細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)-血站應(yīng)用指南天津市天大天發(fā)科技有限公司目 錄一 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求21 細(xì)菌內(nèi)毒素單位：eu22 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：23 血站常用檢測(cè)品種的內(nèi)毒素限值25 檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的設(shè)備46 跟細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)有關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：4二 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所用試劑的基礎(chǔ)知識(shí)51細(xì)菌內(nèi)毒素51.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品51.2細(xì)菌內(nèi)毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)(lps)：51.3細(xì)菌內(nèi)毒素在水溶液中的狀態(tài)：61.4 細(xì)菌內(nèi)毒素的耐熱特性62 鱟試劑（tal）62.1細(xì)菌內(nèi)毒素和鱟試劑生化反應(yīng)原理：72.2 鱟試劑的凝膠反應(yīng)過(guò)程觀測(cè)83 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水83.1 藥典對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的要求83.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

2、用水注意事項(xiàng)84 樣本處理劑8三 檢測(cè)方法101 各類樣品的預(yù)處理及檢測(cè)方法102 血液保存液內(nèi)毒素檢測(cè)實(shí)例112.1 試驗(yàn)器材及試劑112.2 供試品資料112.3 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)112.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程112.5 結(jié)果分析133 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)報(bào)告樣例13四 bet系列細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀介紹211 生產(chǎn)企業(yè)技術(shù)實(shí)力雄厚，研究歷史深久。212 儀器發(fā)展的重大事件223 儀器應(yīng)用范圍234 性能參數(shù)235 檢測(cè)原理245.1光密度反應(yīng)時(shí)間(t0.02)取值方法245.2反應(yīng)速率測(cè)定及濃度計(jì)算方法255.3儀器直接鑒別葡聚糖存在的原理256 儀器突出特色276.1 更加符合藥典276.2 檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)

3、確276.3 降低檢測(cè)成本27附件 全國(guó)部分用戶名單27第28 頁(yè)一 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求1 細(xì)菌內(nèi)毒素單位：eu 關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素的量值在80年代幾乎都是以重量單位來(lái)表示,它很不科學(xué)，相同重量的內(nèi)毒素，由于菌株來(lái)源不同，提取方法各異而且所加附形劑不同，因此其生物活性相差很大。如ec-2和ec-5，其重量換算單位分別：5eu/ng 和10eu/ng，以效價(jià)單位表示內(nèi)毒素的量值是十分合理的。2001年開始美日歐等國(guó)開始執(zhí)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查國(guó)際統(tǒng)一調(diào)和案，內(nèi)毒素單位統(tǒng)一用eu表示，各國(guó)規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（包括中國(guó)）基本一致。 因此eu已經(jīng)成為國(guó)際公認(rèn)的細(xì)菌內(nèi)毒素量值，用eu表示的內(nèi)毒素相關(guān)論文也被世界各

4、國(guó)所承認(rèn)，而以前其他重量單位如ng，pg等已經(jīng)被淘汰。2 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品： 目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)：981，效價(jià)：9000eu/瓶。中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。3 血站常用檢測(cè)品種的內(nèi)毒素限值品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值血液保存液(i).小于5.56eu/ml血液保存液().小于5.56 eu/ml紅細(xì)胞保存液小于5.56 eu/ml輸液、輸血、注射器具不超過(guò)20 eu/件，與腦脊液接觸和胸內(nèi)應(yīng)用醫(yī)療器械不超過(guò)2.15 eu/件?？账芰涎?。不超過(guò)20eu/只一次性使用離心式血漿分離器，小于0.5eu/ml（浸提介質(zhì)100ml）血漿管路，小于0.5eu/ml（浸提介質(zhì)50ml）一次性使用機(jī)用采血器，小

5、于0.5eu/ml（浸提介質(zhì)0.98 ，符合要求；陰性對(duì)照：反應(yīng)時(shí)間遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度所用反應(yīng)時(shí)間，陰性合格；回收率和樣品：三種樣品回收率分別為107%,102%,93%,內(nèi)毒素含量小于限值,樣品合格。26注2005年版中國(guó)藥典附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中特別強(qiáng)調(diào)：為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過(guò)處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%-200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。一個(gè)完整的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)由四部分組成：陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、樣品、樣品陽(yáng)性，當(dāng)陰性對(duì)照合格，根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照和樣品陽(yáng)性檢測(cè)值

6、計(jì)算得出的回收率在50%-200%之間時(shí)，樣品的檢測(cè)值是有效的。3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)報(bào)告樣例easybet細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)報(bào)告檢驗(yàn)日期：2006-6-12 溫度范圍：36.9-37.0定量方法：反應(yīng)時(shí)間法 預(yù)設(shè)od值：0.02 零化期時(shí)間：260s標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgt=2.8975-0.23716 lgc =-0.9992管號(hào) 樣品名稱 批號(hào) 稀釋倍數(shù) 外加內(nèi)毒素 反應(yīng)時(shí)間 變異系數(shù) 回收率 實(shí)測(cè)內(nèi)毒素 原液含量 （eu/ml） （s） （cv） rc （eu/ml） （eu/ml） 1 陰性對(duì)照 8390 2 陰性對(duì)照 83903 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 2.0 712 7.09% 1.9023 1.90234

7、 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 2.0 6445 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 0.5 917 1.07% 0.5156 0.51566 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 0.5 9317 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 0.125 1196 7.82% 0.1366 0.13668 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 0.125 13369 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 0.03125 1834 0.72% 0.0292 0.029210 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 0.03125 181811 紅細(xì)胞保存液 3011 40 7061 1.95% 0.0001 0.00412紅細(xì)胞保存液 3011 40 7258 13紅細(xì)胞保存液 3011 40 0.5 912 0.31% 107% 0.5398 14紅細(xì)胞保存液 3011

8、 40 0.5 916 15血液保存液 0523 40 819016血液保存液 0523 40 8190 17血液保存液 0523 40 0.5 919 0.92% 102% 0.5123 18血液保存液 0523 40 0.5 931 19血液保存液 0512 40 7612 0.001 0.0420血液保存液 0512 40 8020 21血液保存液 0512 40 0.5 942 0.45% 93% 0.469 22血液保存液 0512 40 0.5 948 四 bet系列細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀介紹1 生產(chǎn)企業(yè)技術(shù)實(shí)力雄厚，研究歷史深久。 天津市天大天發(fā)科技有限公司（原天津大學(xué)精密儀器廠、天津

9、大學(xué)無(wú)線電廠）致力 于藥物檢測(cè)儀器的研究開發(fā)、制造、銷售服務(wù)已有二十多年的歷史，是通過(guò) iso9001質(zhì)量管理體系認(rèn)證的高新技術(shù)企業(yè)，是國(guó)內(nèi)知名的藥檢儀器和分析儀器的制造廠商。產(chǎn)品包括藥品溶出儀系列、微粒檢測(cè)儀系列、內(nèi)毒素分析儀系列等40余種產(chǎn)品，主要產(chǎn)品覆蓋了全國(guó)所有省區(qū)，部分產(chǎn)品已進(jìn)入海外市場(chǎng)，公司在藥檢領(lǐng)域樹立了良好的品牌形象，贏得了廣大用戶的贊譽(yù)。 在1993年，由開封155醫(yī)院、中國(guó)藥品生物制品檢定所、天津大學(xué)無(wú)線電廠聯(lián)合研制成功了bet-32型細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀，該儀器采用動(dòng)態(tài)濁度法，省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確，可定量檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，性能指標(biāo)已達(dá)到國(guó)際同類產(chǎn)品水平，被國(guó)家藥典委員會(huì)推薦使用，現(xiàn)

10、在已廣泛應(yīng)用于藥品質(zhì)量控制領(lǐng)域。市場(chǎng)占有率達(dá)80%以上，到目前為止已經(jīng)有近1000個(gè)用戶在使用該設(shè)備。天津大學(xué)無(wú)線電廠就是現(xiàn)在天津市天大天發(fā)科技有限公司的前身，該儀器完全符合2005版中國(guó)藥典的要求，可以進(jìn)行凝膠法、光度法的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，其中光度法包括動(dòng)態(tài)濁度法和動(dòng)態(tài)顯色法。儀器所配置的軟件功能強(qiáng)大，簡(jiǎn)便易用，具有實(shí)驗(yàn)設(shè)置向?qū)Чδ?，幫助用戶快速方便的建立新?shí)驗(yàn)；具備反應(yīng)時(shí)間法、反應(yīng)速率法等多種實(shí)驗(yàn)分析方法。多任務(wù)工作模式，可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)，循環(huán)使用檢測(cè)孔。bet-32m、bet-24a型儀器在2006年通過(guò)了醫(yī)療器械注冊(cè)，可用于血站有關(guān)內(nèi)毒素的檢測(cè)。1997年企業(yè)就開始貫徹執(zhí)行iso

11、9001質(zhì)量管理體系。2005年開始貫徹執(zhí)行yy/t-0287 idt iso13485醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系2 儀器發(fā)展的重大事件事件年代描述研制成功1993bet-32型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀研制成功，并通過(guò)了由天津市科委組織的專家鑒定。國(guó)際協(xié)作標(biāo)定1996參加了當(dāng)前使用的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的國(guó)際協(xié)作標(biāo)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差在允許范圍，被who采用。國(guó)內(nèi)協(xié)作標(biāo)定1997對(duì)儀器進(jìn)行了重大改進(jìn)，并推出了廉價(jià)的bet-16型。上述儀器又參加了我國(guó)的細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定。開發(fā)光密度限值法1998新增加了光密度限值法的反應(yīng)時(shí)間判定方法，使檢測(cè)速度大大提高，一般可以在半個(gè)小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)到0.1eu/ml以

12、下的內(nèi)毒素，單條標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量線性范圍擴(kuò)展到105以上，即可以從0.001-10eu/ml的范圍定量，可以滿足任何實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的要求。開發(fā)顯色法2000在原有的基礎(chǔ)上對(duì)bet-32的硬件電路進(jìn)行了大的改進(jìn)，改進(jìn)后的bet-32b在性能上更加穩(wěn)定，該儀器選用波長(zhǎng)為450納米的藍(lán)光作為檢測(cè)光源，可進(jìn)行比濁和比色兩種定量方法檢測(cè)。雙波長(zhǎng)儀器2001為了適應(yīng)臨床，藥廠多檢品，多任務(wù)的需求，我們開發(fā)出具有72個(gè)反應(yīng)孔的bet72型。反應(yīng)速率法2002軟件又開發(fā)了反應(yīng)速率法，具備了鑒別葡聚糖的能力，該儀器的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到或超過(guò)國(guó)外同類產(chǎn)品。安瓿檢測(cè)器專利2004研制出可以直接檢測(cè)鱟試劑安瓿的光電檢測(cè)器，并取得

13、了實(shí)用新型專利，大大簡(jiǎn)化用戶使用的操作步驟，避免污染。醫(yī)療器械注冊(cè)2006最新型號(hào)bet-32m，bet-24a通過(guò)了醫(yī)療器械注冊(cè)，為血站和臨床專用檢測(cè)儀器3 儀器應(yīng)用范圍醫(yī)療器具細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。臨床體液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。血站對(duì)血液及原材料中的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)。定量檢測(cè)真菌葡聚糖（使用封閉c因子的鱟試劑檢測(cè)）。定性檢測(cè)真菌葡聚糖（使用普通鱟試劑，儀器分析軟件鑒別葡聚糖反應(yīng)曲線）4 性能參數(shù)bet-32m型bet-24a型檢測(cè)孔數(shù)48孔24孔溫度控制37.00.3溫度漂移0.1(環(huán)境溫度從18-30)操作方式電腦連機(jī)操作(easybet 軟件)觸摸屏操作檢測(cè)波長(zhǎng)405nm、660nm660nm電

14、源220v ac10% 50hz樣品容量100 l反應(yīng)容器標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)試管安瓿直接使用檢測(cè)分辨力12比特5 檢測(cè)原理5.1光密度反應(yīng)時(shí)間(t0.02)取值方法 bet系列儀器檢測(cè)試管內(nèi)反應(yīng)物的光密度od值，取當(dāng)od上升到0.02的點(diǎn)的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間，該點(diǎn)在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開始快速變化的時(shí)期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時(shí)間。 吸光度限值法反應(yīng)時(shí)間 理論分析和大量試驗(yàn)表明，無(wú)論以哪種方法確定的反應(yīng)時(shí)間，它都是內(nèi)毒素含量的標(biāo)志，內(nèi)毒素濃度和成膠時(shí)間為負(fù)相關(guān)，即內(nèi)毒素濃度越高成膠時(shí)間就越短。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，臨界時(shí)間與內(nèi)毒素濃度c之間也是負(fù)相關(guān)。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可得c-關(guān)系曲線，對(duì)該曲線采用最小

15、二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。在對(duì)實(shí)驗(yàn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)品的臨界反應(yīng)時(shí)間和式(2.3-2)，即可求出其內(nèi)毒素濃度值【1】。檢測(cè)樣品反應(yīng)時(shí)間通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線反算濃度度lgtlgclgclgttxcx系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與反應(yīng)時(shí)間回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線歸標(biāo)準(zhǔn)曲線 反應(yīng)時(shí)間法定量測(cè)定原理5.2反應(yīng)速率測(cè)定及濃度計(jì)算方法 大量試驗(yàn)表明，內(nèi)毒素濃度越高成膠時(shí)間就越快，即反應(yīng)速度快，將動(dòng)力學(xué)反應(yīng)曲線變換成微分曲線，即反應(yīng)速率曲線。 反應(yīng)速率曲線 其反應(yīng)速率最大的點(diǎn)即是反應(yīng)曲線的拐點(diǎn)，該點(diǎn)的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間就是濁度反應(yīng)時(shí)間法中的t50，最大的反應(yīng)速率也與內(nèi)毒素含量相關(guān)，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可得c-vmax關(guān)系曲線

16、，對(duì)該曲線采用最小二乘法擬合，可以求解出a0、b0的值。在對(duì)試驗(yàn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)品的最大的反應(yīng)速率vmax代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出其內(nèi)毒素濃度值。 樣品的最大反應(yīng)速率通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線反算濃度vmaxlgclgcvmaxvxcx稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品與最大的反應(yīng)速率回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線 反應(yīng)速率法定量測(cè)定原理5.3儀器直接鑒別葡聚糖存在的原理 由鱟試劑生化反應(yīng)原理得知，葡聚糖與鱟試劑中的g因子直接反應(yīng)，然后產(chǎn)生凝膠，而細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑的c因子反應(yīng)，活化c因子再與b因子反應(yīng)然后產(chǎn)生凝膠，由于反應(yīng)得進(jìn)程不同從反應(yīng)曲線上能夠發(fā)現(xiàn)明顯的區(qū)別，內(nèi)毒素曲線為明顯的s型曲線，而葡聚糖曲線為接近直線的斜線，通過(guò)反應(yīng)時(shí)間法和反應(yīng)速率法的共同分析發(fā)現(xiàn)，含有葡聚糖的樣品檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)兩種方法計(jì)算數(shù)值相差10倍以上，而內(nèi)毒素的檢測(cè)結(jié)果兩種分析方法沒有明顯