基因工程重組體克隆篩選和鑒定實用課件

1、第七章第七章 重組體克隆的篩選和鑒定重組體克隆的篩選和鑒定 第第1頁頁/共共89頁頁 一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位點上有插入位點BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位點上有插入位點Pst I。 第一節(jié) 載體表型選擇法 1. 原理： 第第2頁頁/共共89頁頁 第第3頁頁/共共89頁頁 （1）四環(huán)素：）四環(huán)素： （2）氨芐青霉素抗性基因：）氨芐青霉素抗性基因： 2. pBR322抗菌素標(biāo)記選擇 產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍?霉酮酸，使

2、碘-青霉素指示液（I2-KI- Aampicillin）（藍灰色）褪色。 抑制細菌生長，但不殺死細菌。 殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。 （3）環(huán)絲氨酸： 第第4頁頁/共共89頁頁 3. 選擇過程： 如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，導(dǎo)致四，導(dǎo)致四 環(huán)素抗性基因失活，可用環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)四環(huán)素加環(huán) 絲氨酸絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。 Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán) 絲氨酸殺死，保留下來；絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長， 反而被

3、環(huán)絲氨酸殺死。反而被環(huán)絲氨酸殺死。 （1）四環(huán)素抗性插入失活）四環(huán)素抗性插入失活 第第5頁頁/共共89頁頁 無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基 第第6頁頁/共共89頁頁 （2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程 如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性 基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。也可以用 含青霉素的培養(yǎng)基直接篩選。青霉素分子不消耗碘， 其降解產(chǎn)物青霉酮酸消耗碘，因此可根據(jù)碘的顯色 反應(yīng)確定氨芐青霉素抗性基因是否失活。 藍色 碘沒有消耗 青霉素沒降解 陽性克隆 第第7頁頁/共共89頁頁 抗藥性標(biāo)記選擇應(yīng)注意的問題 抗藥性標(biāo)記選擇如果用藥物直接篩選，觀察和確定 轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時間不宜

4、過長，以1216小時 為宜，否則會出現(xiàn)假陽性轉(zhuǎn)化子菌落。因為轉(zhuǎn)化子 菌落會降解選擇藥物，導(dǎo)致非陽性轉(zhuǎn)化子菌落周圍 選擇藥物濃度降低。 第第8頁頁/共共89頁頁 二、-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖 半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖 Xgal半乳糖半乳糖 5-溴-4-氯靛藍 + + 深藍色深藍色 1. 原理： 載體上有一段 第第9頁頁/共共89頁頁 2. 選擇過程 第第10頁頁/共共89頁頁 Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。 第第11頁頁/共共89頁頁 利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物表達產(chǎn)物特性進行直特性進行直 接選擇。（只在特定條件下）。接選擇。（只在特定條件下）

5、。 轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受 體菌株的突變型缺陷。體菌株的突變型缺陷。 一、原理： 1.彌補缺陷彌補缺陷 his- - his+ + 受體菌：受體菌： 外源基因：外源基因： 在不含組氨酸的在不含組氨酸的 培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)基中生長 第第12頁頁/共共89頁頁 小鼠的小鼠的二輕葉酸還原酶二輕葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧）對三甲氧 芐二氨嘧啶有抗性。芐二氨嘧啶有抗性。 DHFR 載體載體 連接連接 轉(zhuǎn)化受轉(zhuǎn)化受 體菌體菌 三甲氧芐二氨嘧三甲氧芐二氨嘧 啶培養(yǎng)基平板啶培養(yǎng)基平板 含含DHFR的克隆才能生長的克隆才能生長 例：例： 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因

6、的表型。 2. 增加新性狀 第第13頁頁/共共89頁頁 利用有插入片段的重組載體的分子量比利用有插入片段的重組載體的分子量比 野生型載體分子量大。野生型載體分子量大。 一、直接電泳檢測法一、直接電泳檢測法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆 中分離質(zhì)粒，電泳、中分離質(zhì)粒，電泳、 比較其分子量。比較其分子量。 第三節(jié) DNA電泳檢測法 分子量分子量 Marker 載體載體 重組克隆重組克隆 第第14頁頁/共共89頁頁 二、酶切電泳篩選法 1. 原理：原理： 根據(jù)已知的外源根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切 圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電

7、泳后比較電泳結(jié)果（泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）。帶數(shù)和長度）。 或用合適的內(nèi)切酶切下插入片段，再用或用合適的內(nèi)切酶切下插入片段，再用 其它酶切這個片段，電泳后比較結(jié)果是其它酶切這個片段，電泳后比較結(jié)果是 否符合預(yù)計的結(jié)果。否符合預(yù)計的結(jié)果。 第第15頁頁/共共89頁頁 A B A或或B 第第16頁頁/共共89頁頁 第第17頁頁/共共89頁頁 不同克隆的酶切結(jié)果 第第18頁頁/共共89頁頁 插入片段 第第19頁頁/共共89頁頁 1. 原理原理 PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片段。片段。 2. 過程過程 （1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或

8、DNA）。）。 （2）用外源）用外源DNA插入片段引物作插入片段引物作PCR。 （3）電泳）電泳PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 （4）檢查是否有）檢查是否有PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物。 （5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。 第第20頁頁/共共89頁頁 1. 核酸核酸雜交雜交 第四節(jié) 核酸雜交檢測法 一、原理： 重組克隆與探針雜交。 3. 識別標(biāo)記識別標(biāo)記 32P 或 125I 。 （1）放射性同位素）放射性同位素 2. 檢測用的探針檢測用的探針 與外源與外源DNA插入片段互補的序列。插入片段互補的序列。 （2）非放射性標(biāo)記）非放射性標(biāo)記 熒光素 第第21頁頁/共共89頁頁 二、核

9、酸雜交檢測方法 用用DNA（或（或RNA）探針檢測）探針檢測DNA樣品。樣品。 1. Southern blotting 從宿主細胞中提取從宿主細胞中提取DNA（或質(zhì)粒（或質(zhì)粒 載體），再用探針雜交。載體），再用探針雜交。 只有帶有插入片段的重組載體才能 與探針雜交，在底片上曝光顯示。 第第22頁頁/共共89頁頁 酶切前酶切前酶切后酶切后 插入片段插入片段 載體含載體含 插入片段插入片段 插入片段探針雜交結(jié)果插入片段探針雜交結(jié)果 第第23頁頁/共共89頁頁 Southern blot 篩選 結(jié)果 第第24頁頁/共共89頁頁 （1）原位雜交篩選 特點：特點： 對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變， 可以直

10、接找出陽性菌落。 第第25頁頁/共共89頁頁 第第26頁頁/共共89頁頁 （2）R-環(huán)檢測法 DNA-RNA雜交。雜交。 2）原理： 3）選擇過程）選擇過程 在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜 交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。 用外源基因的用外源基因的mRNA與重組載體雜交。與重組載體雜交。 1）R-環(huán)： R-環(huán)：是指RNA通過取代與其序列一致的DNA鏈而與雙鏈 DNA雜交，被取代的DNA單鏈與RNA-DNA雜交雙鏈所形成 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 第第27頁頁/共共89頁頁 缺點：需要電鏡！缺點：需要電鏡！ 第第28頁頁/共共89頁頁 2. Nor

11、thern blotting 用用DNA（或（或RNA） 探針檢測探針檢測RNA樣樣 品。品。 主要檢測插入片主要檢測插入片 段是否被轉(zhuǎn)錄。段是否被轉(zhuǎn)錄。 從宿主細胞中提從宿主細胞中提 取取RNA，再用探，再用探 針雜交。針雜交。 第第29頁頁/共共89頁頁 利用抗體作為利用抗體作為“探針探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌來檢測轉(zhuǎn)入受體菌 并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。 根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗） 的性質(zhì)可分為幾種作用方式：的性質(zhì)可分為幾種作用方式： 第五節(jié) 免疫化學(xué)檢測法 1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方

12、式 對表達產(chǎn)物的檢測。對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白蛋白蛋白蛋白“雜交雜交” 第第30頁頁/共共89頁頁 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗二抗 125I 標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白 固相支 持濾膜 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 125I標(biāo)記的二抗 固相支 持濾膜 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 固相支 持濾膜 固相支 持濾膜 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 125I 標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白 125I標(biāo)記的二抗 第第31頁頁/共共89頁頁 2. 放射性抗體檢測法過程 第第32頁頁/共共89頁頁 質(zhì)?；蛸|(zhì)?；駻 插入基因插入基因B 表達表達 質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白B 融合蛋白融合蛋白 檢測融合蛋白。檢測融合蛋白。 既檢測外源基因

13、產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。 第第33頁頁/共共89頁頁 固相支 持濾膜 抗A抗體 125I標(biāo)記的 抗B抗體 質(zhì)粒蛋白A 外源蛋白B 質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B 固相支 持濾膜 抗A抗體 發(fā)光，底片曝光發(fā)光，底片曝光 第第34頁頁/共共89頁頁 二、免疫沉淀檢測法 把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插 入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍 時，就會與抗體反應(yīng)形成時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈沉淀圈”。 1. 原理原理 抗原抗原抗體抗體 凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)。 檢測分泌型產(chǎn)物。檢測分泌型產(chǎn)物。 2.

14、 方法方法 第第35頁頁/共共89頁頁 對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行 原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。 第第36頁頁/共共89頁頁 三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant(免疫吸收劑免疫吸收劑)assay 1. 原理：原理： 一抗（一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 與一抗的特異性結(jié)合。與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（酶連（enzyme-link

15、e）： 二抗上攜帶一種酶二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色能催化一種反應(yīng)將無色 的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過 比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而 推測目標(biāo)分子的含量。推測目標(biāo)分子的含量。 第第37頁頁/共共89頁頁 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 酶 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 無色的底物無色的底物 有色的產(chǎn)物有色的產(chǎn)物 比色觀察比色觀察 酶 第第38頁頁/共共89頁頁 （1）固定樣品）固定樣品 將待測樣品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后就 被固定在孔

16、底。 孔底孔底 第第39頁頁/共共89頁頁 加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。 （2）一抗結(jié)合 一抗一抗 第第40頁頁/共共89頁頁 加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二 抗沖洗掉。二抗只識別一抗。抗沖洗掉。二抗只識別一抗。 二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物 酶、脲酶等）。 （3）二抗結(jié)合 二抗二抗 第第41頁頁/共共89頁頁 加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催 化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）?；磻?yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。 （4）顯色反應(yīng) 第第42頁頁/共共89頁頁 第第43頁

17、頁/共共89頁頁 在特殊的分光光度儀（在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀）上比色，打）上比色，打 印出結(jié)果。印出結(jié)果。 （5）比色 第第44頁頁/共共89頁頁 有效，但準(zhǔn)確性稍差（有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗主要取決于一抗 的特異性的特異性）。）。 必須與其他方法一起綜合考慮。必須與其他方法一起綜合考慮。 最好用最好用單克隆抗體單克隆抗體（monoclonal antibody）: 由單一由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某 一特定抗原表位的抗體。一特定抗原表位的抗體。 第第45頁頁/共共89頁頁 第第46頁頁/共共89頁頁 四、免疫印跡（western

18、 blotting）法 1.1.原理：原理： 在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫轉(zhuǎn)膜和免疫的方的方 法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)，并與蛋白質(zhì) 結(jié)合，使蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負電荷帶上負電荷。 SDS: （SDS-PAGE）： 第第47頁頁/共共89頁頁 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在電場的作用下線性在電場的作用

19、下線性 蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰 胺凝膠介質(zhì)中向正極胺凝膠介質(zhì)中向正極 移動，移動，移動的速率主移動的速率主 要取決于其分子量大要取決于其分子量大 ?。ㄦ湹拈L短）?。ㄦ湹拈L短），從，從 而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽 鏈分開。鏈分開。 電泳電泳buffer 電泳電泳buffer 第第48頁頁/共共89頁頁 點樣點樣 電泳方向電泳方向 第第49頁頁/共共89頁頁 蛋白質(zhì)電泳的分子 量標(biāo)準(zhǔn) 已知分子量的蛋白質(zhì)已知分子量的蛋白質(zhì) 混合液，與待測樣品混合液，與待測樣品 一起電泳，為樣品蛋一起電泳，為樣品蛋 白質(zhì)提供分子量估計。白質(zhì)提供分子量估計。 商品化供應(yīng)商品化供應(yīng) Da 道爾頓(

20、質(zhì)量單位, 等于 一氧原子質(zhì)量的十六分 之一。 一克約為61023道爾頓 第第50頁頁/共共89頁頁 Dalton 第第51頁頁/共共89頁頁 凝膠中的蛋白質(zhì)染色： 考馬斯亮藍：考馬斯亮藍： 靈敏度低、只能檢出靈敏度低、只能檢出0.3-1g/帶，但可帶，但可 褪色回收。褪色回收。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。 2）轉(zhuǎn)到膜上進行染色。）轉(zhuǎn)到膜上進行染色。 1）直接染色）直接染色 第第52頁頁/共共89頁頁 直接染色電泳結(jié)果 第第53頁頁/共共89頁頁 （2）Western blotting 電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法， 轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維

21、素膜、轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、膜、 中性尼龍膜等）。中性尼龍膜等）。 Western（轉(zhuǎn)膜）（轉(zhuǎn)膜） 膠里的蛋白質(zhì)帶在電膠里的蛋白質(zhì)帶在電 場的作用下場的作用下橫向橫向轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 到正極一側(cè)的膜上。到正極一側(cè)的膜上。 膜膜膠膠 蛋白蛋白 第第54頁頁/共共89頁頁 Western裝置 第第55頁頁/共共89頁頁 Blotting 原理與原理與ELISA相同。相同。 待測蛋白硝酸纖 維素膜 一抗 二抗 辣根過氧 化物酶 底物底物產(chǎn)物，產(chǎn)物， 并發(fā)出光并發(fā)出光 PAGE膠膠待測蛋白 底片曝光底片曝光 辣根過氧化物酶：辣根過氧化物酶：HRPO 第第56頁頁/共共89頁頁 第第57頁頁/共共

22、89頁頁 1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。膜上的蛋白結(jié)合。 2）洗去未結(jié)合的一抗。 3）用二抗與一抗結(jié)合（）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有二抗上帶有HRPO）。）。 4）清洗掉未結(jié)合的二抗。）清洗掉未結(jié)合的二抗。 5）用）用HRPO的底物浸泡膜。的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，沖洗膠片。）暗室里曝光，沖洗膠片。 Blotting過程 第第58頁頁/共共89頁頁 結(jié)果 單抗單抗blotting 結(jié)果結(jié)果 第第59頁頁/共共89頁頁 一、無細胞翻譯系統(tǒng)一、無細胞翻譯系統(tǒng) 第六節(jié) 轉(zhuǎn)譯篩選法 能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細胞提 取物。 如

23、：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細胞 提取物系統(tǒng)。 借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選 擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選 其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。 適用于適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。 第第60頁頁/共共89頁頁 mRNA 無細胞翻譯系統(tǒng) 35S標(biāo)記的 甲硫氨酸 翻譯翻譯 35S標(biāo)記的肽鏈 PAGE電泳 放射自顯影 比較放射性 帶紋的位置 載體載體+外源外源DNA 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 與預(yù)期的產(chǎn)物與預(yù)期的產(chǎn)物 分子量相符？分子量相符？ 第第61頁頁/共共89頁頁 mRNA一旦與一旦與

24、DNA雜交成雜交成RNA-DNA雙鏈雙鏈 后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被 抑制）。抑制）。 單鏈mRNA 核糖體 小亞基 核糖體 大亞基 能翻譯能翻譯 mRNA DNA 核糖體 小亞基 核糖體 大亞基 不能翻譯不能翻譯 1. 原理原理 第第62頁頁/共共89頁頁 第第63頁頁/共共89頁頁 1. 原理：原理： 在高甲酰胺溶液中載體上克隆的在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA 與它的與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋雜交吸附，然后洗脫，釋 放出與它對應(yīng)的放出與它對應(yīng)的mRNA，進行體外轉(zhuǎn)錄。，進行體外轉(zhuǎn)錄。 研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基研究其轉(zhuǎn)錄

25、產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基 因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。 第第64頁頁/共共89頁頁 2. 過程 硝酸纖 維素濾膜 載體和插 入的cDNA 總mRNA cDNA基因的 mRNA 雜交雜交 洗脫洗脫 cDNA基因的 mRNA體外翻譯體外翻譯 cDNA編編 碼的蛋白碼的蛋白 電泳電泳 凝膠放射自顯影凝膠放射自顯影 cDNA編 碼的蛋白 硝酸纖 維素濾膜 載體和插 入的cDNA 硝酸纖 維素濾膜 載體和插 入的cDNA 收集收集 35S標(biāo)記的氨基酸 標(biāo)記的氨基酸 第第65頁頁/共共89頁頁 專門設(shè)計檢測能同專門設(shè)計檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋特異結(jié)合的蛋 白質(zhì)因子。白

26、質(zhì)因子。 待測蛋白質(zhì) 硝 酸 纖 維 素 濾 膜 能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列 放射性標(biāo)記 待測蛋白質(zhì) 硝 酸 纖 維 素 濾 膜 能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列 放射性標(biāo)記 五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法 第第66頁頁/共共89頁頁 第第67頁頁/共共89頁頁 幾種常用的 真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸 提供甲基。提供甲基。 二氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸四氫葉酸 二氫葉酸還原酶（二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK選擇原理

27、 四氫葉酸的必要性四氫葉酸的必要性 DHFR 第第68頁頁/共共89頁頁 氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似 物。物。 能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻 斷斷dATP、dCTP和和dTTP的合成：的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 第第69頁頁/共共89頁頁 胸苷酸激酶的補救作用 TK+ +細胞細胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用 培養(yǎng)基中的胸苷（培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成）合成dTTP，存活。，存活。 T tk 次黃嘌呤次黃嘌呤

28、的補救作用的補救作用 細胞可以利用次黃嘌呤合成細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和和dCTP。 dUMP dATP dTTP dCTP 次黃嘌呤 補救 氨甲喋啉 抑制 抑制 第第70頁頁/共共89頁頁 HAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： Tk- - 細胞株。細胞株。 TK基因。基因。 宿主細胞 載體標(biāo)記 （2）TK選擇過程 含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。 (hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） 只有轉(zhuǎn)入只有轉(zhuǎn)入TK基因的細胞才能生存?；虻募毎拍苌妗?第第71頁頁/共共89頁頁 第第72頁頁/共共89頁頁 真核細胞核苷酸的合成需要真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸

29、四氫葉酸提提 供甲基。供甲基。 2. 二氫葉酸還原酶基因（DHFR） （1） 選擇原理 二氫葉酸還原酶的必要性二氫葉酸還原酶的必要性 dUMPdATPTTP dCTP 四氫葉酸 四氫葉酸 第第73頁頁/共共89頁頁 DHFR+細胞 二氫葉酸二氫葉酸 四氫葉酸四氫葉酸 二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶 二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸 DHFR+細胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以 能合成四氫葉酸。 能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存 不需要補救！不需要補救！ 第第74頁頁/共共89頁頁 DHFR- 細胞 DHFR- - 細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所 以不能合成四氫葉酸。以不

30、能合成四氫葉酸。 需要補救！需要補救！ 不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。 第第75頁頁/共共89頁頁 胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救 dUMPdATPTTP dATP 次黃嘌呤次黃嘌呤 補救補救 胸苷胸苷 補救補救 無四氫葉酸提供甲基，無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻時，時， 胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救: 第第76頁頁/共共89頁頁 DHFR- -細胞株（不能在細胞株（不能在無核苷酸無核苷酸的培的培 養(yǎng)基中生長）。養(yǎng)基中生長）。 宿主細胞 （2）選擇過程 透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以 免補救。免補救。 無核苷酸的培養(yǎng)基無核苷酸的培養(yǎng)基 需要需要

31、胸腺嘧啶和次黃嘌呤胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救！補救！ 第第77頁頁/共共89頁頁 氨甲喋呤氨甲喋呤“加壓加壓” 添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的 補救作用，可提高選擇。 DHFR+ +基因?；?。 載體標(biāo)記 只有轉(zhuǎn)入只有轉(zhuǎn)入DHFR+ +基因的細胞才能生存?；虻募毎拍苌?。 DHFR- DHFR-DHFR+ +DHFR+live die 無核苷酸的培養(yǎng)基 第第78頁頁/共共89頁頁 是細菌抗生素，干擾細菌的核糖體， 使細菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進行， 但不影響真核生物。 3. 新霉素抗性基因（neor） （1）選擇原理 新霉素（neomycin） 新霉素的類似物，是一種 氨基糖苷， 對真核細

32、胞和原核細胞都有毒性。 G418（geneticin） 第第79頁頁/共共89頁頁 新霉素抗性基因-neor 細菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種 磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），能使G418失活。 G418 真核細胞死亡死亡 G418 存活存活 neor 真核細胞 第第80頁頁/共共89頁頁 含含致死劑量致死劑量G418的完全培養(yǎng)基。的完全培養(yǎng)基。 G418培養(yǎng)基培養(yǎng)基 真核細胞株均可。真核細胞株均可。 neor基因?；颉?宿主細胞 載體標(biāo)記 （2）選擇過程 G418：（100-800g/mL） 第第81頁頁/共共89頁頁 CAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的，催化編碼的，催化

33、氯氯 霉素發(fā)生乙?；顾匕l(fā)生乙?；Щ?。失活。 氯霉素氯霉素 cat 含氯霉素的完全培養(yǎng)基。含氯霉素的完全培養(yǎng)基。 真核細胞株均可。真核細胞株均可。 cat基因?；?。 乙酰氯霉素 4. 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT） （1）選擇原理 （2） 選擇條件 （3） 宿主細胞 （4）載體標(biāo)記 chloramphenicol acetyl transferase 第第82頁頁/共共89頁頁 在轉(zhuǎn)化的細胞提取物中測定是否有在轉(zhuǎn)化的細胞提取物中測定是否有 乙酰氯霉素。乙酰氯霉素。 （5） CAT分析方法 免疫學(xué)檢查：免疫學(xué)檢查： 用抗用抗CAT的血清進行的血清進行Western blot或或 ELISA，檢查

34、，檢查CAT的表達。的表達。 Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. 分析乙酰氯霉素分析乙酰氯霉素 第第83頁頁/共共89頁頁 二、植物轉(zhuǎn)化體報道基因篩選法 （1 1）大腸桿菌的大腸桿菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）；）； （2 2）細菌

35、和螢火蟲的熒光素酶細菌和螢火蟲的熒光素酶 （luciferase）；）； （3 3）水母綠色熒光蛋白（水母綠色熒光蛋白（GFP）基因）基因 （Green Fluorescent Protein）。）。 1. 報道基因（報道基因（reporter gene) （4 4）其它）其它 第第84頁頁/共共89頁頁 2. 幾種報道基因的作用原理 4-甲甲-D-葡糖醛酸葡糖醛酸 熒光產(chǎn)物熒光產(chǎn)物 -D-葡萄糖醛葡萄糖醛 酸糖苷酶酸糖苷酶 GUS 水母綠色熒水母綠色熒 光蛋白光蛋白GFP 紫外光照紫外光照 發(fā)綠色熒光發(fā)綠色熒光 5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡糖醛酸葡糖醛酸 藍色水解產(chǎn)物藍色水解產(chǎn)物 -D-葡萄糖醛酸糖葡萄糖醛酸糖 苷酶苷酶 GUS 第第85頁頁/共共89頁頁 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 第第86頁頁/共共89頁頁 轉(zhuǎn)入螢火蟲 的luciferase 的煙草 第第87頁頁/共共89頁頁 第第88頁頁/共共89頁頁 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 第第89頁頁/共共8