臨床PCR檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控方法

1、臨床PCR檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控方法,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 李金明,存在的問題,概念不清 不知道具體怎么做 不會(huì)寫室內(nèi)質(zhì)控的SOP 不知道如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物 不會(huì)分析室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果,室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問題,責(zé)任人不清。 質(zhì)控物的來源及濃度不清或不全，并且通常沒有說明陰性質(zhì)控物的來源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒有任何的質(zhì)量檢驗(yàn)，定量結(jié)果沒有溯源性。 沒有明確所選用的質(zhì)控方法。對(duì)前20次的測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控沒有解決方法。 沒有明確的失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒有陰性失控的判斷方法。 沒有失控后的分析及處理措施。,室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,I

2、QC)的概念,由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測(cè)和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測(cè)定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作。 可概括為:(1)執(zhí)行者：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員；(2)目的：監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的重復(fù)性；(3)功能：決定了當(dāng)批測(cè)定的有效性，報(bào)告可否發(fā)出。是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的即時(shí)性評(píng)價(jià)。,室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容,主要包括三個(gè)方面： （1）測(cè)定前的質(zhì)量控制； （2）統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制； （3）質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)。,測(cè)定前的質(zhì)量控制,實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理 理想的試劑和操作方法 人員培訓(xùn),實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)

3、備及管理,實(shí)驗(yàn)室空間及工作流程的設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設(shè)備、穩(wěn)壓或不間斷電源,理想的PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A,理想的PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B,臨床PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則,各區(qū)獨(dú)立 注意風(fēng)向 因地制宜 方便工作,“十六字口訣”,傳遞窗,傳遞窗,傳遞窗,臨床PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的特點(diǎn),“無基因”概念 實(shí)驗(yàn)室要有嚴(yán)格的人員進(jìn)入限制和程序 使用合格的試劑和消耗品,PCR實(shí)驗(yàn)室“污染”的主要來源,臨床標(biāo)本中存在的大量待測(cè)微生物 科研中得到的質(zhì)?？寺?以前分析研究的特定微生物 大量存在于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的特定微生物 以前擴(kuò)增產(chǎn)物的殘留污染。這也是PCR實(shí)驗(yàn)室最容易產(chǎn)生的將造成假陽性的“污染”。,PCR實(shí)

4、驗(yàn)室的重要防“污染”措施,實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的嚴(yán)格遵守 化學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面可使用10的次氯酸鈉（漂白劑）清洗 ；有些物品比如放置擴(kuò)增反應(yīng)管的盤必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時(shí)，在轉(zhuǎn)回之前，應(yīng)將其置于210的次氯酸鈉溶液中過夜，并充分沖洗。 紫外照射：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室空間 UNG,儀器設(shè)備及管理,PCR儀、離心機(jī)、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，并定期維護(hù);PCR儀、加樣器、恒溫設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn),理想的試劑:試劑的質(zhì)檢,核酸提取或標(biāo)本處理方法的抗干擾能力（能否 有效地去掉PCR抑制物） 測(cè)定下限(Detection limit)（定性測(cè)定） 測(cè)定準(zhǔn)確性和線性范圍 批內(nèi)變異和批間變

5、異 試劑批間的一致性 有否污染 其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說明書等,理想的操作方法,按照試劑盒說明書操作即可嗎? 操作中影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 寫出具有可操作性的SOP,人員培訓(xùn),培訓(xùn)所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護(hù)和校準(zhǔn)；試劑、方法原理；質(zhì)量管理體系；相關(guān)法律法規(guī)、相關(guān)領(lǐng)域的新技術(shù)、新理念和新進(jìn)展；實(shí)驗(yàn)操作技能等。 如何培訓(xùn)：講座、討論、自學(xué)和參加培訓(xùn)班等。 培訓(xùn)的評(píng)估：書面考試、實(shí)驗(yàn)考核、討論心得、論文、綜述等。,統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,質(zhì)控物濃度的選擇 每次（批）測(cè)定質(zhì)控物的數(shù)量及放置 質(zhì)控規(guī)則 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 “即刻法”質(zhì)控方法 “假陽性”的統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法,質(zhì)控物

6、濃度的選擇,定量測(cè)定：測(cè)定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度 定性測(cè)定：接近方法測(cè)定下限的濃度 陰性質(zhì)控物,每次（批）測(cè)定質(zhì)控物的數(shù)量及放置,標(biāo)本數(shù)量如小于30，弱陽性和陰性質(zhì)控各1份，標(biāo)本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應(yīng)按比例增加 均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本一同處理（核酸提?。?擴(kuò)增時(shí)的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。但在擴(kuò)增儀中的位置，不應(yīng)永久性的固定的在一個(gè)孔，而應(yīng)在每次擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的順延，以使在一定的時(shí)間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測(cè)每一個(gè)孔的擴(kuò)增有效性。,陰性質(zhì)控樣本的種類,陰性原血清樣本 實(shí)驗(yàn)過程中帶入的空管 僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管,陰性原血清樣本的功能,監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的以前

7、擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染” 由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染。具體地說，如強(qiáng)陽性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染、強(qiáng)陽性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時(shí)在較高溫孵育時(shí)蓋子崩開等 擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。,核酸提取過程中帶入的空管,監(jiān)測(cè)核酸提取過程中的實(shí)驗(yàn)室“污染”的存在（在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，開口放置于核酸提取的操作臺(tái)面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進(jìn)行擴(kuò)增 ）,僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管,監(jiān)測(cè)試劑的“污染”,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 質(zhì)控規(guī)則的功能 常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義,質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式,通常質(zhì)控規(guī)則以符號(hào)AL來表示，其中A為質(zhì)控測(cè)定中超出質(zhì)量控制限的測(cè)定值的個(gè)數(shù)，L為控制限

8、，通常用均值或均值13SD來表示。 當(dāng)質(zhì)控測(cè)定值超出控制限L時(shí)，即可將該批測(cè)定判為失控。 常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測(cè)定值中，如果有一個(gè)測(cè)定值超出均值3s范圍，即可將該批測(cè)定判為失控。,質(zhì)控規(guī)則的功能,簡(jiǎn)單地說就是用于判斷測(cè)定批的失控還是在控。,常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義,符 號(hào) 定 義 12S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出2s控制限。 13S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出3s控制限。 22S 兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或2s控制限。 R4S 同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的 差值超出4s控制限。 41S 四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定

9、值同時(shí)超出+1s或1s控制限。 7T 七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變 化。 10X 十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè)。,Levey-Jennings質(zhì)控圖方法,也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。,質(zhì)控圖,Levey-Jennings質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義,穩(wěn)定條件下，在20個(gè)IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個(gè)結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）

10、限度；在1000個(gè)測(cè)定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個(gè)。 如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。,“即刻法”質(zhì)控方法,“即刻法”質(zhì)控方法的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，即Grubs異常值取舍法 ； 只要有3個(gè)以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。,“假陽性”的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法,基于日常檢驗(yàn)的陽性率比值(呈正態(tài)分布) 直接概率計(jì)算方法（不呈正態(tài)分布）,基于日常檢驗(yàn)的陽性率比值,半Levey-Jennings質(zhì)控圖法,質(zhì)控規(guī)則,當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽性時(shí),不管陽性率測(cè)定比值為何，均為失控，所有陽性標(biāo)本須重新測(cè)定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。 如果陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測(cè)定陽性比值超出+

11、3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次結(jié)果陰性結(jié)果根據(jù)陽性質(zhì)控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽性樣本結(jié)果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高的原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本的情況下重新檢測(cè)。,可能的幾種失控表現(xiàn),曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室被污染如標(biāo)本泄漏，產(chǎn)物泄漏，試劑被污染等 向上的趨勢(shì)性變化：可能存在累積性的產(chǎn)物污染，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人結(jié)果的陽性率逐漸增高。此時(shí)實(shí)驗(yàn)室需要進(jìn)行徹底清潔。,直接概率計(jì)算法,按統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，一個(gè)事件發(fā)生的概率小于5%被稱為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。 當(dāng)一個(gè)小概率事件發(fā)生時(shí)，則可能有誤差存在，有必要對(duì)其

12、發(fā)生的原因進(jìn)行分析。 對(duì)每天的日常病人結(jié)果中陽性率出現(xiàn)的概率進(jìn)行計(jì)算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時(shí)，則可判為失控。,根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算,在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中某檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果的陽性率為p,計(jì)算在n個(gè)血液樣本中有k個(gè)陽性結(jié)果的概率。根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算公式如下： P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k (1) 其中n為當(dāng)次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)，k為陽性個(gè)數(shù)，p為陽性率。 P(X=k)5%為失控。此時(shí)，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報(bào)告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。,根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算,如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBV DNA，平常病人結(jié)果的陽性率為10%，即p=0.1, 在某一次檢測(cè)25個(gè)樣本

13、出現(xiàn)6個(gè)陽性結(jié)果，19個(gè)陰性結(jié)果，則檢測(cè)過程中是存在污染的可能性可通過下述方法計(jì)算。即計(jì)算在25個(gè)樣本中出現(xiàn)6個(gè)或6個(gè)以上陽性結(jié)果的概率，此時(shí)的概率為1-（獲得0個(gè)或1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)或多5個(gè)陽性結(jié)果的概率）即： 1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334 則在這個(gè)實(shí)驗(yàn)室一次檢測(cè)25個(gè)標(biāo)本獲得6個(gè)或6個(gè)以上陽性結(jié)果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可

14、能性很小，可能有污染所致假陽性結(jié)果的可能。,根據(jù)泊松分布的概率計(jì)算,在血液篩查檢測(cè)中，許多實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)項(xiàng)目如HCV RNA 、CT、結(jié)核桿菌、淋球菌的陽性結(jié)果率均較低，這時(shí)雖然可以使用公式（1）計(jì)算概率，但如果標(biāo)本量很大，使用泊松分布來估計(jì)二項(xiàng)式分布是一種更為簡(jiǎn)便的方法。根據(jù)泊松分布，可使用下式計(jì)算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2) P(X=k)5%為失控。此時(shí)，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報(bào)告，所有陽性標(biāo)本在查清原因后重做。,根據(jù)泊松分布的概率計(jì)算,一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，某項(xiàng)目每次檢測(cè)結(jié)果的陽性率約為2%，則在100個(gè)樣本中出現(xiàn)8個(gè)陽性結(jié)果的概率。 根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計(jì)算概率，

15、此時(shí)n=100,p=0.02,k=8, np=2代入公式（2）計(jì)算得 P(X=10) =28e-2/8!=0.0009。,標(biāo)本間交叉污染的概率計(jì)算,如果所有陽性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標(biāo)本間的交叉污染，即陽性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計(jì)算公式如下： P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)! （3） 其中n為當(dāng)次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽性的個(gè)數(shù)。 當(dāng)某次實(shí)際測(cè)定標(biāo)本連續(xù)陽性的概率大于所計(jì)算的概率，則判為失控。陰性標(biāo)本結(jié)果可以發(fā)出，陽性標(biāo)本要考慮標(biāo)本間交叉污染的問題。,標(biāo)本間交叉污染的概率計(jì)算,如在一次檢測(cè)100個(gè)標(biāo)本的HBV DNA檢測(cè)中，所有兩個(gè)陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)

16、的概率為： P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率為2.0%。 因此，如在100個(gè)標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)為陽性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。 而在一次檢測(cè)100個(gè)標(biāo)本，所有三個(gè)陽性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率為0.06%。 因此，如果如在100個(gè)標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)三個(gè)為陽性次數(shù)有1次，即概率為1.0%，為失控。,室內(nèi)質(zhì)量控制的評(píng)價(jià),IQC是一個(gè)集體活動(dòng)，不光是對(duì)實(shí)驗(yàn)室一次測(cè)定的有效性的判斷，也反應(yīng)了實(shí)驗(yàn)室測(cè)定趨勢(shì)的變化。 IQC的失控不能做為處罰的依據(jù)

17、，應(yīng)建設(shè)性的找出失控的原因，針對(duì)其采取措施加以改進(jìn)。 對(duì)IQC應(yīng)定期進(jìn)行評(píng)價(jià)。,陽性質(zhì)控樣本失控的常見原因,核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。 儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。,避免假陰性的措施,純化核酸 標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定 稀釋標(biāo)本 使用“內(nèi)質(zhì)控”（Internal Control,IC),陰性質(zhì)控樣本的常見失控原因,擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染” 臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉 “污染”,