《毒理學(xué)基礎(chǔ)》

1、化學(xué)毒物的一般毒性作用,一般毒性作用（general toxicity,基礎(chǔ)毒性,basic toxicity）：指外來化學(xué)物在一定的劑量、一定接觸時(shí)間和接觸方式下對機(jī)體產(chǎn)生的綜合毒效應(yīng)。 一般毒性作用根據(jù)接觸時(shí)間的長短可分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。相應(yīng)的試驗(yàn)稱急性毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)。 1 急性毒性作用 2 局部刺激試驗(yàn) （local irritation test） 3 蓄積毒性作用及其評價(jià) 4 亞慢性和慢性毒性作用,1 急性毒性作用,新外源化合物首先需必須闡明其急性毒性的強(qiáng)度及特征。 1.1 基本概念 1.2 急性毒性試驗(yàn)的目的 1.3 急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 1.4

2、 急性毒性替代試驗(yàn) 1.5 ld50應(yīng)用中的有關(guān)問題 1.6 急性毒性評價(jià),1.1 基本概念,急性毒性（acute toxicity）是指機(jī)體一次接觸或在24小時(shí)內(nèi)多次接觸外來化學(xué)物后所引起的快速劇烈的中毒效應(yīng)（結(jié)構(gòu)與功能變化）。 一次接觸因給予途徑不同定義不同：口服和注射指瞬間將受試物給予機(jī)體；吸入和皮膚接觸指在特定期間內(nèi)（24小時(shí)）機(jī)體持續(xù)接觸受試物。,1.2 急性毒性試驗(yàn)的目的,確定受試物使一種或幾種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的劑量水平（ld50， ld100，ld01 ），以初步估計(jì)該化合物對人類毒害的危險(xiǎn)性。 為進(jìn)一步的蓄積毒性試驗(yàn)、亞慢性與慢性毒性試驗(yàn)及特殊毒性試驗(yàn)提供劑量和判斷指標(biāo)的依據(jù)。 闡

3、明一種化合物的相對毒性、作用方式和特殊毒性表現(xiàn)，找出量-效關(guān)系，以便其毒性包括臨床癥狀、生理生化和病理變化、毒性性質(zhì)和可能的靶器官等有初步了解。為毒理學(xué)機(jī)制研究的初步探索。 確定機(jī)體在環(huán)境中接觸的受試物侵入機(jī)體的途徑，研究受試物的代謝動(dòng)力學(xué)過程。 研究受試物急性中毒的預(yù)防和急救治療措施。,1.3 急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇 1.3.2 動(dòng)物分組及樣本例數(shù) 1.3.3 動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境 1.3.4 劑量選擇 1.3.5 染毒途徑 1.3.6 試驗(yàn)周期 1.3.7 觀察指標(biāo),1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇,原則是所選動(dòng)物應(yīng)使試驗(yàn)的結(jié)果能反映或預(yù)測人體接觸時(shí)的反應(yīng)。要求動(dòng)物健康，體重差異不

4、超過10%，試驗(yàn)前應(yīng)禁食16小時(shí)。同時(shí)盡量選用飼養(yǎng)管理方便、成本低的動(dòng)物。 1.3.1.1 動(dòng)物種屬選擇 1.3.1.2 動(dòng)物品系選擇 1.3.1.3 動(dòng)物性別選擇 1.3.1.4 動(dòng)物年齡與體重選擇,1.3.1.1 動(dòng)物種屬選擇,嚙齒類動(dòng)物 貓和犬 豬和靈長目,嚙齒類動(dòng)物,因缺乏嘔吐反射而利于經(jīng)口接觸受試物的吸收，但不適于研究經(jīng)口能引起嘔吐的化學(xué)毒物的毒性。 大鼠和小鼠繁殖力強(qiáng)、壽命短、食譜與人類似、便于分析比較明確的生物學(xué)指標(biāo)，且價(jià)格低、易管理。大鼠在代謝和毒性反應(yīng)上與人類較為接近，用于急性毒性試驗(yàn)占第一位。小鼠占第二位。 家兔因盲腸較長，經(jīng)口接觸毒物在腸道的吸收充分，結(jié)果往往毒性大于其他

5、動(dòng)物。,貓和犬,因試驗(yàn)成本較高，不適于樣本量大的試驗(yàn)如測定ld50。 僅僅用來驗(yàn)證對毒性或?qū)κ茉囄锏亩拘?yīng)做深入研究時(shí)以及對某些毒作用的種屬敏感性進(jìn)行比較。 貓和犬有高度發(fā)達(dá)的嘔吐反射系統(tǒng)，有催吐效應(yīng)的化合物在經(jīng)口接觸時(shí)應(yīng)注意。,豬和靈長目,豬的食譜及皮膚結(jié)構(gòu)與人接近，是一種用來估計(jì)外來化合物對人急性毒性危害水平較好的試驗(yàn)動(dòng)物。但其飼養(yǎng)管理不便，價(jià)貴，也不適于樣本量大的試驗(yàn)。 靈長目動(dòng)物在種系上與人類最接近，結(jié)果最能反映人體的反應(yīng)。但其價(jià)格昂貴，獲得較難。基本不用于急毒試驗(yàn)。,1.3.1.2 動(dòng)物品系選擇,動(dòng)物品系是指源于一個(gè)共同祖先而具有特定基因型的一群生物。 不同品系的同種動(dòng)物，可對同一被

6、檢物發(fā)生不同反應(yīng)，即存在品系差異。 為了在同種動(dòng)物中減少這種遺傳特性所決定的品系差異，在毒性試驗(yàn)中，最好采用同品系動(dòng)物，即純種動(dòng)物。,1.3.1.3 動(dòng)物性別選擇,性別的選擇依試驗(yàn)?zāi)康?、要求而定?如需要著重觀察受試驗(yàn)物對雄性動(dòng)物生殖功能的影響，應(yīng)選用雄性動(dòng)物。 如為受試物的致畸形試驗(yàn)作準(zhǔn)備，則可只選用雌性動(dòng)物。 如一般地闡明受試物毒性的大小與性質(zhì)，則應(yīng)雌雄各半。,1.3.1.4 動(dòng)物年齡與體重選擇,動(dòng)物年齡一般選用初成年者。 最常用的是出生2-3月齡、體重分別為200克和20克左右的大、小鼠；犬則需喂養(yǎng)1年左右；豚鼠體重200-250克；家兔2000-2500克；貓1500-2000克。 如

7、需研究受試物急毒作用的年齡差別，則應(yīng)選用不同年齡組動(dòng)物。,1.3.2 動(dòng)物分組及樣本例數(shù),試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)按年齡、性別和體重進(jìn)行分層隨機(jī)分組。 隨機(jī)方法可用抽簽法和隨機(jī)數(shù)字表法，即先將動(dòng)物編號后，進(jìn)行抽簽或查隨機(jī)數(shù)字表。 注意隨機(jī)不等于隨意！ 每組樣本例數(shù)小鼠10至20只，大鼠12至16只，家兔8至12只。,1.3.3 動(dòng)物喂養(yǎng)環(huán)境,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)室室溫應(yīng)控制在223，家兔可控制在203，相對濕度30%-70%，無對流風(fēng)。每籠動(dòng)物數(shù)以不干擾動(dòng)物個(gè)體活動(dòng)及不影響試驗(yàn)觀察為度，必要時(shí)單籠喂養(yǎng)。 飼養(yǎng)室采用人工晝夜為好，早6點(diǎn)至晚6點(diǎn)進(jìn)行12小時(shí)光照，其余時(shí)間黑暗。 一般食用常規(guī)試驗(yàn)飼料，自由飲水。,1.3

8、.4 劑量選擇,一般采用查文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)（少量動(dòng)物試驗(yàn)），估計(jì)ld50的范圍。 然后以此劑量為中間劑量，然后以4倍數(shù)上下各推兩個(gè)劑量組，共5組，使相鄰兩對數(shù)劑量的差值相等。如p90表6-3。,1.3.5 染毒途徑,接觸途徑的選擇應(yīng)以人在生產(chǎn)生活環(huán)境中接觸該化合物的方式為出發(fā)點(diǎn)。主要有： 1.3.5.1 經(jīng)口接觸 1.3.5.2 經(jīng)呼吸道接觸 1.3.5.3 經(jīng)皮膚接觸,1.3.5.1 經(jīng)口接觸,其是指將受試物經(jīng)口攝入或用機(jī)械直接送入胃的過程。具體包括： 灌胃：接觸量和時(shí)間準(zhǔn)確，但操作相對不便。 摻入飼料：是將受試物摻入飼料或飲水中，讓動(dòng)物自行攝入的方法，其操作簡便，但接觸量和時(shí)間不夠準(zhǔn)確。 吞咽

9、膠囊：是將受試物裝入膠囊內(nèi)，放入動(dòng)物舌咽部迫使動(dòng)物咽下。本法操作不便，僅適于較大的動(dòng)物。,1.3.5.2 經(jīng)呼吸道接觸,其適于在常溫、常壓下生產(chǎn)生活中以氣態(tài)、蒸汽態(tài)、氣溶膠、煙霧與粉塵狀態(tài)存在的受試物的急性毒性試驗(yàn)。 具體接觸方式有：吸入（將試驗(yàn)動(dòng)物置于含有一定濃度的受試物的染毒柜或其它容器中，讓動(dòng)物自然吸入）和注入（將受試物直接注入試驗(yàn)動(dòng)物的氣管或肺內(nèi)）。 該途徑接觸的持續(xù)時(shí)間可依據(jù)試驗(yàn)要求而定。毒性大的接觸時(shí)間可短些，毒性小的可長些。國內(nèi)一般在求lc50時(shí)為2小時(shí)。,1.3.5.3 經(jīng)皮膚接觸,液態(tài)、粉塵態(tài)和氣態(tài)外來化學(xué)物均有接觸皮膚的機(jī)會。不僅與外露皮膚接觸并被吸收，有的還能穿透衣服經(jīng)皮

10、膚吸收。 外來化學(xué)物經(jīng)皮膚吸收是指角質(zhì)層完整的皮膚，若皮膚破損，化學(xué)物經(jīng)真皮直接吸收，而與靜脈吸收的機(jī)制相似。,1.3.6 試驗(yàn)周期,急性毒性試驗(yàn)除計(jì)算受試物的ld50/lc50外，還需要通過觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒癥狀判斷受試物的毒作用性質(zhì)，推斷中毒的靶器官等。 因此，試驗(yàn)周期一般為2周。,1.3.7 觀察指標(biāo),應(yīng)根據(jù)急毒試驗(yàn)的目的來確定觀察指標(biāo)。 1.3.7.1 致死量/濃度 1.3.7.2 中毒癥狀 1.3.7.3 死亡及其時(shí)間 1.3.7.4 體重 1.3.7.5 其他指標(biāo),1.3.7.1 致死量/濃度,常用ld50/lc50。其計(jì)算一般采用改良寇氏（krber ）法： ld50= log1

11、 xmi(pi0.5) xm為最大劑量的對數(shù)；i為相鄰兩對數(shù)劑量之差的絕對值；pi為各組陽性反應(yīng)率的總和。 毒性較大的用ld5/lc5。 毒性劇烈的用ld1/lc1。,1.3.7.2 中毒癥狀,在急性毒性試驗(yàn)中，動(dòng)物的中毒癥狀及死亡一般出現(xiàn)在給予受試物24-48小時(shí)內(nèi)，故觀察1周即可。 如中毒反應(yīng)出現(xiàn)較遲，主要在給受試物后48小時(shí)-4天，則觀察期也應(yīng)相應(yīng)延長至2-4周。特別在48-72小時(shí)內(nèi)要仔細(xì)觀察各劑量組動(dòng)物的一般反應(yīng)、臨床表現(xiàn)、死前表現(xiàn)及這些反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間。 具體觀察指標(biāo)見p123表6-1。,1.3.7.3 死亡及其時(shí)間,觀察試驗(yàn)動(dòng)物接觸受試物后的死亡過程有利于探討其中毒機(jī)制或死因。 在

12、同系化學(xué)物中，有些在致死量下表現(xiàn)出動(dòng)物先興奮后抑制，死亡時(shí)發(fā)生抽搐；而有的則只引起抑制癥狀，表現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，并在抑制狀態(tài)下慢慢死亡，表明同系物之間的毒作用有差別。,1.3.7.4 體重,在急毒試驗(yàn)中對于存活動(dòng)物尤其是低于ld50組的動(dòng)物，應(yīng)觀察動(dòng)物體重變化，以便了解受試物引起的中毒效應(yīng)是短暫的還是較長期的。 盡管引起動(dòng)物體重下降或增長率減慢的原因較為復(fù)雜，如受試物影響食欲或消化系統(tǒng)功能而使動(dòng)物厭食或拒食可使體重下降，受試物可能會引起腹瀉而引起食物的吸收利用也可導(dǎo)致體重下降。 影響腎功能可使水鹽代謝的紊亂而可影響體重。,1.3.7.5 其他指標(biāo),根據(jù)上述某些指標(biāo)的陽性結(jié)果可進(jìn)一步擴(kuò)大觀察

13、項(xiàng)目，如測定體溫、心電、腦電等生理學(xué)指標(biāo)或某些生化指標(biāo)，有利于深入探討受試物的毒作用特征。 對死亡動(dòng)物要取部分組織進(jìn)行病理解剖學(xué)檢查，記錄各器官系統(tǒng)肉眼可見的病變；停止觀察后也應(yīng)抽取部分存活的動(dòng)物進(jìn)行病理解剖學(xué)檢查。 病理解剖學(xué)檢查對遲發(fā)性死亡動(dòng)物，尤其是發(fā)生雙峰死亡的現(xiàn)象是必要的。雙峰死亡指早期死亡較多，繼而減少，然后又出現(xiàn)大批死亡的現(xiàn)象。 病理解剖學(xué)檢查對估計(jì)受試物的毒理作用有一定的意義，并可為亞慢性、慢性和其它毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。,1.4 急性毒性替代試驗(yàn),1.4.1固體劑量法 （fixed dose procedure） 1.4.2急性毒性分級法 （acute toxic clas

14、s method） 1.4.3上下移動(dòng)法 （階梯法，up/down method）,1.4.1 固定劑量法,與經(jīng)典方法不同的是它不以動(dòng)物死亡作為觀察終點(diǎn)，可以利用預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學(xué)物的毒性反應(yīng)來對化學(xué)物的毒性進(jìn)行分級。實(shí)踐證明可大量節(jié)省試驗(yàn)動(dòng)物。 實(shí)驗(yàn)選擇的劑量范圍是5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。 歐共體（eec）的急性經(jīng)口毒性分級標(biāo)準(zhǔn)是：高毒（ld5025mg/kg），有毒（ld50為25-200mg/kg），有害（ld50為200-2000mg/kg），不分級（ld502000mg/kg）4個(gè)等級。,1.4.2 急性毒性分級法,它是以

15、死亡為終點(diǎn)的分階段試驗(yàn)法，每階段3只動(dòng)物，根據(jù)死亡動(dòng)物數(shù)，平均2-4階段即可判定急性毒性。使用動(dòng)物數(shù)量少。 首選大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，在25、200、2000mg/kg中選擇一個(gè)劑量開始試驗(yàn)，并據(jù)其結(jié)果判斷：不需進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行分級；下階段以相同劑量的另一種性別試驗(yàn)；下階段以較高或較低的劑量水平進(jìn)行試驗(yàn)。 動(dòng)物觀察14天，在染毒當(dāng)天觀察體征和死亡至少2次，之后每天觀察1次。 染毒前和每周測體重，所有動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查（病檢）。,1.4.3 上下移動(dòng)法,它以死亡為終點(diǎn)但也可用于觀察不同的終點(diǎn)。 特點(diǎn)是所需的動(dòng)物數(shù)更少。 根據(jù)初步的資料確定第一個(gè)動(dòng)物接受化學(xué)物的劑量，由第一只動(dòng)物染毒

16、后的反應(yīng)決定第二只動(dòng)物接受化學(xué)物的劑量，如果動(dòng)物死亡，則下一個(gè)劑量降低；如存活則下一個(gè)劑量增高。該方法需要選擇一個(gè)合適的劑量范圍，使大部分動(dòng)物所接受的化學(xué)物劑量都在真正的平均致死量左右。,1.5 ld50應(yīng)用中的有關(guān)問題,ld50具有重要的毒理學(xué)意義：在藥物研究中，評價(jià)藥物急毒的大小，比較不同藥物毒性的大小；計(jì)算藥物的治療指數(shù)；為后續(xù)的重復(fù)給藥毒理學(xué)試驗(yàn)提供劑量參考；比較不同途徑的ld50值，獲得生物利用度的信息；試驗(yàn)中毒量及其體征為臨床不良反應(yīng)監(jiān)測提供參考。 ld50的局限性：評價(jià)新藥及化學(xué)物時(shí)提供的信息較少，實(shí)用性有限；影響因素多，如性別、年齡、身體狀況及環(huán)境因素等；物種差異性影響大；經(jīng)典

17、試驗(yàn)所需的動(dòng)物數(shù)量多。,1.6 急性毒性評價(jià),在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存和銷售使用過程中也需要根據(jù)外來化學(xué)物的毒性分級，采取相應(yīng)的防護(hù)措施。 為評價(jià)外來化學(xué)物急毒的強(qiáng)弱及對人類的潛在危害程度，國際上提出了化學(xué)物急毒的分級標(biāo)準(zhǔn)用以對急毒進(jìn)行評價(jià)。 為便于比較化學(xué)物的毒性及有毒化學(xué)物的管理，國內(nèi)外根據(jù)ld50的大小提出了許多分級標(biāo)準(zhǔn)。who公布的全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度（ghs）中關(guān)于急性毒性危險(xiǎn)類別和標(biāo)簽的要求見p125表6-2。 注意：急毒不大，慢毒可能很大。因此不能將急毒分級與慢毒分級混淆。,2 局部刺激試驗(yàn),目的在于了解化學(xué)物對眼和皮膚的局部刺激性和腐蝕性。 2.1 眼刺激試驗(yàn) （eye pr

18、imary irritation test） 2.2 皮膚原發(fā)性刺激試驗(yàn) （skin primary irritation test） 2.3 皮膚致敏試驗(yàn) （skin sensitization test, allergic contact dermatitis test）,2.1 眼刺激試驗(yàn),其觀察終點(diǎn)為眼刺激和眼腐蝕。 眼刺激（eye irritation）指眼前表面接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性炎癥變化。 眼腐蝕（eye corrosion）指眼前表面接觸受試物后產(chǎn)生的局部不可逆性組織損傷。 方法用draize試驗(yàn)：家兔4只，滴眼后觀察結(jié)膜（紅、腫、分泌物）、角膜（混濁度及范圍）和虹膜（

19、紅、腫）的反應(yīng)，按規(guī)定的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。一般觀察7天，必要時(shí)延長至21天。,2.2 皮膚原發(fā)性刺激試驗(yàn),皮膚刺激（dermal irritation）指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部可逆性炎癥變化。 皮膚腐蝕（dermal corrosion）指皮膚接觸受試物后產(chǎn)生的局部不可逆性組織損傷。 不宜進(jìn)行皮膚刺激試驗(yàn)的情況:構(gòu)效關(guān)系及理化性質(zhì)推測可能有腐蝕性物質(zhì);急毒經(jīng)皮試驗(yàn)有強(qiáng)系統(tǒng)毒性的物質(zhì);急毒經(jīng)皮試驗(yàn)染毒量達(dá)2000mg/kg仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征的物質(zhì)。 試驗(yàn)采用家兔或豚鼠，觀察時(shí)間應(yīng)足以觀察到可逆或不可逆刺激作用，一般不超過14天。 影響試驗(yàn)的因素：皮膚的完整性受破壞；固態(tài)物的物理性狀；受試物

20、在皮膚表面封閉染毒的嚴(yán)密程度；動(dòng)物的年齡與皮膚結(jié)構(gòu)的關(guān)系；種屬差異（一般敏感順序?yàn)椋和秒嗍笕素i）。,2.3 皮膚致敏試驗(yàn),皮膚致敏是一種對化學(xué)物免疫介導(dǎo)的皮膚反應(yīng)，人體這類反應(yīng)表現(xiàn)為：瘙癢、紅斑、水腫、丘疹、水皰等。 試驗(yàn)動(dòng)物常選豚鼠。試驗(yàn)分兩個(gè)階段： 誘導(dǎo)接觸（induction exposure）：是以較低或中等濃度受試物對皮膚重復(fù)染毒（涂皮或皮下注射），一般需14天。 激發(fā)接觸（challenge exposure）：是間隔10-14天后，用激發(fā)劑量（低于誘導(dǎo)時(shí)的劑量）受試物處理未染過毒的皮膚部位，然后觀察24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后皮膚反應(yīng)。 以皮膚反應(yīng)程度進(jìn)行評分，比較誘導(dǎo)及激發(fā)后

21、皮膚反應(yīng)情況，以判斷受試物能否產(chǎn)生皮膚過敏反應(yīng)。,3 蓄積毒性作用及其評價(jià),3.1 基本概念 3.2 實(shí)驗(yàn)方法及其評價(jià) 3.2.1 蓄積系數(shù)法 3.2.2 生物半衰期法 3.2.3 蓄積率 3.3 相關(guān)機(jī)體耐受性,3.1 基本概念,蓄積作用指反復(fù)多次接觸同一化學(xué)物時(shí)，因前次接觸時(shí)未完全自機(jī)體清除，使其多次接觸后在體內(nèi)的總量不斷增加的現(xiàn)象。 蓄積性指化學(xué)物具有蓄積作用的性質(zhì)。 貯庫指容易蓄積化學(xué)物的組織部位。常見的有血漿蛋白、脂肪組織、肝、腎及骨骼。 蓄積作用一方面包括化學(xué)物在體內(nèi)量的增加，另一方面是組織結(jié)構(gòu)和功能改變的累積。,3.2 實(shí)驗(yàn)方法及其評價(jià),任何毒物都可在體內(nèi)蓄積。有些毒物分次進(jìn)入的

22、量雖小，但長期接觸仍可產(chǎn)生毒性；有些毒物雖然毒性較小，但大量接觸也可產(chǎn)生毒性。 化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積現(xiàn)象是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。蓄積毒性試驗(yàn)是檢測外來化學(xué)物蓄積性大小的試驗(yàn)，以了解某種外來化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積情況和程度，并可為慢毒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。 短期試驗(yàn)（short-term test）指在數(shù)日內(nèi)（7-14天），每天使試驗(yàn)機(jī)體接觸一次受試物的試驗(yàn)。以探討較大劑量和較短時(shí)間的毒性作用。其與急性毒性試驗(yàn)不同。,3.2.1 蓄積系數(shù)法,本法是一種生物效應(yīng)的試驗(yàn)方法。原理是在一定期限內(nèi)以低于致死量（ ld50 ）間隔分次給予受試動(dòng)物，直至出現(xiàn)預(yù)計(jì)的毒性效應(yīng)為止。計(jì)算達(dá)到預(yù)計(jì)效應(yīng)的總蓄積劑量，求出此蓄

23、積劑量與一次接觸該化學(xué)物產(chǎn)生相同效應(yīng)所需劑量的比值-蓄積系數(shù)k：ed50（n）/ed50 （l） n-多次接觸產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量總和； l-單次接觸產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量。 k越大表明蓄積性越小。k1表示高度蓄積，1k 3表示明顯蓄積， 3 k5表示中等蓄積，k5表示輕度蓄積。 蓄積系數(shù)的具體試驗(yàn)方法有： 固定劑量法 定期遞增劑量法 20天試驗(yàn)法,固定劑量法,先按常規(guī)方法測定ld50 。然后用另一批條件相同的動(dòng)物，分成2-4組，每組10-20只，雌雄各半。 試驗(yàn)組每日定時(shí)定量（1/20-1/5 ld50之間）并以相同途徑給予受試動(dòng)物，試驗(yàn)期間每日記錄動(dòng)物的蓄積死亡數(shù)至累計(jì)發(fā)生一半動(dòng)物死亡（異外死亡

24、除外），即可計(jì)算k值。若接觸蓄積劑量已達(dá)到5個(gè)ld50量，也可停止試驗(yàn)，表明k大于5。 單次接觸量應(yīng)根據(jù)動(dòng)物體重作相應(yīng)調(diào)整。 試驗(yàn)期最長100天（每次接觸量1/20 ld50 ），最短25天（每次接觸量1/5 ld50 ）。,定期遞增劑量法,在測出ld50后，同上法選擇相同條件的動(dòng)物，分為接觸組和對照組。 試驗(yàn)以4天為一期，每天給相同劑量受試物。開始按1/10 ld50給予。此后每期給予量按等比級數(shù)遞增1.5倍。連續(xù)接觸20天即可結(jié)束試驗(yàn)。 若試驗(yàn)期中只要受試物引起一半動(dòng)物蓄積死亡，也可結(jié)束試驗(yàn)。,20天試驗(yàn)法,本法是我國對農(nóng)藥及食品安全性的毒理學(xué)評價(jià)中提出的方法。 采用體重200克左右的成年

25、大鼠，也可用小鼠。每個(gè)劑量組雌雄動(dòng)物各10只。 各組受試物劑量分別為ld50的1/20、1/10、1/5及1/2，另設(shè)對照組。 每天染毒1次，連續(xù)20天，各組染毒累量可達(dá)1、2、4和10 ld50 。再繼續(xù)觀察7天。 若1/20 ld50組有動(dòng)物死亡，且有量效關(guān)系，則為強(qiáng)蓄積性，應(yīng)放棄繼續(xù)試驗(yàn)。若到1/2 ld50組才有動(dòng)物死亡，則為弱蓄積性。,3.2.2 生物半衰期法,生物半衰期（t1/2）是指外來化學(xué)物在體內(nèi)消除一半所需要的時(shí)間。其可反應(yīng)化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積量。蓄積量越大毒性反應(yīng)越強(qiáng)，但不一定呈平行關(guān)系。 t1/2的測定可用作圖法，先求出消除速率常數(shù)k。即以時(shí)間為橫坐標(biāo)，一級動(dòng)力學(xué)消除物質(zhì)以

26、血漿對數(shù)濃度為縱坐標(biāo)，零級動(dòng)力學(xué)消除物質(zhì)以血漿濃度為縱坐標(biāo)，其斜率為k。再根據(jù)不同動(dòng)力學(xué)消除特性求t1/2 ：一級消除t1/2 =0.693/k；零級消除= 0.5c0/k。 多數(shù)物質(zhì)以一級消除。有零級消除特性的物質(zhì)在接觸量很小時(shí)，也以一級消除，但累積到一定程度后轉(zhuǎn)變?yōu)榱慵壪?多次接觸后t1/2 與蓄積極限量的關(guān)系見圖6-2。 除吸入接觸外，蓄積極限值可按下列公式估計(jì)： l=1.44x每日吸收量x t1/2 （日）。,3.2.3 蓄積率,蓄積率是指在一定時(shí)間內(nèi)，外來化學(xué)物在體內(nèi)的蓄積量與同一期進(jìn)入機(jī)體總量的百分比。其越高該化學(xué)物的蓄積性越大。 其測定可用化學(xué)測定法測定，但較困難。 實(shí)際采用

27、生物測量法進(jìn)行測定： 將動(dòng)物分為試驗(yàn)組和對照組。試驗(yàn)組先在一定時(shí)期（蓄積期）內(nèi)每日給予一定量的受試物，但不得有動(dòng)物死亡。蓄積一定量后同時(shí)與對照組進(jìn)行l(wèi)d50的測定，再按下列公式計(jì)算蓄積率。 蓄積率=（對照組ld50 -試驗(yàn)組ld50 ）/蓄積期試驗(yàn)組給予受試物的總量,3.3 相關(guān)機(jī)體耐受性,耐受性是指在一定劑量下未出現(xiàn)或出現(xiàn)程度較預(yù)期低的反應(yīng)的現(xiàn)象。 在蓄積試驗(yàn)中，有時(shí)常于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將存活的動(dòng)物給予一次沖擊劑量（ 一般為ld50 ），然后與未進(jìn)行預(yù)先化學(xué)處理的對照組的死亡率進(jìn)行比較，以確定是否具有耐受性。若試驗(yàn)組較對照組的死亡率低，則具有一定的耐受性，若高于或與對照組的死亡無差別，則無耐受性。

28、 蓄積性與耐受性往往同時(shí)存在，有些以蓄積性為主，而有些以耐受性為主。,4 亞慢性和慢性毒性作用及其評價(jià),4.1 基本概念及試驗(yàn)?zāi)康?4.2 亞慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 4.3 慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 4.4 亞慢性、慢性毒性作用評價(jià),4.1 基本概念及試驗(yàn)?zāi)康?4.1.1 亞慢性、慢性毒性作用的概念 4.1.2 亞慢性毒性作用的試驗(yàn)?zāi)康?4.1.3 慢性毒性作用的試驗(yàn)?zāi)康?4.1.1 亞慢性、慢性毒性作用的概念,亞慢性毒性作用指試驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。 連續(xù)多日約相當(dāng)于受試動(dòng)物壽命的1/30-1/10。一般環(huán)境毒理學(xué)和食品毒理學(xué)要求連續(xù)接觸3-6個(gè)月，工業(yè)毒理學(xué)要求3個(gè)月。

29、呼吸道接觸主張30-90天試驗(yàn)，每天6小時(shí)，每周5天；皮膚接觸試驗(yàn)為30天。 較大劑量上限應(yīng)小于急毒試驗(yàn)的ld50 。 慢性毒性作用指以低劑量外來化學(xué)物長期給予試驗(yàn)動(dòng)物接觸，其對試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。,4.1.2 亞慢性毒性作用的試驗(yàn)?zāi)康?目的主要是為慢毒試驗(yàn)提供設(shè)計(jì)依據(jù)： 探討試驗(yàn)動(dòng)物長期接觸外來化學(xué)物可引起有害效應(yīng)的劑量，以估計(jì)該化學(xué)物慢性接觸的危險(xiǎn)性，為進(jìn)一步進(jìn)行慢毒試驗(yàn)提供接觸劑量的設(shè)計(jì)范圍； 探討亞慢性毒性的閾劑量/濃度，確定對動(dòng)物的毒作用性質(zhì)、發(fā)生毒效應(yīng)的類型和靶器官，并初步確定最大無作用量，從而確定慢性毒性作用的觀察指標(biāo)； 根據(jù)亞慢性毒性的閾劑量和無作用量，估計(jì)慢性接觸的危險(xiǎn)性

30、，為接觸該化學(xué)物的安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供初步依據(jù)，以確定是否需進(jìn)一步進(jìn)行慢毒試驗(yàn)； 了解受試物對動(dòng)物繁殖及對子代的致畸作用，為評價(jià)受試物能否應(yīng)用于食品提供依據(jù)。,4.1.3 慢性毒性作用的試驗(yàn)?zāi)康?慢毒試驗(yàn)是外來化學(xué)物一般毒性評價(jià)程序中最后階段的觀察，其目的是為了評價(jià)動(dòng)物長期接觸某受試物后可能出現(xiàn)的毒性作用，尤其是進(jìn)行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用，以確定外來化學(xué)物的毒性下限，即長期接觸該化學(xué)物可以引起機(jī)體危害的閾劑量和最大無作用量，為最終評價(jià)受試物能否應(yīng)用于食品提供依據(jù)，為進(jìn)行該受試物的危險(xiǎn)評價(jià)與制定人接觸該物質(zhì)的安全限量提供毒理學(xué)依據(jù)，如最高允許濃度和每日允許攝入量等。,4.2 亞慢性毒性試驗(yàn)

31、設(shè)計(jì),4.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇 4.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境 4.2.3 劑量的選擇與分組 4.2.4 染毒途徑 4.2.5 試驗(yàn)周期 4.2.6 觀察指標(biāo),4.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇,原則上要求對受試物代謝過程基本與人類相似,應(yīng)當(dāng)是急性毒性試驗(yàn)已證明的對受試物敏感的種屬和品系,同時(shí)還應(yīng)考慮與慢性毒作用試驗(yàn)中預(yù)計(jì)使用的動(dòng)物種屬和品系相同。若無法掌握這一情況，則應(yīng)有兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為嚙齒類，另一為非嚙齒類，以便了解受試物毒性特征。也應(yīng)參考觀察指標(biāo)的需要而選擇，如需多次抽血檢查則不宜用小鼠。 性別選擇一般雌雄兼用，特殊試驗(yàn)可選用單性別動(dòng)物。如對性腺影響試驗(yàn)。 年齡選擇大鼠4周，重50克；小鼠

32、3周，重10克。,4.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境,在亞慢性試驗(yàn)期間，動(dòng)物飼養(yǎng)條件及環(huán)境可能影響毒性效應(yīng)，應(yīng)注意營養(yǎng)平衡和環(huán)境的穩(wěn)定，必須有營養(yǎng)合理的飼料、充足干凈的飲水和清潔的生活環(huán)境。并保持適宜的溫度和濕度，以保證動(dòng)物健康。 當(dāng)受試驗(yàn)物在飼料中的比例較高（大于5%）時(shí)，須考慮其可食性及營養(yǎng)平衡問題，還要避免經(jīng)胃腸代謝后的毒物又被動(dòng)物攝取而影響試驗(yàn)結(jié)果。 不同物種的動(dòng)物應(yīng)分室飼養(yǎng)，籠具要保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由活動(dòng)，必要時(shí)單籠飼養(yǎng)，且應(yīng)有人工晝夜設(shè)施。,4.2.3 劑量的選擇與分組,所選劑量上限應(yīng)在試驗(yàn)期不引起動(dòng)物死亡或個(gè)別死亡，但要有明顯的中毒效應(yīng)或靶器官出現(xiàn)明顯損傷?？蓞⒖技倍驹囼?yàn)的閾劑量為其上

33、限，也可用1/20-1/5ld50。 亞慢性試驗(yàn)應(yīng)求量-效關(guān)系，因此至少設(shè)置3-4個(gè)劑量組、1個(gè)正常對照組，必要時(shí)加1個(gè)溶劑對照組。 每組動(dòng)物大鼠20-40只、家兔10-20只、狗6-8只、猴2-4只，若試驗(yàn)中期需處死部分動(dòng)物作病理解剖檢查時(shí)應(yīng)相應(yīng)增加動(dòng)物例數(shù)。,4.2.4 染毒途徑,染毒途徑先要盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該受試物的途徑和方式，其次應(yīng)與后來預(yù)期要進(jìn)行的慢毒試驗(yàn)的接觸途徑一致。 經(jīng)口接觸一般采用飼喂法。但應(yīng)注意動(dòng)物厭食或拒食。 經(jīng)呼吸道吸入接觸的時(shí)間隨所接觸受試物而定，如為工業(yè)毒物可接觸1-4小時(shí)，環(huán)境污染則可適當(dāng)延長至4-8小時(shí)。 每日接觸受試物應(yīng)定時(shí)，以減小接觸量和反應(yīng)誤差。,

34、4.2.5 試驗(yàn)周期,試驗(yàn)周期一般占實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的1/10。因?yàn)椴煌瑒?dòng)物的壽命不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期有所不同，從幾個(gè)月至1年不等。 一般對長周期、經(jīng)常接觸的受試物可選擇90天試驗(yàn)周期，而對階段性接觸的受試物可選擇30天。,4.2.6 觀察指標(biāo),亞慢性試驗(yàn)中觀察指標(biāo)比較廣泛，其選擇十分重要。常根據(jù)急性、蓄積性試驗(yàn)提供的線索及相關(guān)資料，選擇一些特異和非特異指標(biāo)，包括一般性指標(biāo)、血液和行為學(xué)檢查、生理生化指標(biāo)、病理解剖學(xué)與病理組織學(xué)檢查及器官系數(shù)測定等。 4.2.6.1 一般指標(biāo) 4.2.6.2 病理學(xué)檢查 4.2.6.3 特異指標(biāo),4.2.6.1 一般指標(biāo),為非特異指標(biāo)，是外來化學(xué)物對機(jī)體毒性作用的綜合

35、性總體反映。主要包括： 動(dòng)物體重：反映化學(xué)物對消化系統(tǒng)和代謝的影響。 食物利用率：攝食量與體重的增長比率。同樣反映化學(xué)物對消化系統(tǒng)和代謝的影響。 癥狀：主要有毛色、眼分泌物、呼吸、神態(tài)及行為。 臟器系數(shù)：臟器濕重與體重的比率?？煞从尘唧w受損的器官。 一般生化指標(biāo)：主要是血象和肝腎功能指標(biāo)。,4.2.6.2 病理學(xué)檢查,凡是在染毒過程中死亡的動(dòng)物，均應(yīng)即使解剖進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，必要時(shí)作組織化學(xué)或電鏡檢查。 檢查時(shí)所選臟器應(yīng)參照急性毒性試驗(yàn)的臟器改變或亞慢性毒性試驗(yàn)的中毒癥狀而定。 必要時(shí)可進(jìn)行所有臟器的病理組織學(xué)檢查。,4.2.6.3 特異指標(biāo),特異指標(biāo)是指對機(jī)體亞慢性毒性作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)

36、。其與受試物的中毒機(jī)制密切相關(guān)。 指標(biāo)選定一是全面分析受試物急性毒作用特征，初步發(fā)現(xiàn)主要危害的系統(tǒng)、器官和組織，來發(fā)現(xiàn)一些敏感或特異性指標(biāo)；另一方面是通過文獻(xiàn)檢索，參考一些化學(xué)物的同系物、某些特殊基團(tuán)具有的特定毒性，利用構(gòu)效關(guān)系的共性來選擇特異性指標(biāo)。,4.3 慢性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì),慢毒試驗(yàn)是制定人體日允許攝入量所需的關(guān)鍵性資料。 4.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇 4.3.2 試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境 4.3.3 劑量的選擇與分組 4.3.4 染毒途徑 4.3.5 試驗(yàn)期限 4.3.6 觀察指標(biāo),4.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇,因慢毒試驗(yàn)為動(dòng)物的大部分生命周期甚至終身，因此只能選用生命周期較短(23年)的動(dòng)物。又

37、要對飼養(yǎng)條件、生化系統(tǒng)、繁殖、自發(fā)性疾病均有比較系統(tǒng)的了解，故傳統(tǒng)上選用大鼠（3-4周，50-70克）、小鼠（3周，10-12 克）。 并要求品系明確一致（取決于被檢物的毒作用部位及毒劑量的總的敏感性，一般選對致癌物敏感的品系），雌雄各半。 動(dòng)物數(shù)量要求與亞慢性毒性試驗(yàn)相似。,4.3.2 試驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)環(huán)境,飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)環(huán)境要求與亞慢性毒性試驗(yàn)相同，如應(yīng)保證試驗(yàn)動(dòng)物有溫濕度適宜的生活環(huán)境及合理的營養(yǎng)。 注意動(dòng)物的營養(yǎng)成分可影響慢毒試驗(yàn)的結(jié)果，如半合成飼料可增加致癌物的敏感性，黃酮類及大蒜素相反。,4.3.3 劑量的選擇與分組,試驗(yàn)分零劑量組、預(yù)期無作用劑量組、閾劑量組、發(fā)生輕微但有明確毒效應(yīng)

38、劑量組和發(fā)生明顯的毒效應(yīng)甚至亞致使死水平劑量組，以求量效關(guān)系。必要時(shí)加溶劑對照組。 劑量選擇參考： 亞慢毒試驗(yàn)結(jié)果：高劑量組為1/5-1/2閾劑量，輕微毒效應(yīng)組為1/20-1/10閾劑量，慢毒閾劑量組為1/50-1/20閾劑量，預(yù)期無作用劑量組為1/10最大無作用量、1/100閾劑量或10-50倍人群實(shí)際最大攝入量。 急毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果：高劑量組為1/10ld50，慢毒閾劑量組為1/100ld50，預(yù)期無作用劑量組為1/1000ld50。 美國環(huán)保局建議：0.125mtd和0.25mtd。mtd(最大耐受量):試驗(yàn)組動(dòng)物較對照組動(dòng)物體重減輕不超過10%、無死亡、無中毒癥狀和病理損傷的最大量。,4.3

39、.4 染毒途徑,慢毒試驗(yàn)多采用經(jīng)胃腸道與呼吸道接觸。 經(jīng)胃腸道接觸一般將受試物與食物或飲水混合，由動(dòng)物自然攝入。但若受試物有異味或易水解時(shí)可采用每日定時(shí)灌胃。 經(jīng)呼吸道接觸，依試驗(yàn)要求定每日接觸時(shí)間，如為工業(yè)毒物的試驗(yàn)通常要求每日吸入4-6小時(shí)，如為環(huán)境污染物一般要求每日吸入8小時(shí)或更長時(shí)間。,4.3.5 試驗(yàn)期限,其依試驗(yàn)的要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類而定。 使用大、小鼠時(shí)，工業(yè)毒理學(xué)要求6個(gè)月；食品和環(huán)境毒理學(xué)一般要求1年以上至2年。若與致癌試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行，則最好長達(dá)接近動(dòng)物的預(yù)期壽命，甚至終生。 有人認(rèn)為大鼠90天試驗(yàn)即可確定慢性無作用水平；也有主張終生接觸才能全面反映受試物的慢毒效應(yīng)及求出閾劑量或

40、無作用量。,4.3.6 觀察指標(biāo),應(yīng)以亞慢毒試驗(yàn)的觀察指標(biāo)為基礎(chǔ)，選擇亞慢毒試驗(yàn)中已呈現(xiàn)有意義的變化指標(biāo)。 一般常規(guī)觀察指標(biāo)包括肝、腎功能，健康狀況、體重、血液及其它生化指標(biāo)。對死亡動(dòng)物及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)作病檢。 為減小誤差和排除陋檢，應(yīng)注意：試驗(yàn)前應(yīng)對觀察指標(biāo)進(jìn)行正常值檢查，剔除差異大的動(dòng)物；觀察應(yīng)與對照組同步進(jìn)行并作對比；檢測方法應(yīng)穩(wěn)定，并有質(zhì)量控制；應(yīng)在不同間隔（于6、12、18個(gè)月）處死部分動(dòng)物檢測，以了解是否有進(jìn)行性和可逆性變化。,4.4 亞慢性、慢性毒性作用評價(jià),了解受試物毒性的大小及靶器官并找出敏感的毒效應(yīng)指標(biāo)，即最早出現(xiàn)在最低劑量組并與對照組比較差異有顯著性的毒效應(yīng)指標(biāo)。 4.4.

41、1 基本評價(jià)參數(shù) 4.4.2 亞慢毒資料評價(jià) 4.4.3 慢毒資料評價(jià) 4.4.4 綜合結(jié)論,4.4.1 基本評價(jià)參數(shù),閾劑量是敏感毒效應(yīng)指標(biāo)出現(xiàn)改變的最小劑量（limch)。用最低有害作用水平（ lowest observed adverse effect level，loael）或最小作用量（med）表達(dá)。 最大無作用量（maximal no-effect dose）是不引起機(jī)體某種毒效應(yīng)的最大劑量。用無明顯作用水平（noel）或無明顯有害水平（noael）表達(dá)。 loael或noael是評價(jià)化學(xué)物對機(jī)體損害的主要指標(biāo)，但應(yīng)注明動(dòng)物、試驗(yàn)條件及觀察指標(biāo)。以此為基本可制定化學(xué)物的接觸極限。,

42、4.4.2 亞慢毒資料評價(jià),我國食品安全性毒理學(xué)評價(jià)程序中規(guī)定：亞慢毒試驗(yàn)中， 最大無作用劑量小于或等于人可能攝入量的100倍，則表示毒性很強(qiáng)，應(yīng)放棄該化學(xué)物的使用； 若最大無作用劑量在100-300倍之間，可進(jìn)行慢毒試驗(yàn)； 若大于或等于300倍，則不必進(jìn)行慢毒試驗(yàn)，可直接進(jìn)行毒性評價(jià)。,4.4.3 慢毒資料評價(jià),如慢毒試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)致癌性： 最大無作用劑量小于或等于人群的可能攝入量的50倍，表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)放棄該化學(xué)物的使用； 最大無作用劑量在50-100倍之間者，需相關(guān)專家共同評議； 最大無作用劑量大于或等于100倍者，則可考慮允許使用于食品，并制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（限量）。 若任何一個(gè)劑量組有致癌

43、作用，且有量-效關(guān)系，多不允許用于食品。 前述結(jié)合急毒試驗(yàn)結(jié)果，慢毒作用帶（zch=limac/limch）越寬，慢毒風(fēng)險(xiǎn)越大，否則風(fēng)險(xiǎn)越小。,4.4.4 綜合結(jié)論,可能出現(xiàn)于食品中的外來化學(xué)物，在各種毒性試驗(yàn)中，一般都可表現(xiàn)出一定的毒性效應(yīng)。 在決定此種化學(xué)物是否可用于食品時(shí)，主要根據(jù)其毒性在目前生產(chǎn)、生活條件下，是否可以得到控制。 凡在目前生產(chǎn)、生活條件下，無法控制其毒害的物質(zhì)，不允許在食品中應(yīng)用。,思考題,1 急毒試驗(yàn)中小鼠、大鼠和家兔每組樣本例數(shù)各應(yīng)為多少？ 2 試用寇氏（krber ）法計(jì)算ld50。 3 如何用20天試驗(yàn)法評價(jià)化學(xué)物的蓄積毒性？ 4 如何確定慢性毒性試驗(yàn)的劑量和試驗(yàn)

44、周期？ 5 如何給食品安全性評價(jià)下綜合結(jié)論?,1.1 基本概念,變異：是物種在遺傳過程中出現(xiàn)的個(gè)體和各代間種種不同程度的差異。 突變：是遺傳物質(zhì)的一種可遺傳的變異。 突變方式： 自發(fā)突變：物種在自然繁衍過程中出現(xiàn)的突變； 誘發(fā)突變：是人為造成的突變。 致使突變物（誘變物、遺傳毒物）：能誘發(fā)遺傳物質(zhì)損傷而發(fā)生突變的物質(zhì)。 致突變作用：引起遺傳物質(zhì)損傷，其改變隨細(xì)胞分裂而傳遞的過程。 突變作用的結(jié)果：基因突變（點(diǎn)突變）和染色體畸變。,1.2.4 細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂,細(xì)胞增殖周期是細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下次細(xì)胞分裂完成的這段時(shí)間。 g1期（dna合成前期）：mrna、蛋白質(zhì)、酶合成旺盛，為dna的復(fù)制

45、作準(zhǔn)備。此期約占增殖周期一半的時(shí)間。 s期（dna合成期）：進(jìn)行dna復(fù)制，為細(xì)胞分裂作準(zhǔn)備。 g2期（dna合成后期）：此期繼續(xù)合成與有絲分裂有關(guān)的rna、蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)。 m期（有絲分裂期）：進(jìn)行有絲分裂，一個(gè)細(xì)胞分裂成二個(gè)子細(xì)胞。,2 致突變作用 類型,基因是dna鏈上的片段序列。 化學(xué)毒物引起基因突變作用的類型有： 2.1 基因突變 2.2 染色體畸變 2.3 染色體數(shù)目異常,2.1 基因突變,包括三種類型: 堿基置換 移碼 大段損傷,堿基置換,堿基置換是dna鏈上某一堿基配對性能發(fā)生變化，使其在復(fù)制時(shí)dna互補(bǔ)鏈配上錯(cuò)誤的堿基。包括： 轉(zhuǎn)換：原來的嘌呤或嘧啶被另一種嘌呤或嘧啶置換。

46、 顛換：是原來的嘌呤被嘧啶置換或嘧啶被嘌呤置換。,移碼,移碼是dna中增加或減少了一對或幾對不等于3的倍數(shù)的堿基對(三聯(lián)密碼錯(cuò)誤)所造成的突變。 從受損部位開始的堿基序列改變而形成錯(cuò)誤密碼，并轉(zhuǎn)譯為不正常的氨基酸。其合成的蛋白質(zhì)性質(zhì)也就發(fā)生結(jié)構(gòu)和活性變化。,大段損傷,大段損傷是dna的大段缺失或插入。 它可跨越1個(gè)以上的基因。 它往往是dna斷裂后重接的結(jié)果。有時(shí)在減數(shù)分裂過程中發(fā)生錯(cuò)誤聯(lián)合和不等交換所引起。,2.2 染色體畸變,染色體畸變是染色體結(jié)構(gòu)異常。 是因?yàn)槿旧w或染色體單體斷裂不發(fā)生重接或重接而不在原處所致（染色體型畸變或染色體單體型畸變）。 畸變類型包括： 倒位：斷裂后中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)

47、180度重接。 缺失：染色體丟失一個(gè)片段。 重復(fù)：在一套染色體中增加染色體片段。 易位：斷裂下的片段接到另一染色體上。 裂隙、斷裂、環(huán)狀染色體。,2.3 染色體數(shù)目異常,正常動(dòng)物的染色體都是雙倍體（人23對）。 染色體數(shù)目異?？梢员憩F(xiàn)為整倍性畸變和非整倍性畸變。 整倍性畸變：染色體成對增減。 非整倍性畸變：染色體奇數(shù)條增減。,3 致突變作用 機(jī)制與后果,3.1 以dna為靶的損傷機(jī)制 3.2 不以dna為靶的損傷機(jī)制 3.3 突變的后果,3.1 以dna為靶的損傷機(jī)制,形成dna加合物：親電子物質(zhì)可與細(xì)胞內(nèi)dna分子中的親核原子以共價(jià)鍵結(jié)合形成加合物。 平面大分子嵌入dna鏈：以靜電吸附形式嵌

48、入dna單鏈堿基之間或dan雙螺旋結(jié)構(gòu)相鄰多核苷酸鏈之間。 形成dna-蛋白質(zhì)交聯(lián)物：dna與蛋白質(zhì)分子以共價(jià)鍵結(jié)合成交聯(lián)物。 破壞堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)。 dna分子的堿基被其類似物取代。 形成二聚體而影響復(fù)制。,3.2 不以dna為靶的損傷機(jī)制,2.1 影響dna合成與修復(fù)的酶：dna合成酶。 2.2 對紡錘體的損害： 與微管蛋白二聚體結(jié)合，妨礙微管組裝； 與微管上巰基結(jié)合，影響微管作用； 破壞已組裝的微管； 妨礙中心粒移動(dòng)，影響有絲分裂。,3.3 突變的后果,體細(xì)胞突變：引起個(gè)體病變?nèi)缒[瘤、畸形、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、衰老、高血壓等，但不影響下代 。 生殖細(xì)胞突變：可影響下代和遺傳。根據(jù)對人類影

49、響程度分：對機(jī)體無影響；對機(jī)體健康無影響的遺傳學(xué)變異；遺傳易感性改變；遺傳性疾??；致死性突變。,4 機(jī)體對致突變作用的影響,機(jī)體對突變dna具有修復(fù)機(jī)制。 機(jī)體對致突變作用的影響相當(dāng)復(fù)雜,其中重要的因素是遺傳因素，包括代謝酶遺傳多態(tài)性和修復(fù)功能的個(gè)體差異。 4.1 dna損傷的修復(fù) 4.2 遺傳因素對致突變作用的影響,4.1 dna損傷的修復(fù),直接修復(fù) 切除修復(fù) 錯(cuò)配修復(fù) 雙鏈斷裂修復(fù) 交聯(lián)修復(fù),直接修復(fù),其一是通過光裂合酶切下dna上紫外線損傷產(chǎn)生的嘧啶二聚體。 其二是通過烷基轉(zhuǎn)移酶將o-6位烷化而易造成堿基錯(cuò)配的鳥嘌呤的烷基轉(zhuǎn)給蛋白質(zhì)，使鳥嘌呤恢復(fù)正常。,切除修復(fù),它是一個(gè)多步驟的修復(fù)過程

50、。有以下兩種： 核苷酸切除修復(fù)：首先在內(nèi)切酶作用下打開受損dna的雙鏈，在解螺旋酶作用下，切除含受損的寡核苷酸鏈。隨后在修復(fù)聚合酶作用下合成新的正常dna鏈填補(bǔ)留下的空隙。最后由dna連接酶封閉，恢復(fù)原有的dna系列。 堿基切除修復(fù)：首先由dna糖基酶作用于受損的dna，切除其受損的堿基。隨后由內(nèi)切酶將dna切斷。再由聚合酶及連接酶作用完成修復(fù)過程。,錯(cuò)配修復(fù)（mismach repair）,是一種性質(zhì)截然不同的切除修復(fù)，其特征是可以識別并除去在dna復(fù)制時(shí)錯(cuò)配的堿基對如g：t和a：c。,雙鏈斷裂修復(fù),它實(shí)際不是修復(fù)，而是一種耐受過程。是一種以容忍損傷繼續(xù)存在和高突變率情況來換取細(xì)胞繼續(xù)生存的

51、耐受過程。 其通過同源重組或者非同源性末端連接機(jī)制使斷裂的dna雙鏈被修復(fù)。,交聯(lián)修復(fù),其包括： 無誤交聯(lián)修復(fù)：通過降解雙螺旋，使鏈內(nèi)交聯(lián)轉(zhuǎn)變?yōu)殒渻?nèi)二核苷酸加合物連接于雙鏈斷裂處，隨后連接體分解而除去二核苷酸交聯(lián)。 易誤交聯(lián)修復(fù)：包括整核苷酸切除修復(fù)和通過易誤dna聚合酶進(jìn)行的修復(fù)。,4.2 遺傳因素對致突變作用的影響,代謝酶遺傳多態(tài)性 修復(fù)功能的個(gè)體差異,代謝酶遺傳多態(tài)性,氧化代謝酶：如cyp1a1高誘導(dǎo)型與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。 酯酶：如環(huán)氧水化酶不同表型，其細(xì)胞內(nèi)的分布和作用不同，它既是毒物活化酶，也是解毒酶。 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（gst）：它是重要的解毒酶，其也存在多態(tài)性。其中g(shù)st缺乏與

52、肺癌密切相關(guān)。,修復(fù)功能的個(gè)體差異,o6-甲基鳥嘌呤-dna-甲基轉(zhuǎn)移酶（mgmt）：其可將烷化的嘌呤和胸嘧啶上的烷基轉(zhuǎn)移到自身胱氨酸殘基上，是dna得以修復(fù)。其缺乏與腫瘤具有相關(guān)性。 二磷酸腺苷核糖多聚酶（parp）：對dna修復(fù)和基因組穩(wěn)定性起著重要作用。,5 致突變作用研究方法,5.1 致突變試驗(yàn)?zāi)康募爸甘旧?5.2 常用致突變試驗(yàn) 5.3 致突變應(yīng)注意的問題,5.1 致突變試驗(yàn)?zāi)康募爸甘旧?目的：評定外源化學(xué)物對生殖細(xì)胞及體細(xì)胞的突變性，對致癌、致畸和遺傳危害的潛在可能作出初步評價(jià)。 指示生物：細(xì)菌、病毒、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物及其體外培養(yǎng)細(xì)胞和植物。,5.2 常用致突變試驗(yàn),細(xì)菌回

53、復(fù)突變試驗(yàn)（ames試驗(yàn)） 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變試驗(yàn) 微核試驗(yàn)（mnt） 染色體畸變試驗(yàn) 顯性致死試驗(yàn)（見生殖毒性試驗(yàn)） 程序外dna合成（uds）試驗(yàn) 姐妹染色單體交換試驗(yàn) 果蠅伴性隱性致死試驗(yàn) 單細(xì)胞凝膠電泳（slrl）試驗(yàn) 熒光原位雜交（fish）試驗(yàn) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變試驗(yàn),細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn),細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)是以營養(yǎng)缺陷型的突變體為指示生物，觀察受試物是否糾正或補(bǔ)償突變體所攜帶的突變發(fā)生改變的體外試驗(yàn)。 原理是利用鼠傷寒菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，因其突變喪失合成組氨酸的能力而在無組氨酸培養(yǎng)基中不能存活，若受試物可使該菌發(fā)生回復(fù)突變，則其該菌在無組氨酸培養(yǎng)基中能存活。說明受試物有致突變作用

54、。 菌株中at97、at98可檢測移碼突變，at100可檢測置換突變。,哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變試驗(yàn),它是體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的野生型基因失活的正向突變試驗(yàn)。 利用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如小鼠淋巴細(xì)胞系（l5178y）、中國倉鼠肺細(xì)胞株（v97）和卵巢細(xì)胞株（as52），觀察接觸受試物后特定基因座位上是否誘變產(chǎn)生突變體。,微核試驗(yàn),是觀察受試物是否引起動(dòng)植物細(xì)胞產(chǎn)生微核的試驗(yàn)。 原理是：細(xì)胞經(jīng)過突變后，染色體和染色單體的無著絲點(diǎn)片段或因紡錘絲受損而丟失，使整個(gè)染色體在細(xì)胞有絲分裂后期不能進(jìn)入子代細(xì)胞的細(xì)胞核中，而在間期的子代細(xì)胞漿內(nèi)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，即微核。,染色體畸變試驗(yàn),染色體畸變試驗(yàn)是

55、通過鏡下觀察（設(shè)備有流式細(xì)胞儀）染色體形態(tài)和數(shù)目改變的試驗(yàn)。 本試驗(yàn)靈敏度高。 染色體形態(tài)改變可見裂隙、斷裂、斷片、無著絲粒環(huán)、雙或多著絲粒染色體、射體和染色體破碎。 注意：因其改變具有時(shí)相變化，應(yīng)在培養(yǎng)中多次檢測。,程序外dna合成試驗(yàn),是通過觀察培養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞增殖周期內(nèi)s期以外時(shí)相dna合成情況的試驗(yàn)。 當(dāng)細(xì)胞dna受損后，dna的修復(fù)合成可發(fā)生在s期外時(shí)相，即程序外dna合成。因此，該試驗(yàn)可反映dna受損情況。 具體實(shí)驗(yàn)方法可利用放射自顯影或閃爍計(jì)數(shù)法。 試驗(yàn)具有簡便、經(jīng)濟(jì)和快速。,姐妹染色單體交換試驗(yàn),姐妹染色單體交換試驗(yàn)是觀察染色體同源座位上dna復(fù)制產(chǎn)物相互交換的試驗(yàn)。 在dna合

56、成期，所有染色體均可進(jìn)行復(fù)制形成兩條姐妹染色體單體。其單體交換率可能與dna的斷裂重接有正相關(guān)，從而間接提示dna的損傷。 具體觀察是通過姐妹染色單體差別染色法：,果蠅伴性隱性致死試驗(yàn),果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)是利用隱性基因在伴性遺傳中具有交叉遺傳的特征而進(jìn)行的試驗(yàn)。 當(dāng)基因發(fā)生點(diǎn)突變、小缺失（dna大段損傷）、重組等各類基因突變的隱性致死效應(yīng)，將伴性遺傳傳給f1雌性動(dòng)物，再由其傳給f2雄性動(dòng)物。 因f1雌性動(dòng)物為雜合子，不能表達(dá)。而f2雄性動(dòng)物為半合子，將表達(dá)出來。 該試驗(yàn)利用黑腹果蠅試驗(yàn)，其具有世代周期短、繁殖率高、飼養(yǎng)方便、經(jīng)濟(jì)、判斷終點(diǎn)客觀、不需活化等優(yōu)點(diǎn)。但染毒方式與劑量計(jì)算與哺乳動(dòng)物差

57、異較大。,單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn),單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)是用凝膠電泳的方法觀察細(xì)胞dna受損情況的試驗(yàn)。 在體內(nèi)外細(xì)胞與受試物接觸后，若dna發(fā)生斷裂，制備加有其單細(xì)胞混懸液的凝膠，在堿性條件下使細(xì)胞裂解，解旋dna后電泳，則觀察到細(xì)胞核呈慧星狀。 通過圖像分析儀計(jì)數(shù)慧星狀細(xì)胞數(shù)，或通過目鏡測微尺在熒光顯微鏡下來測量細(xì)胞核的直徑和慧星尾部的長度，來判斷dna受損情況。,熒光原位雜交試驗(yàn),熒光原位雜交試驗(yàn)是一種在保持組織、細(xì)胞或染色體原有形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對其內(nèi)部特殊核苷酸順序進(jìn)行檢測及定位的試驗(yàn)。 熒光原位雜交技術(shù)是用生物熒光來標(biāo)記的各類dna和rna進(jìn)行原位雜交，即可使被觀察的特定dna序列顯現(xiàn)熒光

58、。 該法具有操作、分析簡便、立體分辨率高、準(zhǔn)確迅速、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變試驗(yàn),轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變試驗(yàn)是用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變系統(tǒng)來檢測基因突變的試驗(yàn)。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物致突變技術(shù)是利用穿梭載體于原核和真核之間往返轉(zhuǎn)移，并帶可回收靶基因載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因的檢測系統(tǒng)。 它可在動(dòng)物整體水平研究突變的器官、組織的特異性。并可通過從動(dòng)物基因中重新回收的基因進(jìn)行基因突變的組織專一性和順序變化的序列分析研究。,5.3 致突變應(yīng)注意的問題,4.3.1 體外試驗(yàn)的活化系統(tǒng) 4.3.2 對照 4.3.3 結(jié)果判斷,5.3.1 體外試驗(yàn)的活化系統(tǒng),由于體外試驗(yàn)缺乏體內(nèi)試驗(yàn)的代謝系統(tǒng)，一些需在體內(nèi)

59、代謝活化的致突變物質(zhì)往往被漏檢。 因此，體外試驗(yàn)需要建立合適的代謝活化系統(tǒng)。 如可采用與物質(zhì)代謝細(xì)胞（肝細(xì)胞）同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)或s9混合液（含代謝酶的細(xì)胞勻漿液）。,5.3.2 對照,試驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照。 陽性對照：用已知能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的物質(zhì)作對照。以證明試驗(yàn)方法的可靠；驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性；驗(yàn)證完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力。 陰性對照：以排除其它試驗(yàn)因素所造成的誤差。,5.3.3 結(jié)果判斷,檢查質(zhì)量控制：注意試驗(yàn)程序與操作的正確性；注意體外試驗(yàn)中是否存在體內(nèi)并不存在的某些因素如過高或過低的ph、滲透壓及代謝活化系統(tǒng)濃度是否偏離細(xì)胞或細(xì)菌的生理?xiàng)l件。 體外試驗(yàn)結(jié)果陰性：注意提供的代謝活化系統(tǒng)對受

60、試物的活化是否合適和充足。 體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果陰性：注意受試物是否未能到達(dá)靶部位。 應(yīng)綜合分析試驗(yàn)組的效應(yīng)比陰性對照組是否明顯增強(qiáng)、是否具有量-效關(guān)系；弱效結(jié)果是否具有重復(fù)性等。,思考題,1 解釋：突變、自發(fā)突變、誘發(fā)突變、轉(zhuǎn)換、顛換。 2 突變可引起哪些后果？ 3 致突變作用有哪些研究方法？ 4 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（ames試驗(yàn)）的原理是什么？,1.1.1 概念與危險(xiǎn)性分級,化學(xué)致癌物是能引起動(dòng)物和人類腫瘤、增加其發(fā)病率或死亡率的化合物。 國際癌癥研究中心2002年根據(jù)878種化學(xué)物質(zhì)的致癌證據(jù)強(qiáng)度分四級： 對人及動(dòng)物確有致癌作用； a 對人很可能有、對動(dòng)物確有致癌作用； b 對人及動(dòng)物可能有致癌作