設(shè)備 冰水浴 震蕩水浴 或雜交爐 耐高溫的塑料或者玻璃盒，培養(yǎng)皿，滾筒瓶或者可密封的塑料袋注意：不要用敞口的容器盛放雜交緩沖液雜交工作溶液的制備 分兩次小心的將64mL無菌雙蒸水加入到地高辛雜交顆粒瓶（7號瓶）中，然后立即在37條件下攪拌5分鐘進(jìn)行溶解。雜交溫度 適宜的雜交溫度是根據(jù)GC含量和探針與靶片段的相似百分?jǐn)?shù)計算獲得的，具體的公

24、式如下： Tm =49.82+0.41%(G+C)-(600/I) I=能夠雜交上的片段的長度，以堿基對進(jìn)行計算 Topt.= Tm -（2025） 這一給出數(shù)字的方程式是根據(jù)雜交溶液中含有50%甲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)方程式計算得到的。用于地高辛雜交液進(jìn)行雜交的實際雜交溫度Topt. 要比計算出的Tm低20-25。Topt. 可以作為一個嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交溫度，允許探針和靶序列之間有18%的錯配。當(dāng)你的探針與靶序列的相似度低于80%時，你應(yīng)該相應(yīng)的降低Topt（大約每1%的錯配要降低1.4），同時相應(yīng)的調(diào)整嚴(yán)謹(jǐn)洗滌步驟（即提高SSC濃度和降低洗滌溫度）。操作步驟 請參照下表進(jìn)行實驗。步驟操作1將適量體積的雜交緩

25、沖液提前預(yù)熱到雜交溫度（37-42）。在適當(dāng)?shù)娜萜髦袦睾驼袷?0分鐘進(jìn)行預(yù)雜交。注意：膜應(yīng)該自由的移動。尤其是如果你在同一個預(yù)雜交溶液中放入幾張膜。2變性地高辛標(biāo)記的DNA探針（在地高辛雜交液中濃度大約為25ng/mL）是將探針放入沸水浴中煮5分鐘后快速放入冰水混合物中冷卻。注意：因為DIG-11-dUTP 是堿標(biāo)記的，因此DNA 探針不能用堿處理（NaOH）的方法變性。3將變性的地高辛標(biāo)記探針加入到預(yù)熱的地高辛雜交緩沖液（每100cm2 的膜加入3.5mL雜交緩沖液）中，充分混合但要避免產(chǎn)生泡沫（氣泡容易產(chǎn)生背景）4倒出預(yù)雜交液，向膜上加入探針雜交液的混合物。溫和振蕩孵育4小時或延長孵育至過

26、夜。雜交液的儲存含有地高辛標(biāo)記探針的地高辛雜交液可以儲存在-15到-25，可以反復(fù)使用幾次，在每次使用前需要68新鮮變性10分鐘。注意：不可以將雜交液煮沸。嚴(yán)謹(jǐn)洗滌對于大部分DNA:DNA應(yīng)用,用0.5SSC進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)洗滌已經(jīng)足夠。針對每個探針來說，正確的洗滌條件應(yīng)該依據(jù)經(jīng)驗來確定。對于人基因組DNA，采用的條件是0.5SSC，65。探針長度大于150bp且GC含量高時，應(yīng)在68下進(jìn)行洗滌。對于長度為100bp或更短的探針，洗滌溫度應(yīng)該降低。此表描述了怎樣完成后面的雜交洗滌。步驟操作1用足夠的2SSC 0.5%SDS連續(xù)振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。265-68，用足夠的0.5SSC 0.5%SDS

27、（提前預(yù)熱到洗滌溫度）連續(xù)振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。3.7 免疫檢測需要附加的試劑 請找出下表中的成分和所需制備的試劑。下表中的緩沖液也可以在地高辛洗滌和封阻緩沖液無DNA酶和RNA酶系列產(chǎn)品中獲得。溶液成分/制備儲存/穩(wěn)定性用途洗滌緩沖液0.1M馬來酸0.15M NaClpH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,穩(wěn)定膜的洗滌馬來酸緩沖液0.1M馬來酸0.15M NaCl用NaOH(固體)調(diào)節(jié)pH值到7.5(20)15-25,穩(wěn)定封阻液的稀釋檢測緩沖液0.1M Tris-HCl0.1M NaClpH 9.5(20)15-25,穩(wěn)定堿性磷酸酶的緩沖液試劑盒工作溶液的制備

28、下表中列出試劑盒工作溶液的制備方法：溶液成分/制備方法儲存/穩(wěn)定性用途封阻溶液用馬來酸緩沖液按照1：10的比例將10封阻液（6號管）稀釋成1工作溶液一直新鮮制備封阻膜上非特異結(jié)合位點(diǎn)抗體溶液每次使用前將原始管仲的anti-digoxigenin-AP(4號管)10000rpm離心5分鐘。然后從表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：10000（75mU/mL）的比例稀釋anti-digoxigenin-AP2-8，12h與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合操作步驟此表描述了完成一張100cm2膜的免疫檢測方法。注意：所有的孵育均是在15-25下，振蕩完成的。如果膜還需要再次與探針雜交，那么任何時候都不要讓膜

29、干。步驟操作1雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌后，將膜簡單的用洗滌緩沖液沖洗1-5分鐘2在100mL 封阻液中孵育30分鐘3在20mL 抗體溶液中孵育30分鐘4用100mL洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15分鐘5在20mL檢測緩沖液中平衡2-5分鐘6將膜上帶有DNA的一面朝上，放在一個折疊夾上（或者雜交袋），向膜上加入1mL的隨時即用的CSPD(5號管)。立即折疊夾的另一面蓋到膜上，均勻的鋪平底物，且膜上不能有氣泡。15-25中孵育5分鐘7除去多余的液體，將折疊夾的邊緣都封好注意：在暴露過程中膜干了會導(dǎo)致黑背景的產(chǎn)生。8將潮濕的膜放在37條件下孵育10分鐘，以增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)。9在15-25條件下，采用圖像儀曝光大約5-20分鐘，或者用X光片曝光15-25分鐘。注意：化學(xué)發(fā)光持續(xù)至少48小時。在檢測反應(yīng)開始后的幾個小時里信號是不斷增強(qiáng)的，將達(dá)到一個閾值，這時的信號強(qiáng)度幾乎可以持續(xù)到接下來的24-48小時。很多曝光都可以在此理想的信號強(qiáng)度下完成多。3.8 DNA印記的洗脫和再次探針雜交主要信息 印記中的堿性標(biāo)記形式的DIG-11-dUTP 能夠更容易更有效的被洗脫，以用于再一次的雜交實驗。所需附加的儀器和試劑 大燒杯 水浴 10SSC 10% SDS 0.2N NaOH操作步驟膜的洗脫。 注意：如果計劃印記需要洗脫和再次雜交，那么膜在任何