TurboFlow在線凈化―液相色譜―串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜禽肉中20種氟喹諾酮類獸藥殘留量-最新文檔

1、TurboFlow 在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜 禽肉中 20 種（氟）喹諾酮類獸藥殘留量2 ?g/kg ，其余 17 種（ F）QNs為 1 ?g/kg ；20 種（ F）QNs 在3 個(gè)水平的添加回收率為 85.4% 108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.04%8.57%。方法簡(jiǎn)單、快速、回收率高、重復(fù)性好，適用于 動(dòng)物源食品中（ F） QNs的定量及確證檢測(cè)。Determination of 20 （ Fluoro ） Quinolones Residues in Livestock and Poultry Meat by TurboFlow OnlineCleanup-Liquid C

2、hromatography-Tandem Mass SpectrometryWANG Bingling1， TIAN Jixin2 ， XIANG Jialin1 ， AI Lianfeng1 ，*（ 1.Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ， Shijiazhuang 050051 ， China ；2.College of Food Science and Engineering， ShandongAgricultural University， Tai an 271018， China ）： A new method was

3、 developed for the determination of （fluoro ）quinolones （ F）QNs） residues in livestock and poultry meat using TurboFlow online cleanup （ TFC） -liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS） .Samples were extracted with methanol-acetonitrile（ 1 ： 1， V/V ） mixture. Then the extract was purif

4、ied on a Cyclone-p column. Subsequently ， the analytes were separated on a Hypersil Gold C8 column before being analyzed by tandem mass spectrometry. The calibration curves showed good linearity with R2 0.99 in the concentration range from 0.2 to20.0 ng/mL for cinoxacin ， enrofloxacin and danofloxac

5、in ， and in the range from 0.1 to 10.0 ng/mL for 17 other （F） QNs. The limit of quantization for enrofloxacin ， danofloxacin and cinoxacin was 2g/kg ，while that for 17 other（F）QNs was 1 g/kg. Averagerecoveries of the analytes fortified at three levels ranged from 85.4% to 108.2% ， with relative stan

6、dard deviations （ RSDs） between 4.04% and 8.57%. The method was characterized by simplicity ， rapidity ， high recovery and good repeatability and was suitable for quantitative analysis and confirmation of （ F）QNsr esidues in foods of animal origin.Keywords： TurboFlow online cleanup-liquid chromatogr

7、aphy ； tandem mass spectrometry ； （ fluoro ） quinolones ； residue ； livestock and poultry meatDOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006引文格式：王炳玲， 田霽昕， 項(xiàng)佳林， 等. TurboFlow 在線凈化 - 液 相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定畜禽肉中 20 種（氟）喹諾酮類獸藥殘 留量J. 肉類研究， 2018， 32（5）： 30-38. DOI ： 10.7506/rlyj1001-8123-201805006. http：/rlyj.pubWANG Binglin

8、g ， TIAN Jixin ， XIANG Jialin ， et al. Determination of 20 （fluoro ） quinolones residues in livestock and poultry meat by turboflow online cleanup-liquid chromatography-tandem mass spectrometryJ.Meat Research， 2018 ， 32 （ 5）： 30-38.DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201805006. http： /rlyj.pub（氟）喹諾酮類藥物（ Fluor

9、o ）quinolones ，（ F） QNs） 是人工合成的含有 4- 喹酮母核的一類廣譜抗菌藥物，因其 具有抗菌譜廣、高效、吸收好、組織濃度高、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)， 已成為獸醫(yī)臨床和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一 1 。（F）QNs在食用動(dòng)物飼養(yǎng)中的廣泛應(yīng)用必然導(dǎo)致其在食用 組織中的殘留問(wèn)題，而殘留的（ F）QNs容易誘導(dǎo)人類的病原微 生物對(duì)其產(chǎn)生耐藥性 2 ，因此，（ F）QNs的殘留問(wèn)題已引起廣泛關(guān)注。美國(guó)禁止在 食用動(dòng)物養(yǎng)殖中使用（ F）QNs；世界衛(wèi)生組織、歐盟及日本等國(guó) 家和組織都將（ F） QNs列入限制使用的獸藥名單中，并規(guī)定了 相應(yīng)的最高殘留限量；我國(guó)于 2002 年規(guī)定

10、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin ，CIP)、丹 ?Z 沙星( danofloxacin ， DAN)、 恩諾沙星( enrofloxacin ， ENR)、沙拉沙星( sarafloxacin ， SAR)、二氟沙星 ( difloxacin ，DIF)、惡喹酸( oxolinic acid ， OXOA)及氟甲喹( flumequine ，F(xiàn)LU)7 種( F)QNs在動(dòng)物肌肉 組織中的最高殘留限量為 10 500 g/kg3-7 。目前，液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry ， LC-MS/MS)技術(shù)日臻

11、完善，高選擇性、高 靈敏度以及高通量等特性使其特別適合用于殘留分析， 現(xiàn)已成為 獸藥殘留分析的首選檢測(cè)方法之一，在( F)QNs殘留分析中的 應(yīng)用較多 8-14 ，應(yīng)用領(lǐng)域也非常廣泛， 檢測(cè)的樣品包括環(huán)境中 的水、土壤、食品中的蜂蜜、肉、蛋、乳等。但LC-MS/MS的前處理過(guò)程復(fù)雜繁瑣，所需工作量較大，且成本較高。多數(shù)樣品的 前處理方法都需要經(jīng)過(guò) SPE小柱的手動(dòng)凈化富集 15-18 或是引 入 QuEChERS技術(shù) 19-20 才能達(dá)到殘留檢測(cè)的要求， 動(dòng)物源食品 的測(cè)定甚至還需要在固相萃取前加上脫脂這一步驟 21-23 。提 取凈化步驟的增加不僅使檢測(cè)方法更加繁雜、 分析效率降低， 而 且

12、分析步驟越多， 不同結(jié)構(gòu)類型的多種分析物同時(shí)達(dá)到符合殘留 分析規(guī)定要求的技術(shù)指標(biāo)難度越大，準(zhǔn)確度很難保證。TurboFlow 在線凈化技術(shù)以多孔大粒徑的填料為吸附劑，不 同類型的凈化柱鍵合不同的化學(xué)基團(tuán)， 這種在線凈化柱結(jié)合了擴(kuò) 散作用、 體積排阻作用和化學(xué)作用， 通過(guò)改變流動(dòng)相配比和選擇 不同功能的色譜柱， 大分子雜質(zhì)先被洗脫出凈化柱， 而有機(jī)小分 子藥物被吸附富集， 快速實(shí)現(xiàn)在線凈化和分析檢測(cè)。 該技術(shù)已成 功應(yīng)用于食品中化學(xué)污染物的分析檢測(cè)， 例如，其在動(dòng)物源食品 中金剛烷胺的殘留檢測(cè)以及藥物中真菌毒素的快速測(cè)定等方面 均有很好的應(yīng)用 24-27 。本研究運(yùn)用 TurboFlow 在線凈

13、化 -LC-MS/MS技術(shù)結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)方法 28-30 測(cè)定畜禽肉中 20 種（ F）QNs的殘留量。1 材料與方法1.1 材料與試劑標(biāo)準(zhǔn)品：吡哌酸（ pipemidic acid ， PIPA，純度 99.0%）、 伊諾沙星（ enoxacin ， ENO，純度 99.0%）、麻寶沙星 （marbofloxacin ，MAR，純度 99.0%）、諾氟沙星 （norfloxacin ， NOR，純度 99.0%）、氟羅沙星 （fleroxacin ，F(xiàn)LE，純度 98.0%）、 氧氟沙星 （ofloxacin ，OFL，純度 99.0%）、CIP（純度 94.0%）、 培氟沙星（ peflo

14、xacin ，PEF，純度 99.0%）、鹽酸洛美沙星 （lomefloxacin hydrochloride， LOM，純度 99.0%）、 DAN（純度 94.0%）、ENR（純度 99.0%）、奧比沙星 （ orbifloxacin ，ORB， 純度 99.0%）、西諾沙星（ cinoxacin ， CIN，純度 99.5%）、加 替沙星（ gatifloxacin ，GAT，純度 98.0%）、SAR（純度 97.0%）、 司帕沙星（ spatfloxacin ，SPA，純度 99.0%）、OXO（A純度 98.3%）、 DIF（純度 96.0%）、萘定酸（nalidixic acid

15、 ，NALA，純度 99.5%） 和 FLU（純度 98.3%），均購(gòu)于德國(guó) Dr. Ehrenstorfer GmbH 公 司。內(nèi)標(biāo)化合物：氘代諾氟沙星（ norfloxacin-D5 ，NOR-D，5 純 度 99.4%）、氘代環(huán)丙沙星（ ciprofloxacin-D8 ， CIP-D8，純度 99.5%）和氘代恩諾沙星 （enrofloxacin-D5 ，ENR-D5，純度 99.0%） 均購(gòu)于德國(guó) Witega 公司。甲酸、異丙醇、 乙腈、丙酮和甲醇均為色譜純， 水為 Milli-Q 高純水。豬肉及雞肉樣品均購(gòu)自本地超市。1.2 儀器與設(shè)備TurboFlow 在線凈化 TSQ Qua

16、ntum Ultra LC-MS/MS 儀（由 CTC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器（配備 100 ?L 定量環(huán)）、 2 個(gè)耐壓 1.25 105 kPa 的四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切 換裝置和 TSQ Quantum Ultra 三重四極桿質(zhì)譜儀組成） 美國(guó) ThermoFisher 公司； 3K-15 離心機(jī) 德國(guó) Sigma 公司； PT2100 均質(zhì)器 瑞士 Kinematica公司； Milli-Q 純化系統(tǒng) 美國(guó) Millipore 公司。1.3 方法1.3.1 樣品制備準(zhǔn)確稱取約 5.00 g 樣品，置于 50 mL 離心管中，加入內(nèi)標(biāo) 混合液（1 ?g/mL，125 ?L）和

17、25 mL甲醇- 乙腈溶液（11，V/V）， 均質(zhì) 1 min ， 4 000 r/min 條件下離心 10 min ；取 1 mL 左右上 清液，于 45 條件下氮吹至干，用 1 mL 0.5%甲酸水溶液溶解， 溶解液經(jīng) 0.22 ?m 微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。1.3.2 在線凈化色譜條件 在線凈化程序主要為凈化和分離過(guò)程， 凈化過(guò)程（TurboFlow chromatography ， TFC）由上樣泵驅(qū)動(dòng)凈化流動(dòng)相在 TurboFlow 柱上完成，分離過(guò)程（ LC）由分離泵驅(qū)動(dòng)分析流動(dòng)相在分析柱上 完成。整個(gè)程序通過(guò) 2 個(gè)六通閥的切換使流路改變，實(shí)現(xiàn)在線 凈化富集。凈化柱為 Cyclo

18、ne-p 柱（0.5 mm50 mm， 60 m， 60 ? ）， 流動(dòng)相 A為 0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相 B 為乙腈，流動(dòng)相 C為丙 酮- 乙腈- 異丙醇溶液（ 111， V/V），進(jìn)樣量 80 L。LC儀的分析柱為 Hypersil C8 柱（2.1 mm150 mm， 5 m），流動(dòng)相 A 為 0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相 B 為乙腈。TurboFlow 在線凈化梯度洗脫程序如表 1 所示，其中 TFC 每步的變化均采用瞬變模式， HPLC除最后一步采用瞬變模式外， 其他步驟間的改變均采用漸變模式。 TurboFlow 在線凈化流路切 換模式示意圖如圖 1 所示。1.3.3 質(zhì)譜條件 電

19、噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描模式；鞘氣壓力 40 psi ；輔助氣壓力 30 psi ；離子源溫度 350 ；電噴霧電壓 3 500 V；源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓 10 V；毛細(xì)管溫度 350 ；四級(jí)桿 1、四 級(jí)桿 3 單位分辨率 0.7 。優(yōu)化得到其他測(cè)定條件。2 結(jié)果與分析2.1 提取溶劑的選擇（F）QNs為兩性化合物，隨結(jié)構(gòu)的不同化學(xué)性質(zhì)略有差別。 本研究分別采用甲醇、乙腈、 1%甲酸甲醇、 1%甲酸乙腈和甲醇 - 乙腈（ 11， V/V）作為提取溶劑，比較各溶劑的提取效果。結(jié) 果表明：對(duì)于極性稍強(qiáng)的化合物，如 PIPA、ENO、MAR、NOR、FLE 和 OFL，甲醇的提取效果最佳，回收

20、率 ?c 其他 3 種溶劑相比較 高；而對(duì)于極性稍弱的 OXO、A DIF、 NALA和 FLU，乙腈的提取效 果最佳；對(duì)于其他化合物，甲醇和乙腈的提取效果相當(dāng)，略高于 酸性的甲醇和乙腈。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用甲醇- 乙腈（11， V/V）作為提取溶劑，基質(zhì)外標(biāo)法校正的回收率均高于 80%。2.2 TurboFlow 在線凈化條件的優(yōu)化TFC在線凈化過(guò)程主要包括上樣、 洗脫轉(zhuǎn)移、 淋洗和條件化。 本研究采用不接分析柱， 分流進(jìn)質(zhì)譜方式優(yōu)化每一步的在線凈化 條件。在上樣步驟，本研究選擇 0.5%甲酸溶液作為上樣流動(dòng)相， 對(duì)陽(yáng)離子在線凈化柱（ Cyclone MCX）和反相混合基質(zhì)在線凈化

21、柱（ Cyclone-p ）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在 Cyclone MCX 柱上 20 種目標(biāo)化合物不能完全保留，而在 Cyclone-p 柱上 20 種目標(biāo)化 合物均能有效保留， 且在洗脫轉(zhuǎn)移一步能夠被完全洗脫， 故選擇 Cyclone-p 作為在線凈化柱， 0.5%甲酸溶液作為上樣流動(dòng)相。洗脫轉(zhuǎn)移時(shí)需選擇合適的洗脫液， 既要保證分析物被完全洗 脫又不能影響分析物在分析柱上的分離。 Cyclone-p 為反相萃取柱，高比例的有機(jī)溶劑是洗脫的保證。洗脫環(huán)體積為200 ?L，洗脫時(shí)將凈化流路和分析流路合并， 為稀釋洗脫溶液， 凈化流路 的流速較低 （0.1 mL/min），分析流路的流速較高 （

22、0.5 mL/min）。 在此條件下，采用不同比例的 0.5%甲酸溶液與乙腈混合液洗脫 目標(biāo)化合物， 結(jié)果表明， 當(dāng)混合洗脫液中乙腈的比例高于 60%時(shí)， 20 種目標(biāo)化合物能夠完全洗脫，但過(guò)高比例的乙腈會(huì)影響目標(biāo) 化合物的峰型，當(dāng)混合洗脫液中乙腈的比例高于80%時(shí)，目標(biāo)化合物的峰型明顯變寬且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。因此選擇乙腈 -0.5% 甲酸 溶液（ 6040， V/V）作為洗脫溶劑。由圖 2 可知，上樣過(guò)程基本沒(méi)有損失， 洗脫環(huán)中的溶液可以 完全洗脫分析物（ 2 min 內(nèi)）。淋洗和條件化是目標(biāo)化合物在分析柱分離和質(zhì)譜檢測(cè)過(guò)程 中，由凈化泵帶動(dòng)洗脫能力較強(qiáng)的溶劑對(duì) TFC柱進(jìn)行淋洗， 并用 洗脫溶

23、劑充滿洗脫環(huán)， 以備下一個(gè)樣品的分析。 本研究選擇丙酮 -乙腈-異丙醇（ 111， V/V）作為強(qiáng)洗脫溶劑，充分淋洗 TFC 柱，然后用 0.5%甲酸進(jìn)行初始化。2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化用蠕動(dòng)泵以 10 L/min 的速率注入 1 g/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶 液，確定各化合物的最佳質(zhì)譜條件，包括選擇特征離子對(duì)、優(yōu)化 電噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、碰撞能量等條件。各化合物的混合 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)混合液進(jìn)入電噴霧電離源， 分別在正、 負(fù)離子掃 描模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析， 得到分子離子峰。 結(jié)果表明， 各化合物均在正離子模式下有較高的響應(yīng)值， 負(fù)離子模式下響應(yīng) 值很低。 然后對(duì)各分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析

24、， 得到碎片離子 信息，根據(jù)響應(yīng)值的大小確定定性、定量離子。優(yōu)化后目標(biāo)化合 物的參考保留時(shí)間、母離子、子離子和碰撞能量如表 2 所示。2.4 方法的線性和基質(zhì)影響根據(jù)每種（ F）QNs的靈敏度，用甲醇配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作 溶液，用雞肉空白樣品的提取液配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行測(cè)定。其中， ENO、DAN和 CIN 系列標(biāo)準(zhǔn) 工作溶液的質(zhì)量濃度均分別為 0.2 、0.5 、2.0 、5.0 、20.0 ng/mL， 其余（ F）QNs系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度均分別為 0.1 、0.5、 1.0 、5.0 、10.0 ng/mL。用目標(biāo)化合物的峰面積與選定內(nèi)標(biāo)化合 物的峰面

25、積比率對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)組分的質(zhì)量濃度作圖。 由表 3 可知，不同基質(zhì)對(duì)分析物測(cè)定的影響不同。 豬肉樣品同樣 存在基質(zhì)影響， 需要用空白樣品提取液作為基質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方 程。對(duì)于 CIP、NOR和 ENR，因其有同位素內(nèi)標(biāo)，校正了基質(zhì)影 響，使得空白樣品提取液作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程與甲醇溶液作 為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相差不大； 而其他化合物因沒(méi)有相應(yīng)的同 位素內(nèi)標(biāo)，色譜共洗脫組分的干擾對(duì)其電噴霧離子化存在抑制作 用，導(dǎo)致空白樣品提取液作為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程響應(yīng)值較低。 雖然 3 個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)沒(méi)有抵消掉所有化合物的基質(zhì)影響，但可 以校正提取和在線凈化過(guò)程的損失，提高方法的回收率和精密 度。綜合考慮， 本研究采用空白樣品提取液作為基質(zhì)的內(nèi)標(biāo)法定量分析目標(biāo)化合物。2.5 方法的特異性分別對(duì) 20 種（ F）QNs進(jìn)行測(cè)定，選擇信號(hào)值較高的