植病研究法細(xì)菌病害的研究法

1、第三部分 植物細(xì)菌病害研究 技術(shù) 第一節(jié) 植物病原細(xì)菌的鑒定 第二節(jié) 病原細(xì)菌的分離培養(yǎng) 第三節(jié) 病原細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察 第四節(jié) 致病性測定 第五節(jié) 細(xì)菌的形態(tài)觀察 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 第一節(jié) 植物病原細(xì)菌的鑒定 1細(xì)菌病害標(biāo)本的檢查 (1)癥狀的觀察 植物細(xì)菌病害表現(xiàn)各種類型的癥狀，不同屬的細(xì)菌侵染植物后引起的癥狀 有所不同。 棒形桿菌屬細(xì)菌主要引起萎蔫， 假單胞菌屬細(xì)菌主要引起葉斑和葉枯（少數(shù)枝枯、蔫萎和軟腐）， 黃單胞菌屬細(xì)菌主要引起葉斑和葉枯，土壤桿菌屬細(xì)菌主要引起瘤腫（少數(shù) 其他畸形）， 歐文氏菌屬細(xì)菌主要引起軟腐（少數(shù)蔫萎和枝枯）。這樣的區(qū)分雖然不是絕 對的，但是指出它們之間

2、的關(guān)系，在診斷上是很有意義的。 許多細(xì)菌性病害的病斑帶有水漬狀，有時可以作為診斷的特征，但并不是所 有細(xì)菌病害都是這樣。 病部有時有菌膿排出。菌膿灰白色到黃色，珠狀或其他形狀，干燥后在表面形 成菌膜。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 第二節(jié)第二節(jié) 病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)病原細(xì)菌的分離培養(yǎng) 植物病原細(xì)菌一般都是用稀釋分離法。病原細(xì)菌在組 織中的數(shù)量很大，稀釋培養(yǎng)可以使病原細(xì)菌與雜菌分 開，形成分散的菌落，容易分離得到純培養(yǎng)。組織分 離法對病原細(xì)菌是不適用的，原因是它不能使病原細(xì) 菌與雜菌分開，雜菌生長快，會抑制病原細(xì)菌的生長。 稀釋分離有以下兩種方法。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 1.培養(yǎng)皿稀釋分離法培

3、養(yǎng)皿稀釋分離法 取滅菌的培養(yǎng)皿3個，每個培養(yǎng)皿中加滅菌水0.5ml，切取約4mm 見方的小塊病組織，經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過3次以后，移在第 一個培養(yǎng)皿的水滴中。用滅菌的玻棒將病組織研碎，靜置10 15min，使組織中的細(xì)菌流入水中(配成懸浮液)，然后用滅菌的移 植環(huán)從第一個培養(yǎng)皿中移植3環(huán)到第二個培養(yǎng)皿中，充分混合后再 移植3環(huán)到第三個培養(yǎng)皿中。然后，將溶化的瓊膠培養(yǎng)基冷卻到 45左右，倒在三個培養(yǎng)皿中。冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，在 適溫下培養(yǎng)。培養(yǎng)皿用記號筆注明分離材料、日期和稀釋編號。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 細(xì)菌懸浮液的配法有時影響分離的效果。一般植物病原細(xì)菌，用 滅菌水稀釋是適宜

4、的。有時改用滅菌的生理食鹽水(0.85%的NaCl) 或肉汁凍培養(yǎng)液稀釋比較好。如水稻白葉枯病細(xì)菌，用蛋白胨水 或粘土懸浮液稀釋的，培養(yǎng)后形成菌落的數(shù)目比用清水稀釋的多。 粘土的作用大致是細(xì)菌團(tuán)聚在土粒上，更容易形成菌落。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2.平板劃線分離法平板劃線分離法 取小塊病組織，經(jīng)過表面消毒和滅菌水洗過2次以后，放在滅菌載 玻片上的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎。靜置一定時間，用滅菌的移 植環(huán)蘸取以上組織液在瓊膠平板上劃線培養(yǎng); 先在平板的一側(cè)順序 劃35條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60將移植環(huán)滅菌后,從第二條線末端， 順序劃出3-5條線。目的都是使細(xì)菌分開形成

5、分散的菌落。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 劃線分離法的關(guān)鍵是要等到瓊膠平板表面的冷凝水完全消失后才能劃 線，否則細(xì)菌將在冷凝水中流動而影響形成單個分散的菌落。為了加 快消除冷凝水，可以將培養(yǎng)皿在37的溫箱中放一二天，或者在無菌 的條件下，將培養(yǎng)皿的蓋打開，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿斜靠在蓋上，在50的干 燥箱中干燥30min。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 No Image 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 植物病原細(xì)菌的分離還需注意：植物病原細(xì)菌的分離還需注意： 1分離材料新鮮 要從新鮮的標(biāo)本和新的病斑分離。存放太久的標(biāo)本，其中病原細(xì)菌的 生活力減弱，而腐生性細(xì)菌則滋長很快，從這種組織分離到的大都是 腐生菌。 分離

6、用的標(biāo)本最好是夾在吸水紙中郵寄，放在塑料袋中保濕是不適宜 的。 標(biāo)本保存的時間較長而不容易直接分離成功，可以經(jīng)過接種后再分離. 例如，分離軟腐病細(xì)菌時，由于腐爛組織中往往雜有大量的腐生菌， 可以挑取少許腐爛組織針刺接種在相應(yīng)的健全組織上，發(fā)病以后再從 接種的組織上分離。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2適宜的培養(yǎng)基適宜的培養(yǎng)基 分離失敗的原因，有時是由于培養(yǎng)基不適宜。一般來說，寄生性 細(xì)菌對培養(yǎng)基的要求要比腐生性細(xì)菌嚴(yán)格。同時，一種適宜于純培 養(yǎng)的培養(yǎng)基(細(xì)菌群集沒有其他雜菌干擾)，不一定適宜于分離(細(xì)菌 分散而單獨存在，同時還可能有雜菌干擾)。 因此，分離時要選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，有時要用選擇性培

7、養(yǎng)基。但 有時失敗的原因不是培養(yǎng)基的成分不適宜，而是由于培養(yǎng)基的酸度 不適當(dāng)或存放的時間太長。因此，在滅菌后和使用前，最好是再核 對一下培養(yǎng)基的酸度。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 二、分離培養(yǎng)基二、分離培養(yǎng)基 （1）通用培養(yǎng)基: NA培養(yǎng)基 （2）屬和種的選擇性培養(yǎng)基 1土壤桿菌屬(Agrobacterium) 一般是用甘露糖醇培養(yǎng)基 甘露糖醇 15g 硝酸鈉(NaNO3) 5g 硝酸鈣Ca(NO3)z4Hz0 320mg 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2g 氯化鋰(LiCl) 6g 硫酸鎂(MgSO47H20) 0.2g 溴百里酚藍(lán) 0.1g 瓊膠 15g 蒸餾水 1000ml 滅菌后酸度是p

8、H7.2，培養(yǎng)基呈深藍(lán)色。土壤桿菌屬細(xì)菌的菌 落圓形、凸起、發(fā)亮，最初淺藍(lán)色，以后深綠色。溴百里酚藍(lán)抑制 革蘭氏反應(yīng)陽性的細(xì)菌，氯化鋰抑制假單胞菌屬細(xì)菌。以上培養(yǎng)基， 已有選擇性培養(yǎng)基的作用，以甘露糖醇作為碳源是它的特點。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2假單胞菌屬假單胞菌屬(Pseudomonas) 沒有特殊的營養(yǎng)要求，許多培養(yǎng)基都可用于分離。常用的培養(yǎng)基有： 甘油酪朊水解物培養(yǎng)基 甘油 10ml 蔗糖 10g 酪朊水解物 1g 氯化銨(NH4c1) 5g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2.3g 硫酸十二烷基鈉 0.6g 瓊膠 15g 蒸餾水 1000ml | pH值6.8 由于培養(yǎng)基中含有十

9、二烷基硫酸鈉，已經(jīng)有一定的選擇性。 金氏培養(yǎng)基B(Kings medium B)，分離有熒光的假單胞菌 蛋白胨 20.0g 甘油 10.0g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.5g 硫酸鎂(MgSO47H2O) 1.5g 瓊膠 15.0g 蒸餾水 1000ml pH7.2。 熒光假單胞菌在培養(yǎng)基中產(chǎn)生可擴(kuò)散的青或褐色的色素，紫外 線照射顯示青到藍(lán)色。此培養(yǎng)基也可用于歐文氏菌屬(Erwinia)細(xì)菌 的分離。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 Kelmen(1954)TTC培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 蛋白胨 10.0g 酪朊水解物 1.0g 葡萄糖 5.0g 瓊膠 15.0g 蒸餾水 1000ml pH7.0 分

10、裝100ml，滅菌后。加過濾滅菌的1% 2，3，5一氯化三苯基四 氮唑(TTC)的水溶液到滅菌冷卻到55的培養(yǎng)基中，使?jié)舛茸詈?達(dá)到0.005%。青枯菌 P.solanacearum 培養(yǎng)2天后，致病力強(qiáng)的野生 型菌落白色，或中間有一淡紅色點的菌落；致病力弱或喪失致病 力的菌落深紅色，邊緣帶藍(lán)色。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 3黃單胞菌屬黃單胞菌屬(Xanthomonas) 蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基(Aay wood 1960) 蔗糖 2.0% 蛋白胨0.5% 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.05% 硫酸鎂(MgSO47H20) 0.025% 瓊膠 1.5% 蒸餾水 1000ml pH 7.27.4

11、這是分離Xanthomonas屬細(xì)菌最常用的培養(yǎng)基，也適用于假單胞菌屬、歐文 氏菌屬和有些棒桿菌屬的細(xì)菌， SX瓊膠培養(yǎng)基(Schaad and White，1974) 可溶性淀粉 10g 牛肉浸膏 5g 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2g 瓊膠 15g 蒸餾水1000ml 適用于分離可以水解淀粉的X.campestris的致病變種。必要時還可以加1% 甲基紫 B 的20%的酒精溶液 lml，甲基綠的1%水溶液 2ml，和環(huán)己酰亞胺 250mg，提高它的選擇性。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 4歐文氏菌屬歐文氏菌屬(Erwinia) 前面介紹的培養(yǎng)基有許多也適用于歐文氏菌屬，以下是對歐文氏菌具 有

12、特色的結(jié)晶紫聚果膠培養(yǎng)基。將攪碎器預(yù)加熱，加500ml煮沸的蒸 餾水，將以下成分依次加入，低速攪拌: 結(jié)晶紫的10%水溶液 1.0ml lmol/L氫氧化鈉(NaOH) 4.5ml 氯化鈣(CaCl22H2O)新鮮配制的1% 水溶液 4.5ml 瓊膠 2g 硝酸鈉(NaNO3) 1.0g 隨后將聚果膠酸鈉加入，高速攪拌15s，分裝三角瓶滅菌后要立即 倒入培養(yǎng)皿，制成平板干燥后使用。歐文氏菌屬細(xì)菌有分解果膠酶活 性的，形成中間有凹陷的菌落。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 5棒形桿菌屬棒形桿菌屬(Clavibacter) 此屬細(xì)菌有些是難培養(yǎng)的。酵母葡萄糖礦物鹽瓊膠培養(yǎng)基(YGM) 是很好的一種。

13、酵母浸膏 2.0g 葡萄糖 2.5g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 0.25g 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.25g 硫酸鎂(MgSO47H2O) 0.1g 硫酸錳(MnSO4) 0.15g 氯化鈉(NaCl) 0.05g 硫酸鐵(FeSO47H2O) 0.005g 瓊膠 15.0g 蒸餾水 1000ml 適用于分離棒桿菌也適用于Xanthomonas。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)性狀培養(yǎng)性狀 培養(yǎng)性狀對細(xì)菌的鑒定是很重要的。不同屬的植物病原細(xì)菌， 它們的培養(yǎng)性狀顯然不同。不同種的植物病原細(xì)菌，很難根據(jù)它 們的培養(yǎng)性狀區(qū)別，但可以作為最后鑒別的參考 1.培養(yǎng)性狀的描述 培養(yǎng)

14、性狀要分別在培養(yǎng)液、瓊膠斜面和瓊膠平板上觀察。描 述時，要指明培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 1培養(yǎng)液培養(yǎng)性狀培養(yǎng)液培養(yǎng)性狀 肉汁凍培養(yǎng)液常常用來觀察培養(yǎng)性狀。培養(yǎng)性狀主要是指生長量、 表面生長情況、色素的產(chǎn)生、有無沉淀和特殊氣味等。 表面的生長情況包括是否形成菌膜和菌環(huán)以及它們的厚度、細(xì)菌是 否形成團(tuán)狀的漂浮物。 培養(yǎng)液表面下生長的情況包括混濁程度，是均勻的云霧狀還是形成 團(tuán)粒狀和片狀的菌團(tuán)。 底部的性狀則指有無沉積物和沉積物的形狀。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2瓊膠斜面培養(yǎng)性狀瓊膠斜面培養(yǎng)性狀 斜面的培養(yǎng)性狀: 生長量的多少、菌苔的形狀、顏色光澤和粘度，以及培

15、 養(yǎng)基的顏色和有無特殊的氣味等。細(xì)菌學(xué)上往往將菌苔的形狀分為絲狀、 念珠狀、薄膜狀、分枝狀和根狀等。菌苔的表面有光滑的、不平整的和 有皺褶的。菌苔的顏色也不同，質(zhì)地有粘質(zhì)的、膜質(zhì)的或蠟質(zhì)的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的，表面有暗色的或發(fā)亮的。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 3瓊膠平板培養(yǎng)性狀瓊膠平板培養(yǎng)性狀 了解平板上菌落的特 征，有助于判斷分離 是否正確和挑取所需 的菌落。瓊膠平板上 菌落的觀察主要是： 形狀和大小、顏色和 光澤、表面是否隆起 或凹陷、邊緣的形狀、 透明度和粘度、培養(yǎng) 基顏色的變化等。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2.細(xì)菌的色素細(xì)菌的色素 非水溶性色素:不能擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，

16、所以菌落表現(xiàn)不同 的顏色，而培養(yǎng)基則不改變顏色。黃單胞菌屬的細(xì)菌能夠 形成非水溶性的黃色素，所以菌落是黃色的。 不能將形成黃色菌落的植物病原細(xì)菌都當(dāng)作黃單胞菌屬的細(xì)菌。 如玉米蔫萎病細(xì)菌，曾經(jīng)分在黃單胞菌屬中，但是根據(jù)它的黃色素與 黃單胞菌屬的細(xì)菌顯然不同，現(xiàn)在已經(jīng)分在泛生菌屬(Pantoea)。歐文 氏菌屬的細(xì)菌，除去有些可產(chǎn)生非水溶性的藍(lán)色素外，有的也能產(chǎn)生 非水溶性的黃色素，菌落也呈黃色。有些棒桿菌屬細(xì)菌也能形成黃色 菌落。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 水溶性色素水溶性色素: 擴(kuò)散到培養(yǎng)基中就能使培養(yǎng)基變色，其中有些色 素是熒光性的。假單胞菌屬細(xì)菌能否產(chǎn)生熒光性色素，是很重要 的分類特征

17、。 色素的產(chǎn)生與培養(yǎng)基有關(guān)，如在新鮮牛肉配成的培養(yǎng) 基上，熒光性色素的產(chǎn)生要比用牛肉浸膏配成的更為明顯。為了 測定假單胞菌屬細(xì)菌色素的產(chǎn)生，可用特殊的如金氏培養(yǎng)基,有兩 種配方： 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 培養(yǎng)基I 培養(yǎng)基 蛋白胨 2g 2g 硫酸鉀(K2SO4) lg 一 甘油 1g 1g 氯化鎂(MgCl2) 0.14g 一 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 一 0.15g 硫酸鎂(MgSO47H2O) 一 0.15g 瓊膠(水洗) 2g 2g 蒸餾水 100ml 100ml 酸度調(diào)節(jié)到pH7.2。培養(yǎng)基I 適用于觀察非熒光性色素，培養(yǎng)基 適用于觀察熒光性色素。熒光性色素的產(chǎn)生可以直接觀察或用

18、紫外線 照射觀察。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 四、細(xì)菌的計數(shù)四、細(xì)菌的計數(shù) 細(xì)菌的繁殖量、植物接種和血清學(xué)方面的研究都要求知道 細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌計數(shù)的方法有： 測數(shù)器計數(shù)法； 混濁度計數(shù)法； 平板菌落計數(shù)法。 前兩種方法是計數(shù)活的和死的細(xì)菌的總數(shù)，后一種方法是 測定活細(xì)菌數(shù)目。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 （1）測數(shù)器計數(shù)法）測數(shù)器計數(shù)法 紐鮑爾(Neubauer)血球計數(shù)板是常用的一種。它是一塊很厚的載 玻片，上面劃有每邊長為O.05mm的小方格，方格的深度是0.1mm。 測數(shù)時，先將蓋玻片放在計數(shù)計上有刻度的位置，從蓋玻片的一 側(cè)加小滴適當(dāng)稀釋的孢子懸浮液，然后在顯微鏡下觀察每小格中孢子

19、 的數(shù)目；觀察80小格，以它的平均數(shù)乘以，就是每毫升懸浮液中孢子 的數(shù)目。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 測定時注意事項： （1）取待測稀釋菌懸液向血球計數(shù)板加樣前，須將菌懸液充分搖勻。 （2）加樣過程中，應(yīng)避免將菌液滴在蓋玻片 （3）由于菌體在計數(shù)室中處于不同空間位置，須在不同焦距下才能觀察 到，故觀察時須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，計數(shù)菌液中全部菌體，盡量避免遺漏。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 實驗步驟 1、鏡檢計數(shù)室：對計數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若內(nèi)有污物，清洗后才能計數(shù)。 2、加樣液：先在血球計數(shù)板兩個計數(shù)室部位加蓋玻片，再用無菌玻棒或 滴管沾取待測菌懸液

20、稀釋液（已搖勻），從蓋玻片邊緣滴加，使菌液沿 縫隙靠毛細(xì)作用自行進(jìn)入計數(shù)室內(nèi)。靜置5min。 3、顯微鏡計數(shù)：將血球計數(shù)板置于載物臺上，先用低倍鏡觀察，后換高 倍鏡觀察計數(shù)。位于格線上菌體只計上邊線和左邊線上的，如果出芽酵 母芽體大小達(dá)到母細(xì)胞一半時，可計作兩個菌體。選擇五個視野，在每 個視野內(nèi)任意選擇五個小方格計數(shù)，求出每個小方格菌體數(shù)量平均值。 4、根據(jù)公式計算每ml菌液含菌數(shù)。 5、測量完畢后，取下蓋玻片用水沖洗血球計數(shù)板（嚴(yán)禁用硬物刷洗）， 晾干，放入盒內(nèi)保存。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 (2)混濁度計數(shù)法混濁度計數(shù)法 測定懸浮液中細(xì)菌、酵母菌或孢子的數(shù)目，可先測定它的混濁度， 然后

21、與標(biāo)準(zhǔn)比較而后決定數(shù)目。麥法蘭云度計可作為混濁度的比 較標(biāo)準(zhǔn)。測定混濁度更精確的方法是用光度計。測定無色細(xì)菌懸 浮液，一般是用波長450nm的光，或者用藍(lán)色濾色片；如是有色 的肉汁凍培養(yǎng)液，則用波長650nm的光較好，或用橙紅色濾色片。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 (3)平板菌落計數(shù)法平板菌落計數(shù)法 將細(xì)菌懸浮液定量稀釋后，取一定量不同稀釋度的細(xì) 菌懸浮液，分別在瓊膠平板上培養(yǎng)，從形成菌落的數(shù)目和 稀釋度，可算出每毫升中細(xì)菌數(shù)： 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 細(xì)菌懸浮液一般都是按10倍的比例稀釋，稀釋以后，每管中吸lml 或0.1ml加到滅菌的培養(yǎng)皿中，然后加溶化并冷卻到50左右的瓊 膠培養(yǎng)基，

22、充分混合后培養(yǎng)，計算平板上菌落的數(shù)目。 還有一種方法是先制成瓊膠平板，取稀釋的懸浮液加在平板上， 然后用滅菌的“L”形玻棒將菌液涂勻，培養(yǎng)后計算菌落數(shù)目。涂 抹法的好處是細(xì)菌都在平板的表面，可以避免培養(yǎng)基中下層細(xì)菌 的生長條件不同的影響。一般是只將3個稀釋度較高的(如5、6、7 三管)培養(yǎng)測定，這要根據(jù)具體情況決定。由于細(xì)菌懸浮液是成10 倍稀釋的，前一個稀釋度在瓊膠平板上菌落的數(shù)目大致是后一個 稀釋度的10倍，如果差別很大，說明實驗有差錯。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 平板菌落測數(shù)法雖然比較費時，但是不需要特殊的設(shè)備，并且所測定 的是活的細(xì)菌。平板菌落測數(shù)法測得菌落的數(shù)目，一般都要低于實際

23、數(shù)目。由此可見，平板菌落計數(shù)法測定的是可形成菌落單元(colony forming unit，CFU)并不是細(xì)菌的數(shù)目。當(dāng)然CFU和實際數(shù)之間是成正 相關(guān)的。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 第四節(jié)第四節(jié) 致病性的測定致病性的測定 病株上分離到的細(xì)菌，確定它的致病性，是一種細(xì)菌病害鑒定的關(guān) 鍵。一般來說，致病性的和腐生性的細(xì)菌是很難從形態(tài)和其他細(xì)菌 學(xué)性狀上區(qū)別的。黃單胞菌屬的植物病原細(xì)菌是比較容易鑒別的一 類。這類細(xì)菌大都是致病性的，有很明顯的形態(tài)特征(單根極鞭)，菌 落的性狀也比較典型。 而其他幾個屬的植物病原細(xì)菌，尤其是假單胞菌屬細(xì)菌，就沒有這 樣明顯的特征可以作為初步鑒別的依據(jù)。因此，一般

24、的工作順序是 先確定致病性，完成符合柯赫法則的要求，然后再進(jìn)行其他細(xì)菌學(xué) 測定。在致病性沒有確定前就進(jìn)行一系列的細(xì)菌生理生化學(xué)測定， 最后可能發(fā)現(xiàn)分離到的并不是真正的病原細(xì)菌。因此，寧可多花些 時間確定致病性。進(jìn)度似乎較慢，事實上可能更快一些。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 1過敏性反應(yīng)過敏性反應(yīng)致病性的初步測定致病性的初步測定 為了確定分離到的大量菌種哪些是致病性的，用常規(guī)接種方法比 較費事，有的要經(jīng)過相當(dāng)長的時間。用植物的過敏性反應(yīng)，來快 速篩選致病性細(xì)菌。 方法是將濃度107/ml的細(xì)菌的懸浮液注射在煙草葉片的細(xì)胞間致 病性細(xì)菌往往在6-24h內(nèi)就在注射點周圍出現(xiàn)過敏性枯斑，而腐生 性細(xì)菌

25、則不表現(xiàn)這種反應(yīng)。 注射Pseudomonas屬細(xì)菌的，一般在6-l0h 即出現(xiàn)枯斑，注射 Xanthomonas屬細(xì)菌的要10-24h。注射的植物要在光照良好的溫室 中培養(yǎng)，溫度在25-35間，由于枯斑的出現(xiàn)很快，因此也可用離 體葉片接種的方法，溫度和光照便于控制。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 除去煙草外，其他植物也能用來測定過敏性反應(yīng)，如棉苗的子葉 可以測試水稻白葉枯病細(xì)菌，酸漿屬植物可用來測定歐文氏菌屬 的細(xì)菌等。蠶豆葉片也是很好的試驗材料。 過敏性反應(yīng)的測定只能作為一種參考性狀，以此可以初步區(qū)別分 離到的菌種是否為致病性的，但是它的適用范圍還要經(jīng)過更多的 實踐經(jīng)驗。因此，致病性的最后確

26、定，一般還要用常規(guī)的接種方 法。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2常規(guī)接種技術(shù)常規(guī)接種技術(shù) （1）接種物的準(zhǔn)備 繁殖的細(xì)菌一般都配成懸浮液接種，有時也可直接用來接種。 至于測定菌系致病性的強(qiáng)弱和比較品種抗病性的差異等，則規(guī)定 一定的濃度為妥，濃度太低有時接種不易成功。針對不同的病原 細(xì)菌和實驗的要求，經(jīng)過實踐確定適當(dāng)?shù)臐舛?，一般可用每毫?含3億個細(xì)菌(3l08CFU/m1)的菌液。接種用的細(xì)菌要注意菌齡， 菌齡老則細(xì)菌致病力顯著減退，接種后甚至不發(fā)病。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 (2)各種類型細(xì)菌病害的常用接種方法各種類型細(xì)菌病害的常用接種方法 1葉斑病和葉枯病的接種 葉斑和葉枯是最常見的細(xì)

27、菌病害，接種的方法很多，但不外乎使 細(xì)菌從傷口或氣孔等自然孔口侵入葉片。由于植物病原細(xì)菌不能從表 皮直接侵入，也不像真菌那樣以孢子萌發(fā)形成的芽管從氣孔侵入，因 此要求在接種的時候就有較多的細(xì)菌進(jìn)入氣孔內(nèi)。 針刺接種 噴霧接種 高壓噴霧接種 摩擦接種 接種方法接種方法 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 1)針刺接種針刺接種 針刺接種是很有效的接種方法，為了測定分離到的細(xì)菌的致病性， 一般都先試用這種方法。比較簡單的辦法是：用接種針從瓊膠斜面 上挑取少許細(xì)菌直接穿刺葉片接種。為了提高接種效率，可以將許 多針固定在橡皮塞或軟木塞上，蘸取細(xì)菌懸浮液接種，一般稱為多 針接種法。針刺接種后的植物，不一定要求保濕

28、，但有時保濕的效 果要好一些。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2)噴霧接種噴霧接種 將細(xì)菌懸浮液噴布葉面是常用的接種方法，在葉背更好。懸浮液的濃 度一般是106107CFU/ml，有時濃度高一些更好。植物在接種后要保 濕24-48h左右，如接種前也保濕24h，使氣孔張開，則效果更好。 大田噴霧接種，保濕是很困難的，因此多半是在傍晚進(jìn)行。由于噴霧 接種的細(xì)菌只有很少一部分能夠從氣孔進(jìn)入葉片內(nèi)，接種的效率較低； 為了提高接種的效率，噴霧時可以在細(xì)菌懸浮液中加適當(dāng)?shù)恼共紕?如吐溫20或各種洗滌劑等。吐溫的用量在0.11.0左右。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 3)高壓噴霧接種高壓噴霧接種 細(xì)菌懸浮液用

29、高壓噴霧方法接種，會有較大量的細(xì)菌進(jìn)入組織內(nèi)。噴 過的葉組織，充水而呈水漬狀，有利于細(xì)菌的蔓延，接種的效率高， 并且發(fā)病一般也較重。許多細(xì)菌病害在暴風(fēng)雨后迅速蔓延，可以說是 天然的高壓噴霧接種造成的。 接種細(xì)菌懸浮液的濃度，一般不宜超過5106CFU/ml；溫室接種的植 物，接種后一般保濕24-48h，有時不保濕也能發(fā)病。 高壓噴霧也適用于大田接種，在每4000ml左右稀釋的細(xì)菌懸浮液中， 還可加容量15ml的金剛砂(600目)，加壓206841413682Pa在傍晚接種。 接種后不保濕，方法與汁液傳染的植物病毒病的大田接種相似。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 4)摩擦接種摩擦接種 u少量植物接

30、種，可以在葉片上撒少量金剛砂(600目)，然后用紗布蘸取 細(xì)菌懸浮液(濃度約107CFU/m1)在表面輕輕摩擦接種。 u 葉斑和葉枯類型的細(xì)菌病害，還可以用將細(xì)菌懸浮液注射到葉片組織 或灌注在心葉中(如玉米的喇叭口)的方法接種。 u有些在維管束組織中蔓延很快的葉枯病(如水稻白葉枯病和玉米細(xì)菌 性葉枯病),可以用在細(xì)菌懸浮液中浸過的剪刀剪葉的方法接種 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 2腫瘤和莖稈枝條病害的接種 腫瘤和莖桿枝條病害的接種，一般都是用針刺或注射的方法接種 3腐爛病的接種 腐爛病一般都是用針刺或注射的方法接種。塊根和塊莖還可以剖 開或切成薄片，在切面上滴細(xì)菌懸浮液接種。植物病原細(xì)菌很少引

31、起根腐(塊根除外)，但莖腐還是常見的。 4蔫萎病的接種 蔫萎病的接種可以采用針刺、注射、蘸或灌注土壤等方法接種， 使細(xì)菌侵入到寄主維管束組織中。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 第五節(jié)第五節(jié) 細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌的形態(tài) 革蘭氏染色法 革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。它的機(jī)制還不完全了解 一種解釋是堿性染料可以穿過細(xì)胞壁與細(xì)胞原生質(zhì)的酸性成分起作用， 加碘以后形成復(fù)合體。革蘭氏反應(yīng)陽性的細(xì)菌，它的細(xì)胞壁阻止褪色 劑對復(fù)合體中染料的提取，所以不褪色。革蘭氏反應(yīng)陰性的細(xì)菌，可 能由于細(xì)胞壁中含有較多的類脂物，可以被褪色劑溶解，因而染料可 被提取而褪色。 還有一種解釋認(rèn)為碘液是起染媒劑的作用，與結(jié)晶紫

32、以及細(xì)胞中核糖 核和鎂離子形成復(fù)合體，這種復(fù)合體不容易被褪色。革蘭氏染色反應(yīng) 陰性的細(xì)菌不形成這的復(fù)合體，結(jié)晶紫就容易褪色除去。 方法及其他注意事項(略) 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 結(jié)果: 陽性菌陽性菌紫色紫色 陰性菌陰性菌紅色紅色 結(jié)晶紫初染 碘液媒染 乙醇脫色 番紅復(fù)染 涂片固定 由丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年創(chuàng)立。 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 Figure 1 - Gram + Figure 2 - Gram- 植病研究法細(xì)菌病害的研究法 鞭毛染色鞭毛染色 植物病原細(xì)菌的染色，除去革蘭氏染色外，最重要的是鞭毛染色。鞭 毛的有無、數(shù)目和著生部位是重要的分類和鑒定性狀。一種植物病原 細(xì)菌，經(jīng)過革蘭氏染色和鞭毛染色，大致已經(jīng)可以確定它的屬。 細(xì)菌的鞭毛很細(xì)(只有0.020.03m)，一般光學(xué)顯微鏡看不清，鞭毛 上沉積了染劑后才能看到，這是所有鞭毛染色法的根據(jù)。 由于染劑也可以在載玻片上沉積，所以要用非常清潔的載玻片。染劑 處理的時間很重要，處理時間太短，鞭毛上沒有足