動物繁殖學(xué)-第8配子與胚胎生物技術(shù)(課堂PPT)

1、1,第八章 配子與胚胎生物技術(shù),2,第一節(jié) 動物胚胎移植,胚胎移植（embryo transfer）：將動物的早期胚胎移植到與胚胎相對應(yīng)生理狀態(tài)的雌性受體子宮中，使之發(fā)育為成熟的個體。 提供胚胎的個體稱為供體，接受胚胎的個體稱為受體。,3,一、胚胎移植發(fā)展歷史,1890年英國劍橋大學(xué)Walter Heape首次獲得兔胚胎移植成功。 20世紀30年代，在兔、大鼠和小鼠方面進行了更多的實驗，成為實驗生物學(xué)中研究受精、胚胎發(fā)育等問題的一個重要方法。 家畜的胚胎移植，最早是在20世紀30年代在綿羊和山羊方面進行的。 在20世紀60年代以來，對家畜胚胎的采取、保存、移植等技術(shù)環(huán)節(jié)進行了大量的試驗研究工作

2、，取得不少進展。 20世紀70年代以后，胚胎的移植技術(shù)可以說發(fā)展到在畜牧生產(chǎn)中實際應(yīng)用的階段。 近些年來，胚胎移植技術(shù)已在動物引種和改良方面廣泛應(yīng)用，已成為體外受精、嵌合體、轉(zhuǎn)基因和克隆動物實現(xiàn)的應(yīng)用技術(shù)，試管牛、轉(zhuǎn)基因豬和克隆羊均是通過胚胎移植途徑生出的。,4,二、胚胎移植的意義,1.充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，提高繁殖效率 2.加速品種改良，擴大良種畜群 3.誘發(fā)肉畜懷雙胎，提高生產(chǎn)效率 4.代替種畜的引進 5.保存品種資源 6.防疫需要和克服不孕 7是實現(xiàn)克隆動物等的必需手段,5,三、胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)和原則,(一)生理學(xué)基礎(chǔ),1.發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育,2.早期胚胎的游離狀態(tài),3.

3、胚胎移植不存在免疫問題,4.胚胎和受體的聯(lián)系,5.胚胎的遺傳特性,6,(二)胚胎移植的基本原則,1.胚胎移植前后所處環(huán)境的同一性,（）供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性 （）動物生理上的一致性 （）動物解剖部位的一致性,2.胚胎發(fā)育的期限,3.胚胎的質(zhì)量,7,(三)胚胎移植應(yīng)具備的基本條件,1.胚胎來源,2.技術(shù)條件,3.受體母畜,8,四、胚胎移植的技術(shù)程序,胚胎移植時，希望一次從供體母畜得到多數(shù)胚胎，所以要進行超數(shù)排卵處理，同時，胚胎移植成功的根本條件是供體和受體必須同時發(fā)情，故需人為控制供受體的發(fā)情時間，進行同期化處理。,9,（一）供受體準備,選擇的供體不但應(yīng)有育種上的價值，期望從它們得到很多

4、的后代，而且生殖機能應(yīng)處于較高的水平。 受體母畜可選用非優(yōu)良品種的個體或土種家畜但亦應(yīng)具有良好的繁殖性能和健康狀態(tài)，體型中上等。,10,（二）超數(shù)排卵,在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時間，注射促性腺 激素，使卵巢中比在自然情況下有較多的卵泡發(fā)育并排卵，這種方法稱為超數(shù)排卵（superovulation），簡稱超排。 超數(shù)排卵主要應(yīng)用于牛和羊，效果明顯，對于產(chǎn)多胎的豬意義不大，而母馬很難產(chǎn)生反應(yīng)。一般認為以1020個最為理想。,11,1母牛,在預(yù)計自然發(fā)情的前4d，即發(fā)情周期的第16天或第17天肌肉或皮下注射PMSG15003000IU（或同時加注HCG10001500IU）。這種方式是按照發(fā)情周期的規(guī)律

5、，在黃體期將要結(jié)束，卵泡期即將到來之前，順勢促進較多的卵泡生長和成熟。這樣做必須和發(fā)情周期的進程配合好，所以在安排時間上受到限制，應(yīng)用不方便。另一種方式是在發(fā)情周期的中期，在注射促性腺激素的同時，施用PGF2a或其類似物以溶解黃體。一般是在周期的第1013天（815天）內(nèi)進行，一次肌注上述量的PMSG，隔日再注射以PGF2a。如用FSH（或FSH+LH），則連續(xù)注射34d，每天早晚各一次，總量為3040mg（國產(chǎn)品400500大鼠單位，第一天用量可稍多，第3天的第5次注射時，同時注射PGF2a。,12,2、母羊,在周期第12天或第13天時，一次肌注（或皮下）PMSG7501500IU。出現(xiàn)發(fā)情

6、后或配種當(dāng)日再肌注HCG500750IU。也可像母牛一樣在發(fā)情周期中期進行處理，在注射PMSG之后，隔日注射以PGF2a或類似物。如采用FSH，用量為1020mg（或200300大鼠單位）分3d6次注射之，PGF2a在第5次同時注射之。,13,（三）供體母畜的配種,超數(shù)排卵處理的母畜發(fā)情后，根據(jù)育種的需要，應(yīng)選擇優(yōu)良公畜的精液，在適宜時間進行人工授精。為了得到較多的發(fā)育正常的胚胎，應(yīng)使用活率高密度大的精液，而且將授精次數(shù)增加到2次或3次，兩次間隔810h。,14,（四）胚胎的收集,胚胎的收集是利用沖洗液將胚胎由生殖道中沖洗，并收集在器皿中。 沖洗時要考慮到配種時間、發(fā)生排卵的大致時間、胚胎的運

7、行速度和發(fā)育階段等因素，只有這樣，才能順利迅速地進行操作，得到較高的收集率。關(guān)于各種家畜受精后胚胎發(fā)育的速度和運行情況（所處部位）收集時間不應(yīng)早于排卵后的第一天，亦即最早要在發(fā)生第一次卵裂,15,之后，否則不宜辨別卵子是否已受精。一般是在配種后38d，發(fā)育至48個細胞以上為宜。牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期或胚泡早期進行收集和移植（配種后68d）。,16,1.手術(shù)法收集胚胎,按照外科手術(shù)的要求，在腹部適當(dāng)部位作一切口，用注射器吸取沖洗液注入輸卵管或子宮角內(nèi)，進行沖洗，同時觀察卵巢上的排卵情況，計算排卵率。沖洗部位決定于胚胎所處位置，亦即取決于沖洗是在配種后的第幾天進行以及胚胎的運行速度。,17,

8、用注射器的磨鈍針頭刺入子宮角頂端，注入沖洗液，然后從輸卵管的傘部接取沖洗液，這種方式適用于牛、羊、兔等。,18,由傘部注入沖洗液，在子宮角上端接取。豬和馬的子宮角與輸卵管接合部有一活塞狀結(jié)構(gòu)，用第一種方式，沖洗液不易通過，只能采用第二種方式。,19,從子宮角上端注入沖洗液，由基部接取，或者相反。這種方式適合于各種家畜。,20,沖洗操作，要求迅速準確，防止對傷口、生殖器官和沖洗液的污染，避免對動物有過多刺激和對生殖器官造成損傷。一般來說，術(shù)后生殖道易發(fā)生不同程度的粘連，嚴重時會造成不孕。這是手術(shù)法的最大缺點。沖洗之后，立即縫合傷口，宜單獨飼養(yǎng)，注意傷口愈合情況。,21,2.非手術(shù)法收集胚胎,牛的

9、非手術(shù)收集胚胎可利用二路式導(dǎo)管沖卵器，將沖洗液通過內(nèi)管注入子宮角內(nèi)，然后導(dǎo)出沖洗液，外管前端連接以氣囊，當(dāng)將沖卵器插入子宮內(nèi)時，充氣使氣囊脹大，堵住子宮頸內(nèi)口以免沖洗液經(jīng)子宮頸流出。,22,23,24,非手術(shù)法沖取胚胎，每側(cè)子宮角需用沖洗液100150ml。應(yīng)用非手術(shù)法沖洗收集胚胎時，只能當(dāng)胚胎都進入子宮角后進行。牛、馬的胚胎用非手術(shù)法收集時，一般在配種后68d進行。,25,3.沖洗液,收集胚胎的沖洗液有多種，在早期的胚胎移植試驗中，各種生理鹽液如林格氏液、洛克氏液、臺氏液等和自體血清以及血清和鹽液的混合液，曾作為沖洗收集胚胎之用?，F(xiàn)在多采用杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）、布林斯特液（Brinst

10、ers medium-3）、合成輸卵管液（SOF）、惠屯氏液（Whittens medium）、海姆氏液（Hams F-10）以及199培養(yǎng)液（TCM199）。它們除含各種鹽類外，還含有多種有機成分，不但用于沖洗收集胚胎，還用于體外培養(yǎng)、冷凍保存和解凍等處理程序。,26,（五）胚胎的檢查,收集到的沖洗液，需靜置10min。待胚胎下沉后，移去上層液，再放于解剖鏡下，檢查胚胎數(shù)量和發(fā)育情況。正常發(fā)育的胚胎，其中細胞（卵裂球）一般外形整齊清晰，大小較一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。,27,28,29,（六）胚胎的保存和培養(yǎng),保存是使胚胎在體外一定條件下（降溫）停止發(fā)育，延長其在體外的

11、生存時間，當(dāng)需要時，升溫后進行移植。 培養(yǎng)則是在體溫條件下，于培養(yǎng)液中，使之繼續(xù)發(fā)育。,30,放在室溫條件下，胚胎只能存活1020h。當(dāng)溫度降至20以下時，胚胎即停止發(fā)育，存活時間可以延長。 胚胎在體溫環(huán)境下（37）的培養(yǎng)，有一部分可正常發(fā)育，但發(fā)育持續(xù)的時間和達到的階段也是非常有限的，一般只能持續(xù)34d。 利用兔體（輸卵管）進行活體內(nèi)培養(yǎng)（保存），然后再取出移植至同種畜體內(nèi)，在羊、豬、牛、馬都已試驗成功，經(jīng)過長途運輸，移植后妊娠產(chǎn)仔，但必須進行兩次沖洗和移植的手術(shù)，降低了它的實用價值。,31,冷凍長期保存牛、綿羊、山羊的胚胎經(jīng)冷凍解凍后能夠存活，且移植后均可受胎產(chǎn)仔。 在冷凍前需先依次經(jīng)過含

12、有由低濃度到高濃度防凍劑的杜氏培養(yǎng)液，防凍劑的最高梯度為1.01.5mol/L。每種濃度中停留510min，在最后一種濃度中降溫冷凍。胚胎冷凍時必須采取緩慢降溫。由室溫降至-5-7，每分鐘降1，在此溫度下進行誘發(fā)結(jié)冰，然后按每分鐘降0.30.5的速度降至-33-38，此后可直接浸入液氮保存。,32,解凍時不必控制升溫速度，可直接放在室溫條件下（2025）或在3537水浴中解凍。 解凍后必須再把防凍劑清除掉。方法是使胚胎按相反的方向（由高濃度向低濃度）依次通過含有不同濃度的防凍劑的培養(yǎng)液，最后移至不含防凍劑的培養(yǎng)液中進行移植。 牛胚胎冷凍較新的一種方法是在塑料細管中進行冷凍，一端裝有胚胎和冷凍培

13、養(yǎng)液，另一端為蔗糖液，解凍后隨即被蔗糖液稀釋，以沖淡防凍劑的含量，將塑料管直接裝入移植器中，然后注入子宮。,33,（七）胚胎的移植,胚胎的移植也有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式，手術(shù)法一般用于所有的動物，主要用于小動物。而非手術(shù)法僅適用于牛、馬及馬鹿等大動物,34,1.手術(shù)法移植,在受體腹部作一切口，找到排卵一側(cè)的卵巢并觀察黃體發(fā)育情況，用注射器或移植管將胚胎注入到同側(cè)子宮角上端或輸卵管壺腹部內(nèi)（以胚胎發(fā)育階段而定）。只需吸取少量的沖洗液連同胚胎一塊注入。,35,2.非手術(shù)移植法,牛的非手術(shù)移植，主要方式是將一只手伸入直腸，先檢查黃體位于哪一側(cè)和發(fā)育情況，然后握住子宮頸（如同人工授精操作一樣），另一

14、只手將移植管（注射器連接以導(dǎo)管或特制金屬移植器）插入與黃體同側(cè)的子宮角內(nèi)，注入胚胎。,36,（八）供體和受體的術(shù)后觀察,對術(shù)后的供體和受體不但要求注意它們的健康情況，同時要留心觀察它們在預(yù)定的時間是否發(fā)情。 供體在下次發(fā)情時即可照常配種，或經(jīng)過二、三個月再重復(fù)作為供體，收集胚胎。受體母畜術(shù)后如發(fā)情則說明未受胎，移植失敗。,37,第二節(jié) 體外受精,哺乳動物精子和卵子的受精在自然情況下都是在動物生殖道內(nèi)完成的，將這個生理過程在體外實驗室的培養(yǎng)皿內(nèi)進行，則稱為體外受精（in vitro fertilization，IVF ）。,38,一、 發(fā)展簡史,1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞學(xué)者Austi

15、n分別發(fā)現(xiàn)了精子獲能（cap acitation）現(xiàn)象，使動物體外受精研究進入了新紀元。 1959年張明覺在世界上首先獲得了體外受精的的哺乳動物試管兔，推動了體外受精研究工作的開展。 1978年首例人類試管嬰兒路易斯布朗（Louise Brown）誕生。,39,直到20世紀80年代，家畜的體外受精技術(shù)才取得突破，尤其是牛的體外受精技術(shù)發(fā)展迅速。 1981年Brackett等用體內(nèi)成熟卵母細胞獲得試管牛犢，隨后Hanada等（1985）獲得綿羊和山羊體外受精后代，并于1986年獲得體外成熟卵母細胞體外受精的第一頭犢牛。 我國學(xué)者盧克煥（1987）在愛爾蘭獲得全體外過程的試管牛犢。,40,二、意義

16、,1. 可以以較低的成本，大規(guī)模地批量生產(chǎn)各發(fā)育期的動物胚胎。 2. 作為胚胎移植技術(shù)常規(guī)服務(wù)的一部分。,41,三、技術(shù)程序,體外受精包括以下步驟：卵母細胞的獲取、卵母細胞成熟、精子獲能、卵母細胞受精和受精后的體外胚胎培養(yǎng)。,42,(一)卵母細胞的獲得和成熟培養(yǎng),1.屠宰場卵巢 從屠宰場采集卵巢保持在3035，運回實驗室，吸取26mm直徑的卵泡。 2.活體取卵母細胞 20世紀80年代末90年代初，超聲波或腹腔鏡引導(dǎo)經(jīng)陰道穿刺采卵，吸取有腔卵泡中的卵母細胞的技術(shù)問世，這項技術(shù)與屠宰后動物卵巢取卵相比，稱為活體取卵（OPU，ovum pick-up）。,43,3.卵母細胞成熟培養(yǎng) 選擇卵丘細胞完整

17、，形態(tài)良好的卵母細胞進行成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件是39，5%CO2，卵母細胞在培養(yǎng)皿液滴內(nèi)培養(yǎng)約24h。,44,(二)體外受精,1.精子的獲能處理 哺乳動物的獲能方法有培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方法。 2.受精 獲能的精子和成熟的卵子共培養(yǎng)。,45,(三)胚胎培養(yǎng),體外胚胎生產(chǎn)中，受精卵子在培養(yǎng)液中停留78d。 主要有兩類培養(yǎng)系統(tǒng)：一是含有體細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，二是限定或半限定的培養(yǎng)系統(tǒng)。 牛受精卵的共培養(yǎng)通常是用TCM-l99或其他液體添加血清，選用的體細胞有牛顆粒細胞，輸卵管上皮細胞等。整個培養(yǎng)系統(tǒng)中不用體細胞的稱為半限定或限定培養(yǎng)系統(tǒng)，取決于是否使用了血清和蛋白或合成的大分子添加物，,46,第三節(jié) 克隆

18、技術(shù),克?。╟longning）是指一個細胞或個體以無性繁殖方式產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相同的一群細胞或一群個體。 在動物繁殖學(xué)中，它是指不通過精子和卵子的受精過程而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相同新個體的一門胚胎生物技術(shù)。 哺乳動物的克隆技術(shù)包括胚胎分割和細胞移植兩種。,47,一、 胚胎分割,胚胎分割（embryo splitting）是運用顯微操作系統(tǒng)將哺乳動物附植前胚胎分成若干個具有繼續(xù)發(fā)育潛力部分的生物技術(shù)，運用胚胎分割可獲得同卵孿生后代。,48,（一）發(fā)展簡介,Spemann在1904年最先進行蛙類2-細胞胚胎的分割實驗，并獲得同卵雙生后代。 1970年，Mullen等通過分離小鼠2-細胞胚胎卵裂球，獲

19、得同卵雙生后代。 1979年Willadsen和Meineck-Tillman等成功地進行了綿羊早期胚胎的分割。 20世紀80年代以后，哺乳動物胚胎分割技術(shù)發(fā)展迅速，Willadsen等在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，建立了系統(tǒng)分割方法，并運用這種方法獲得綿羊的四分之一和八分之一胚胎后代和牛的四分之一胚胎后代。,49,（二）胚胎切割技術(shù),1.切割器具的準備 胚胎分割需要的器械有體視顯微鏡，倒置顯微鏡和顯微操作儀。 在進行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割針，固定管要求末端鈍圓，外徑與所固定胚胎直徑相近，內(nèi)徑一般為2030m。切割針目前有玻璃針和微刀兩種，玻璃針一般用實心玻璃拉成，微刀是用鋒利的金屬刀片與微細玻璃棒粘在一起制成。,50,51,2.胚胎預(yù)處理,為了減少切割損傷，胚胎在切割前一般用鏈霉蛋白酶進行短時間處理，使透明帶軟化并變薄或去除透明帶。,52,3.胚胎分割,在進行胚胎切割時，先將發(fā)育良好的胚胎移入