流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用課件

1、流式細(xì)胞術(shù)原理及臨床應(yīng)用,1,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer) 是現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器；當(dāng)細(xì)胞（或其他粒子）以單個(gè)方式依次通過(guò)探測(cè)光束時(shí)，能夠采集細(xì)胞被光照時(shí)產(chǎn)生的各種信號(hào)，然后對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理，并能對(duì)多個(gè)參數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的一種儀器 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM) 利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個(gè)、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù),流式細(xì)胞術(shù),2,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù),激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、顯微熒光技術(shù)、光電子技

2、術(shù)、流體噴射技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、納米技術(shù)以及分子生物學(xué)和免疫學(xué)等多門(mén)學(xué)科知識(shí) 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的綜合交叉的產(chǎn)物，是集多種技術(shù)發(fā)展于一體的“大成者” 廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)和血液學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域 20世紀(jì)70年代發(fā)展至今，儀器設(shè)備更趨完善，在應(yīng)用上也逐漸由基礎(chǔ)研究進(jìn)入到臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，為細(xì)胞分析提供全新手段,3,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,1930 Caspersson G=R1 or R2; G=R1 not R2,（四）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng),34,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,十字門(mén),線性門(mén),（四）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng),35,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)的最大特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞

3、器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲得多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選 細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量,流式細(xì)胞儀特點(diǎn),36,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,目前國(guó)內(nèi)主要流式細(xì)胞儀廠家,Beckton Dickinson(BD),BACKMAN COULTER,37,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,Epics XL 單激光四色，分析型,CyAn三激光九色，分析型,FC 500 單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率較高，分析型,Gallios 三激光十色，分析型,MoFlo XDP 高端分選型,Beckman Coulter公司流式細(xì)胞儀,38,流式細(xì)胞術(shù)及其臨

4、床應(yīng)用,BD公司分析型流式細(xì)胞儀,FACS Calibur 雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高,FACS Canto II 雙激光六色，三激光八色,FACS Verse雙激光六色，三激光八色,AccuriC6 雙激光四色,39,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,BD公司分析型流式細(xì)胞儀,LSRFortessa X-20 五激光十八色，分析型最高配,LSR II 雙激光六色，三激光八色，四激光十色,40,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,FACSVantage SE,FACSAria III,Influx,BD公司分選型流式細(xì)胞儀,41,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,BD FACS Canto II,雙激光或三激光，8色分析 八

5、角形/三角形光信號(hào)接受系統(tǒng)，利用全反射的光路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，避免透射過(guò)程對(duì)光信號(hào)的損耗，提高熒光靈敏度 兼顧科研需求和臨床檢測(cè) BD FACSTM 7-color setup beads使體外診斷中所有實(shí)驗(yàn)的日常儀器設(shè)置在一管中進(jìn)行 專門(mén)配備有FACSCanto臨床軟件，淋巴細(xì)胞亞群，HLA-B27等臨床自動(dòng)檢測(cè)和分析軟件，直接報(bào)告檢測(cè)結(jié)果 獨(dú)立液流車系統(tǒng)，保持液流的穩(wěn)定 最小樣本量： 30微升 手動(dòng)上樣/自動(dòng)連續(xù)上樣 獲得SFDA認(rèn)證,42,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,BD LSRFortessa X-20,提供5激光，18色分析 18種波長(zhǎng)的激光器，橫跨從紫外到紅外全光譜范圍，提供靈活的光譜選擇 滿

6、足高端科研需求,43,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,淋巴細(xì)胞亞群 HLA-B27 CD55、CD59檢測(cè) CD34造血干細(xì)胞計(jì)數(shù) 白血病和淋巴瘤免疫分型 TH1/TH2細(xì)胞檢測(cè) 血小板活化 炎癥感染指標(biāo)CD64 網(wǎng)織紅細(xì)胞/血小板檢測(cè) 微小殘留病灶（MRD） 腫瘤細(xì)胞倍體（DNA） 細(xì)胞凋亡 ,流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用,44,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,標(biāo)本的種類： 血液、骨髓穿刺液、各種體液（胸水、腹水、腦脊液）、組織（如淋巴 結(jié)、肝、脾）及肺泡灌洗液等 抗凝劑： 外周血：EDTA、肝素和枸櫞酸均可 骨髓：肝素（推薦）、EDTA 血小板：枸櫞酸 儲(chǔ)存時(shí)間： EDTA：2448h 肝素：4872h 枸櫞酸：

7、72h 嚴(yán)重溶血、凝血或壞死的樣本應(yīng)棄用,單細(xì)胞懸液,標(biāo)本要求,45,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,淋巴細(xì)胞亞群分析,試劑：BD Multitest IMK Kit 標(biāo)本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC CD3-FITC/CD19-PE/CD45-PerCP/CD16CD56-APC 檢測(cè)指標(biāo)：T細(xì)胞（CD3+CD4+、CD3+CD8-） B細(xì)胞（CD19） NK細(xì)胞（CD3-CD1656）,46,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,臨床意義反應(yīng)體內(nèi)免疫狀態(tài) CD4+T降低：病毒感染、惡性腫瘤、免疫缺陷病、免疫抑制劑使用 CD8+T增高：病毒及結(jié)核桿菌

8、感染，自身免疫性疾病活動(dòng)期、腫瘤、慢性活動(dòng)性肝炎 CD4/CD8降低： 處于免疫抑制狀態(tài) 免疫缺陷?。喝绨滩r(shí)的比值常顯著小于0.5 某些惡性腫瘤：如肝癌、食道癌、肺癌、膀胱癌等 某些病毒感染：HBV、EB、CMV等 NK細(xì)胞（CD3CD16+和/或CD56+）能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,淋巴細(xì)胞亞群分析,47,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,淋巴細(xì)胞亞群分析,HIV感染者,48,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,HLA-B27檢測(cè),試劑：BD HLA-B27 Kit 標(biāo)本：外周血 檢測(cè)指標(biāo)： T (CD3+)淋巴細(xì)胞上HLA-B27定性檢測(cè),49,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,臨床意義：

9、強(qiáng)直性脊柱炎（高度相關(guān)，90%） Reiters 綜合征（70-90%） 銀屑病關(guān)節(jié)炎 （50-60%） 急性前葡萄膜炎（40-50%）,HLA-B27檢測(cè),50,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,51,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,PNH診斷,試劑：CD59-FITC、CD55-PE 標(biāo)本：外周血 檢測(cè)指標(biāo)：CD55、CD59百分比 CD55、CD59熒光強(qiáng)度,陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）的發(fā)病機(jī)制為X染色體上的PIG-A基因發(fā)生突變，引起糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實(shí)的GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診斷的主要為CD55和CD59兩種，如果在紅細(xì)胞上出現(xiàn)CD55或/

10、和CD59的減少，可診斷為PNH,52,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,Normal,PNH,PNH診斷,53,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,造血干細(xì)胞計(jì)數(shù),試劑：BD Procount Progenitor Cell Enumeration Kit 標(biāo)本：骨髓、動(dòng)員后的外周血 配色：CD34-PE、CD45-PerCP、nucleic acid dye 檢測(cè)指標(biāo)：CD34及濃度,54,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,藍(lán)色熒光微球（數(shù)量已知）；紅色CD34細(xì)胞,干細(xì)胞特征： CD45表達(dá)弱陰性 (R2) CD34表達(dá)弱強(qiáng) (R4) DNA/RNA含量多，染色性較強(qiáng) (R1) 大?。‵SC）和顆粒度（SSC）淋巴細(xì)胞

11、相似,臨床意義： 血液系統(tǒng)疾病的造血干細(xì)胞移植 數(shù)量的檢測(cè) 采集時(shí)機(jī)的確定,造血干細(xì)胞計(jì)數(shù),56,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,白血病和淋巴瘤免疫分型,試劑：各種單克隆熒光抗體 標(biāo)本：骨髓、外周血、胸腹水、腦脊液、淋巴組織,57,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,分型方案：CD45設(shè)門(mén)，四色標(biāo)記， 臨床意義： 客觀、快速地分析 確定異常細(xì)胞系來(lái)源及分化階段 判斷預(yù)后,白血病和淋巴瘤免疫分型,58,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,正常骨髓細(xì)胞CD45/SSC,R1: 淋巴細(xì)胞 R2: 幼稚細(xì)胞 R3: 單核細(xì)胞 R4: 中性粒細(xì)胞 R5: 有核紅細(xì)胞,59,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,AML-M1,R2占94，表達(dá)CD33

12、,CD34,CD117,CD71,CD13,CD64,MPO,60,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,ALL(B),R2占65，表達(dá)CD79a,CD19,CD34,CD22,CD10,CD38,HLA-DR,61,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,臨床意義：CD4/CD8 結(jié)節(jié)病 特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化 肺部腫瘤疾病,CD4/CD85.04,62,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,Th1/Th2細(xì)胞檢測(cè),Th2，蠕蟲(chóng)感染 環(huán)境變應(yīng)原的應(yīng)答 IL-4、IL-5、IL-10等 介導(dǎo)體液免疫,63,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,TH1/TH2細(xì)胞檢測(cè),細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá) IFN-（Th1）和IL-4（Th2） 檢測(cè)前需要刺激活化（PMA

13、+ ionomycin）46h Golgistop，含有莫能霉素（Monensin） 設(shè)門(mén)策略：CD3+CD8-,64,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,TH1/TH2細(xì)胞檢測(cè),65,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,感染性疾病CD64檢測(cè),CD64：FC受體 單核細(xì)胞（） 中性粒細(xì)胞（dim） 淋巴細(xì)胞（） 檢測(cè)指標(biāo)：中性粒細(xì)胞CD64表達(dá)強(qiáng)度 CD64指數(shù)CD64中性粒/CD64淋巴 臨床意義：細(xì)菌感染、膿毒血癥、敗血癥,66,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,感染性疾病CD64檢測(cè),CD45,CD64,CD64,CD64,CD64,67,流式細(xì)胞術(shù)及其臨床應(yīng)用,液相芯片技術(shù)CBA,CBA： Cytometric Bead Array 可溶性蛋白 ：