細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程課件

1、細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程1 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程 第一節(jié) DNA的重組和重組DNA技術(shù) 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 第三節(jié) 轉(zhuǎn)座因子 第四節(jié) 文庫(kù)構(gòu)建與酵母雙雜 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程2 第一節(jié) DNA的重組和重組DNA技術(shù) 一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 二、重組DNA技術(shù)的主要內(nèi)容或步驟 三、重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 1 1PCRPCR 2 2核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳(Agarose Polyacrylamide)(Agarose Polyacrylamide) 3 3核酸的分子雜交技術(shù)核酸的分子雜交技術(shù) 4 4基因的定點(diǎn)誘變（基因的定點(diǎn)誘變（site-directed m

2、utagenesissite-directed mutagenesis） 5. 5. 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” 6 6DNADNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針” 7 7基因的載體基因的載體“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車” 8 8細(xì)菌的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程3 Section 1 DNA recombination DNADNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生的分子內(nèi)或分子間發(fā)生的 遺傳信息遺傳信息的的重重新共價(jià)新共價(jià)組組合過(guò)合過(guò) 程。程。 包括包括同源重組、特異位點(diǎn)重同源重組、特異位點(diǎn)重 組和轉(zhuǎn)座重組組和轉(zhuǎn)座重組等類型，廣泛等類型，廣泛 存在于各類生物。存在于各類

3、生物。 體外體外通過(guò)人工通過(guò)人工DNADNA重組重組可獲可獲 得重組體得重組體DNADNA，是基因工程，是基因工程 中的關(guān)鍵步驟。中的關(guān)鍵步驟。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程4 Section 1 Recombination DNA technical namename Gene Splicing / / DNA recombinationrecombination operating environment In vitro （細(xì)胞體外）（細(xì)胞體外） Manipulate objects genegene Operational level Molecular DNA Basic processBa

4、sic process剪切剪切拼接拼接導(dǎo)入導(dǎo)入表達(dá)表達(dá) 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程5 一、 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 4040年代確定了年代確定了遺傳信息的攜帶者遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是，即基因的分子載體是 DNADNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； 5050年代提示了年代提示了DNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī) 制制, ,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題； 5050年代末至年代末至6060年代，相繼提出了年代，相繼提出了 中心法則中心法則 和操縱

5、子學(xué)說(shuō)和操縱子學(xué)說(shuō), , 成功地破譯了成功地破譯了遺傳密碼遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表 達(dá)。達(dá)。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程6 年份 事 件 1869 F Miescher1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNADNA。 1944 O.T. Avery1944 O.T. Avery證實(shí)證實(shí)DNADNA是遺傳物質(zhì)是遺傳物質(zhì)。 1952 A.D. Hershey1952 A.D. Hershey和和M.ChaseM.Chase再次證實(shí)再次證實(shí)噬菌體的遺傳物質(zhì)是噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNADNA。 1953 J.D.Wat

6、son1953 J.D.Watson和和F.H.C.CrickF.H.C.Crick提出提出DNADNA分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型雙螺旋模型。 M.WilkinsM.Wilkins用用X-X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。 1957 A.Kornberg1957 A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNADNA聚合酶聚合酶I I。 1958 M. Meselson1958 M. Meselson和和F. W. StahlF. W. Stahl提出了提出了DNADNA的的半保留復(fù)制模型半保留復(fù)制模型。 1959-1960 S. Ochoa1959-1

7、960 S. Ochoa發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)RNARNA聚合酶和信使聚合酶和信使RNARNA，并證明，并證明mRNAmRNA決定了蛋決定了蛋 白質(zhì)分子中的氨基酸序列。白質(zhì)分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg1961 Nirenberg破譯了破譯了第一相遺傳密碼第一相遺傳密碼；F. JacobF. Jacob和和J. MonodJ. Monod提出了提出了 調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型操縱子模型。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程7 年份 事 件 1964 C. Yanofsky1964 C. Yanofsky和和S. BrennerS. Brenner等人證明，多肽鏈上的等人證明，多肽鏈上的氨

8、基酸序列與氨基酸序列與該該 基因中的基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。 1965 S. W. Holley1965 S. W. Holley完成了完成了酵母丙氨酸酵母丙氨酸t(yī)RNAtRNA的全序列測(cè)定的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明；科學(xué)家證明 細(xì)菌的抗藥性通常由細(xì)菌的抗藥性通常由 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA所決定。所決定。 1966 M.W.Nirenberg1966 M.W.Nirenberg，S.OchoaS.Ochoa、H.G.KhoranaH.G.Khorana、F.H.C.CrickF.H.C.Crick等人等人破譯破譯 了全部遺傳密碼了全部遺傳密碼。 1970 H.

9、O.Smith1970 H.O.Smith，K.W.WilcoxK.W.Wilcox和和T.J.KelleyT.J.Kelley分離了分離了第一種限制性核酸內(nèi)第一種限制性核酸內(nèi) 切酶切酶。H.M.TeminH.M.Temin和和D.BaltimoreD.Baltimore從從RNARNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶。 1972-1973 H.Boyer1972-1973 H.Boyer，P.BergP.Berg等人發(fā)展了等人發(fā)展了DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)，于，于7272年獲得第一年獲得第一 個(gè)重組個(gè)重組DNADNA分子，分子，7373年完成第一例年完成第一例細(xì)菌基因克隆細(xì)菌

10、基因克隆。 1975-1977 F.Sanger1975-1977 F.Sanger與與A.MaxamA.Maxam、W.GilbertW.Gilbert等人發(fā)明了等人發(fā)明了DNADNA序列測(cè)定序列測(cè)定技技 術(shù)。術(shù)。19771977年完成了全長(zhǎng)年完成了全長(zhǎng)5387bp5387bp的的噬菌體噬菌體174174基因組測(cè)定基因組測(cè)定。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程8 年份 事 件 1978 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成人工合成基因表達(dá)的基因表達(dá)的人腦激素和人腦激素和 人胰島素。人胰島素。 1980 1980 美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定

11、微生物基因工程可以專利化。 1981 R. D. Palmiter1981 R. D. Palmiter和和R. L. BrinsterR. L. Brinster獲得獲得轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. A. C. SpradlingSpradling和和G. M. RubinG. M. Rubin得到得到轉(zhuǎn)基因果蠅轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982 1982 美、英批準(zhǔn)使用美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物第一例基因工程藥物-胰島素；胰島素；SangerSanger等等 人完成了人完成了入噬菌體入噬菌體48,502bp48,502bp全序列測(cè)定全序列測(cè)定。 1983 1983 獲得第一例獲得第一例轉(zhuǎn)基因

12、植物轉(zhuǎn)基因植物。 1984 1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組重組DNADNA的專利的專利。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程9 年份 事 件 1986 1986 GMOGMO首次在環(huán)境中首次在環(huán)境中釋放釋放。 1988 J. D. Watson1988 J. D. Watson出任出任 人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃 首席科學(xué)家。首席科學(xué)家。 1992 1992 歐共體歐共體3535個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定酵母第三染色體全序列測(cè)定 (315kb) (315kb) 1994 1994 第一批基因工程第一批基因工程西紅柿西紅柿在美國(guó)上市。在美國(guó)上市。 1996

13、1996 完成了完成了酵母基因組酵母基因組(1.25(1.25107bp)107bp)全序列測(cè)定全序列測(cè)定。 1997 1997 英國(guó)愛丁堡羅斯林研究所獲得英國(guó)愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊克隆羊。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程10 二、重組DNA技術(shù)的主要內(nèi)容或步驟 1. 1. 從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNADNA片段片段。 2. 2. 將帶有目的基因的外源將帶有目的基因的外源DNADNA片段片段連接連接到能夠自我復(fù)制的并具到能夠自我復(fù)制的并具 有選擇記號(hào)的載體分子上，形成有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組重組DNADNA分子分子。 3. 3.

14、 將重組將重組DNADNA分子分子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞）并到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞）并 與之一起增殖。與之一起增殖。 4. 4. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選篩選出獲得了重組出獲得了重組DNADNA分子的受分子的受 體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。 5. 5. 將目的基因克隆到將目的基因克隆到表達(dá)表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的 遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程11 細(xì)菌遺傳學(xué)與

15、基因工程12 三、重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 1 1 PCRPCR 穆里斯等人于穆里斯等人于19881988年發(fā)明的，年發(fā)明的，19931993年獲得了諾年獲得了諾 貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在生物體外復(fù)制特定貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在生物體外復(fù)制特定DNADNA片段的片段的 核酸合成技術(shù)。核酸合成技術(shù)。 目的：目的：獲取大量的目的基因。獲取大量的目的基因。 原理：原理：DNADNA復(fù)制。復(fù)制。 條件：條件：已知目的基因的核苷酸序列即模板已知目的基因的核苷酸序列即模板DNADNA、 RNARNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNADNA聚合聚合 酶（酶（TaqTaq酶）、離子。酶）、離子。

16、方法：方法：DNADNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNARNA引引 物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、DNADNA聚合酶作用聚合酶作用 下延伸合成互補(bǔ)鏈。下延伸合成互補(bǔ)鏈。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：指數(shù)擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增=2n=2n（n n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)） 過(guò)程：過(guò)程：變性、退火、延伸、重復(fù)四個(gè)過(guò)程。變性、退火、延伸、重復(fù)四個(gè)過(guò)程。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程13 重組DNA技術(shù)的 主要技術(shù)原理 1 1 PCRPCR 步驟名稱步驟名稱需要的溫度需要的溫度過(guò)程過(guò)程 第一步第一步 變性變性 90909595將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的將反應(yīng)體系（

17、包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNADNA聚合酶、四種聚合酶、四種 脫氧核苷酸以及酶促反應(yīng)所需要的離子等）加熱至脫氧核苷酸以及酶促反應(yīng)所需要的離子等）加熱至90909595， 使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNADNA，作為，作為 互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。 第二步第二步 復(fù)性復(fù)性 55556060將反應(yīng)體系降溫至將反應(yīng)體系降溫至55556060，使兩種引物分別與模板，使兩種引物分別與模板DNADNA鏈鏈3 3 端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì)，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性。端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì)，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性。 第三步第三步 延伸合成延

18、伸合成 70707575將反應(yīng)體系升溫至將反應(yīng)體系升溫至70707575，在耐高溫的，在耐高溫的DNADNA聚合酶的催化作用聚合酶的催化作用 下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的3 3-OH-OH上，上， 使使DNADNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNADNA鏈。鏈。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程14 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 2 2 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳(Agarose (Agarose Polyacrylamide)Polyacrylamide) 電泳的速率電泳的速率，與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子，與電

19、場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子 所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦 系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度 系數(shù)等）。系數(shù)等）。 電泳的方向：電泳的方向：DNADNA和和RNARNA呈多聚陰離子狀態(tài)呈多聚陰離子狀態(tài) （PolyanionsPolyanions）。將）。將DNADNA、RNARNA放到電場(chǎng)中，放到電場(chǎng)中， 它就會(huì)由負(fù)極它就會(huì)由負(fù)極正極移動(dòng)。正極移動(dòng)。 染色：染色：ethidium bromideethidium bromide染色，核酸分子在染色，核酸分子在 紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約紫外光下發(fā)出熒光，肉

20、眼能看到約50ng DNA50ng DNA 所形成的條帶。所形成的條帶。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程15 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程16 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 3 3核酸的分子雜交技術(shù)核酸的分子雜交技術(shù) 核酸印跡核酸印跡(nucleic acid blotting)(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 移移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜 上，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)上，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn) 和狹線印跡法和狹線印跡法(dot and slot (dot and slot blotting)blotting)、菌落和噬菌斑印跡法、菌落和噬

21、菌斑印跡法 (colony and plaque blotting)(colony and plaque blotting)； 核酸雜交核酸雜交/ /印跡雜交：印跡雜交：將具有核酸印跡將具有核酸印跡 的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的 DNADNA或或RNARNA探針進(jìn)行雜交。探針進(jìn)行雜交。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程17 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程18 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 4 4基因的定點(diǎn)誘變（基因的定點(diǎn)誘變（site-directed mutagenesissite-directed mutagenesis） 基因或基因或DNADNA片段中的任何一個(gè)特定堿基

22、發(fā)生取代、插入或缺片段中的任何一個(gè)特定堿基發(fā)生取代、插入或缺 失變化的過(guò)程失變化的過(guò)程 a. a. 盒式誘變盒式誘變(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis) b b寡核苷酸引物誘變寡核苷酸引物誘變 c c PCRG PCRG與與PCRPCR誘變誘變 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程19 5 5限制性酶切限制性酶切-“-“分子手分子手 術(shù)刀術(shù)刀” restrictionendonuclease:restrictionendonuclease: 在特殊核甘酸序列處水解雙在特殊核甘酸序列處水解雙 鏈鏈DNADNA的內(nèi)切酶。的內(nèi)切酶。型：既能型：既能 催化宿主催化宿

23、主DNADNA的甲基化，又催的甲基化，又催 化非甲基化的化非甲基化的DNADNA的水解；的水解； 型：只催化非甲基化的型：只催化非甲基化的DNADNA的的 水解。水解。 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 4.36kp 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程20 5. 5. 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” 主要來(lái)源：主要來(lái)源：原核生物（原核生物（300300種原核生物中分種原核生物中分 離出了約離出了約40004000種限制酶種限制酶 ） 特點(diǎn)：特點(diǎn)：具有專一性具有專一性 作用：作用：斷裂特定部位兩個(gè)核苷酸之間的磷酸斷裂特定部位兩個(gè)核苷酸之間的磷酸 二酯鍵。二酯鍵。 產(chǎn)物：產(chǎn)物：用限制性核酸

24、內(nèi)切酶切割形成的末端用限制性核酸內(nèi)切酶切割形成的末端 有兩種：即黏性末端和平末端。有兩種：即黏性末端和平末端。 黏性末端：黏性末端：是限制酶在識(shí)別序列的中心軸是限制酶在識(shí)別序列的中心軸 線兩側(cè)將線兩側(cè)將DNADNA的兩條鏈分別切開形成的。的兩條鏈分別切開形成的。 平末端：平末端：是限制酶在識(shí)別序列的中心軸線是限制酶在識(shí)別序列的中心軸線 處切開形成的。處切開形成的。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程21 題. 下列關(guān)于基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是 A. 一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列 B. 限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度影響 C. 限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別和切割RNA D.

25、限制性核酸內(nèi)切酶可以從原核生物中提取 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程22 6 6DNADNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針” 作用：作用：恢復(fù)被限制酶切開了的兩恢復(fù)被限制酶切開了的兩 個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 種類種類 E.coli DNAE.coli DNA連接酶：連接酶：只能縫合雙只能縫合雙 鏈鏈DNADNA片段互補(bǔ)的片段互補(bǔ)的黏性末端黏性末端，而，而 不能將雙鏈不能將雙鏈DNADNA平末端進(jìn)行連接。平末端進(jìn)行連接。 T4 DNAT4 DNA連接酶：連接酶：既可縫合既可縫合DNADNA片片 段互補(bǔ)的段互補(bǔ)的黏性末端黏性末端，又可縫合雙，又可縫合雙 鏈鏈DNAD

26、NA片段的片段的平末端平末端。但連接平。但連接平 末端之間的效率比較低。末端之間的效率比較低。 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程23 6 6DNADNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針” DNADNA連接酶和連接酶和DNADNA聚合酶的比較聚合酶的比較: : DNADNA連接酶連接酶DNADNA聚合酶聚合酶 連接連接DNADNA鏈鏈 雙鏈雙鏈單鏈單鏈 連接部位連接部位 在兩在兩DNADNA片段之間形成片段之間形成 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸片段將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸片段 的的33端的羥基上，形成磷酸二酯端的羥基上，形成磷酸二酯 鍵鍵 重組DNA

27、技術(shù)的主要技術(shù)原理 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程24 7 7基因的載體基因的載體“分子分子 運(yùn)輸車運(yùn)輸車” 作用：作用：是基因運(yùn)輸?shù)墓ぞ呤腔蜻\(yùn)輸?shù)墓ぞ? :一是一是 用它作為運(yùn)載工具，將目的基因用它作為運(yùn)載工具，將目的基因 送到宿主細(xì)胞中去；二是利用它送到宿主細(xì)胞中去；二是利用它 在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大 量復(fù)制。量復(fù)制。 條件條件 能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制；能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制； 有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外 源基因連接；源基因連接； 具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。 重組DNA

28、技術(shù)的主要技術(shù)原理 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程25 7 7基因的載體基因的載體“分子分子 運(yùn)輸車運(yùn)輸車” 種類種類： 目前，基因工程經(jīng)常使用的載目前，基因工程經(jīng)常使用的載 體主要有以下幾類：體主要有以下幾類： 細(xì)菌的質(zhì)粒：最常用的載體。細(xì)菌的質(zhì)粒：最常用的載體。 噬菌體噬菌體 動(dòng)植物病毒動(dòng)植物病毒 它們來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、它們來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、 復(fù)制以及插入片段大小上也有復(fù)制以及插入片段大小上也有 很大差別很大差別 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程26 8 8細(xì)菌的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 一細(xì)菌菌株捕獲另一細(xì)菌一細(xì)菌菌株捕獲另一細(xì)菌 菌株的菌株的DNADNA，導(dǎo)致性狀特征，導(dǎo)致性

29、狀特征 發(fā)生遺傳改變發(fā)生遺傳改變 供體菌株供體菌株 受體菌株受體菌株 大腸桿菌是最廣泛使用的大腸桿菌是最廣泛使用的 實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)菌株 CaClCaCl2 2處理大腸桿菌細(xì)胞，處理大腸桿菌細(xì)胞， 使之呈感受態(tài)（使之呈感受態(tài)（Competent Competent CellsCells） 每每g DNAg DNA可得可得10107 7-10-108 8個(gè)轉(zhuǎn)個(gè)轉(zhuǎn) 化子化子 重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程27 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程28 小結(jié) 1、限制性內(nèi)切酶 ：來(lái)源、功能、作用特點(diǎn) 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程29 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 （一）第一步（一）第一步目的基因的獲取

30、目的基因的獲取 1. 1. 目的基因目的基因 2. 2. 獲取目的基因的方法獲取目的基因的方法 （1 1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因）從基因文庫(kù)中獲取目的基因 基因文庫(kù)基因文庫(kù)：將含有某種生物不同基因的許多：將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段片段，導(dǎo)入受體菌的群體中，導(dǎo)入受體菌的群體中 儲(chǔ)存儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。 目的基因的獲取目的基因的獲取 根據(jù)基因的有關(guān)信息：基因的根據(jù)基因的有關(guān)信息：基因的脫氧核苷酸脫氧核苷酸序列、基因在序列、基因在染色體染色體上的位置、基上的位置、基 因的因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)

31、物mRNAmRNA、基因的、基因的翻譯翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性獲取目的基因。產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性獲取目的基因。 優(yōu)點(diǎn)：有了基因文庫(kù)，就可隨時(shí)從中提取所需要的目的基因，引入受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：有了基因文庫(kù)，就可隨時(shí)從中提取所需要的目的基因，引入受體細(xì)胞 使之表達(dá)。使之表達(dá)。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程30 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 （一）第一步（一）第一步目的基因的獲取目的基因的獲取 1. 1. 目的基因目的基因 2. 2. 獲取目的基因的方法獲取目的基因的方法 （2 2）人工合成法：人工合成法：如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通 過(guò)過(guò)DNADNA合成儀用

32、化學(xué)方法人工合成。合成儀用化學(xué)方法人工合成。 反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNARNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的 單鏈單鏈DNADNA，然后在酶的作用下合成雙鏈，然后在酶的作用下合成雙鏈DNADNA，從而獲得所需要的基因。，從而獲得所需要的基因。 人工合成：人工合成：蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNAmRNA序列序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸結(jié)構(gòu)基因的核苷酸 序列序列 通過(guò)化學(xué)方法合成目的基因。通過(guò)化學(xué)方法合成目的基因。如人的血紅蛋白基因、胰島素基因。如人的血紅蛋白基因、胰島素基因。 （3 3）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。技

33、術(shù)擴(kuò)增目的基因。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程31 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 （二）第二步（二）第二步-基因表達(dá)載基因表達(dá)載 體的構(gòu)建體的構(gòu)建 1. 1. 目的：目的：使目的基因能夠使目的基因能夠 表達(dá)和發(fā)揮作用。表達(dá)和發(fā)揮作用。 2. 2. 表達(dá)載體的組成：表達(dá)載體的組成： 啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子： 終止子：終止子： 標(biāo)記基因：標(biāo)記基因： 基因表達(dá)載體模式圖 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程32 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 （二）第二步（二）第二步-基因表基因表 達(dá)載體的構(gòu)建達(dá)載體的構(gòu)建 3 3、構(gòu)建步驟、構(gòu)建步驟 酶切質(zhì)粒酶切質(zhì)粒 用同種限制酶切割目用同種限制酶切割目 的基因的基因 適量的適量的DN

34、ADNA連接酶，連接酶， 結(jié)合成重組質(zhì)粒。結(jié)合成重組質(zhì)粒。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程33 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 （三）將目的基因?qū)胧埽ㄈ⒛康幕驅(qū)胧?體細(xì)胞體細(xì)胞 1 1、轉(zhuǎn)化：、轉(zhuǎn)化： 2 2、方法：受體種類不同，導(dǎo)入的、方法：受體種類不同，導(dǎo)入的 方法不同。方法不同。 （1 1）導(dǎo)入植物細(xì)胞）導(dǎo)入植物細(xì)胞 、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 、基因槍法（又稱微彈轟擊法）、基因槍法（又稱微彈轟擊法） 、花粉管通道法：、花粉管通道法： （2 2）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞 方法：顯微注射方法：顯微注射 技術(shù)。技術(shù)。 （3 3）導(dǎo)入微生物細(xì)胞）導(dǎo)入微生物細(xì)胞 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程34

35、 第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序 （三）將目的基因?qū)胧埽ㄈ⒛康幕驅(qū)胧?體細(xì)胞體細(xì)胞 4 4、轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體、轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體 細(xì)胞染色體基因組中。細(xì)胞染色體基因組中。 3 3、受體生物不同，所用的受體細(xì)胞、受體生物不同，所用的受體細(xì)胞 種類也不同。種類也不同。 （1 1）植物：可以是卵細(xì)胞（受精）植物：可以是卵細(xì)胞（受精 卵）、體細(xì)胞（可經(jīng)組織培養(yǎng)成卵）、體細(xì)胞（可經(jīng)組織培養(yǎng)成 為完整個(gè)體）。為完整個(gè)體）。 （2 2）動(dòng)物：受精卵（因?yàn)轶w細(xì)胞的）動(dòng)物：受精卵（因?yàn)轶w細(xì)胞的 全能性受到限制）。全能性受到限制）。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程35 第二節(jié)重組DNA技

36、術(shù)的基本操作程序 ( (四四) )第四步第四步-目的基因的目的基因的 檢測(cè)與鑒定檢測(cè)與鑒定 1 1、導(dǎo)入檢測(cè)：、導(dǎo)入檢測(cè)： 2 2、表達(dá)檢測(cè)、表達(dá)檢測(cè) （1 1）轉(zhuǎn)錄檢測(cè)）轉(zhuǎn)錄檢測(cè):DNA:DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) （2 2）翻譯檢測(cè)）翻譯檢測(cè): :抗原抗原抗體雜交（免疫）抗體雜交（免疫） 法法 3. 3. 鑒定：鑒定：個(gè)體生物學(xué)水平個(gè)體生物學(xué)水平鑒定鑒定 原位菌落（或噬菌斑）雜交原位菌落（或噬菌斑）雜交 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程36 題：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性， 只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定才能知道。下列是對(duì)基因工程有關(guān)檢測(cè)結(jié)果 的分析，正確的是 A. 只要檢測(cè)到受

37、體細(xì)胞中含有標(biāo)記基因，則表明目的基因?qū)肓耸荏w 細(xì)胞 B. 只要檢測(cè)到受體細(xì)胞含有目的基因，則表明基因工程的任務(wù)完成了 C. 只要檢測(cè)到受體細(xì)胞中含有目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，則表明基因 工程的目標(biāo)實(shí)現(xiàn)了 D. 只要檢測(cè)到受體細(xì)胞中含有所需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，則表明目的基 因完成了表達(dá)過(guò)程 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程37 第三節(jié) 轉(zhuǎn)座因子 （transposable element） 定義： 可移動(dòng)位置的遺傳因子的 總稱。 又叫可移動(dòng)因子，它是指 一段特定的DNA序列，可 從原來(lái)的位置上單獨(dú)復(fù)制 或自動(dòng)脫落下來(lái)，經(jīng)環(huán)化 后再插入到染色體其他位 置，并對(duì)插入位點(diǎn)附近的 基因產(chǎn)生各種遺傳學(xué)效應(yīng)。 細(xì)菌遺傳學(xué)

38、與基因工程38 第三節(jié) 轉(zhuǎn)座因子（transposable element） 發(fā)現(xiàn)歷史發(fā)現(xiàn)歷史 Barbara McClintockBarbara McClintock，1902-19921902-1992）是）是2020世紀(jì)具有傳奇般經(jīng)世紀(jì)具有傳奇般經(jīng) 歷的女科學(xué)家，她在玉米中發(fā)現(xiàn)了歷的女科學(xué)家，她在玉米中發(fā)現(xiàn)了“會(huì)跳舞會(huì)跳舞”的基因。的基因。 直到直到19671967年年ShapiroShapiro才在才在E.coliE.coli中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座因子中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座因子 （transposable elementtransposable element）。）。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程39 原核生物中

39、的三類轉(zhuǎn)位因子：原核生物中的三類轉(zhuǎn)位因子： Three principle classes of TE 1. Insertion sequence1. Insertion sequence（IS,IS,插入序列）插入序列） 2. transposon Tn 2. transposon Tn （ 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子 ） 3. 3. 轉(zhuǎn)座噬菌體轉(zhuǎn)座噬菌體 存在于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒存在于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNADNA分子上的一段可移動(dòng)的遺分子上的一段可移動(dòng)的遺 傳元素（傳元素（特異性核苷酸序列片段特異性核苷酸序列片段） 細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子的類型和結(jié)構(gòu) 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程40 插入序列（insertion sequ

40、ence IS）： J最小最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)位因子，2kb2kb，除攜帶與轉(zhuǎn)位有關(guān)的序列外，還帶有某些結(jié)構(gòu)基因，除攜帶與轉(zhuǎn)位有關(guān)的序列外，還帶有某些結(jié)構(gòu)基因 因此當(dāng)因此當(dāng)TnTn插入某一基因時(shí)，可引起細(xì)菌性狀的變化。插入某一基因時(shí)，可引起細(xì)菌性狀的變化。 J轉(zhuǎn)座噬菌體：轉(zhuǎn)座噬菌體：是一些具有轉(zhuǎn)座功能的溶原性噬菌體。是一些具有轉(zhuǎn)座功能的溶原性噬菌體。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程44 Transposon A transposon is a DNA sequence able to insert itself (or a copy of itself) at a new location in the geno

41、me, without having any sequence relationship with the target locus. 轉(zhuǎn)座(transposition)：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移過(guò)程。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程45 轉(zhuǎn)座子的種類與特征轉(zhuǎn)座子的種類與特征 轉(zhuǎn)座子 攜帶耐藥或毒素基因 Tn1 Tn2 Tn3 AP（氨芐青霉素） Tn4 AP、SM（鏈霉素）、Su（磺胺） Tn5 Km（卡那霉素） Tn6 Km（卡那霉素） Tn7 TMP（甲氧芐氨嘧啶）、SM Tn9 Cm（氯霉素） Tn10 Tc（四環(huán)素） Tn551 Em（紅霉素） Tn971 Em（紅霉素） Tn1681 大腸埃希菌（腸毒素

42、基因） 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程46 第四節(jié) 文庫(kù)構(gòu)建與酵母雙雜 分析基因分析基因/ /蛋白互作的主要方法：蛋白互作的主要方法： （1 1）構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA、DNADNA文庫(kù)文庫(kù)，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因；，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因； （2 2）差式）差式雜交雜交(differential screen)(differential screen)和扣除雜交和扣除雜交(subtractive (subtractive hybridization)hybridization)技術(shù)；技術(shù)； （3 3）DD-RT-PCRDD-RT-PCR法及法及差別顯示差別顯示技術(shù)；技術(shù)； （4

43、4）差別分析法差別分析法 (Representational difference analysis, RDA(Representational difference analysis, RDA）；）； （5 5）酵母雙雜交酵母雙雜交Two-hybrid systemTwo-hybrid system； （6 6）圖位克隆法圖位克隆法（map-based cloningmap-based cloning）與）與染色體步移染色體步移 （genomic DNA genomic DNA WalkingWalking）。）。 細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程47 基因組文庫(kù)的構(gòu)建 genomic library genomic library ：整個(gè)基因組整個(gè)基因組DNADNA切成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，連接在切成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，連接在 載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而構(gòu)建的克隆總體。載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而構(gòu)建的克隆總體。 應(yīng)用應(yīng)用 噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的程序：噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的程序： 消化，約消化，約20kb20kb； 切割載體；切割載體； 除去除去 噬菌體裂解生長(zhǎng)非必需的內(nèi)部片段；噬菌體裂解生長(zhǎng)非必需的內(nèi)部片段； 連接；連接； 體外包裝系統(tǒng)進(jìn)行噬菌體的組裝；體外包裝系統(tǒng)進(jìn)行噬菌體的組裝； 重組噬菌體侵染重組噬菌體侵染E. c