循環(huán)腫瘤細胞CTC檢測在肺癌中的實際應(yīng)用

1、 腫瘤疾病近期療效的判斷方法腫瘤疾病近期療效的判斷方法 臨床因子作為預(yù)后與預(yù)測因子 預(yù)后：預(yù)后：T, N, M staging, PS score 預(yù)測：預(yù)測： 吸煙狀況：指導(dǎo)靶向治療吸煙狀況：指導(dǎo)靶向治療 性別：指導(dǎo)靶向治療性別：指導(dǎo)靶向治療 種族：指導(dǎo)靶向治療種族：指導(dǎo)靶向治療 組織學(xué)：指導(dǎo)化療和靶向治療組織學(xué)：指導(dǎo)化療和靶向治療 影像學(xué)方法影像學(xué)方法 非侵入地、直觀地對患者的腫瘤大小變化情 況進行評估。 缺點： 存在一定的健康危害或健康隱患 腫瘤大小常與腫瘤的惡性程度或浸潤能力不完全一致 費用昂貴 滯后性 靈敏性低 病理學(xué)方法病理學(xué)方法 手術(shù)或活檢獲得病灶組織/周圍淋巴結(jié)組織， 進行病理

2、學(xué)染色和分析，是目前唯一明確腫瘤 有否轉(zhuǎn)移的金標準 缺點： 精確度不夠高 是侵入性檢查手段 易造成擴散 人工誤差大 難以標準化 血清腫瘤標記物測定血清腫瘤標記物測定 血清腫瘤標志物的濃度往往可以在一定程 度上提示腫瘤的發(fā)展程度 缺點： 特異性不高 易受非特異蛋白的干擾 其他的病理生理狀態(tài)影響導(dǎo)致假陽/陰性結(jié)果 1869年 Aust Med J， Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌 癥患者血液中觀察到。 2005年 N Engl J Med， Cristofanilli證實治療前CTC 數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者 無進展生存期和總生存期 的獨立預(yù)測因子。 循環(huán)腫瘤細胞指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循

3、環(huán)的腫瘤細胞。 循環(huán)腫瘤細胞 原發(fā)腫瘤血管 生成侵潤 侵入血管內(nèi) 侵入血管外 (CTC) 血管內(nèi)增殖 (CTM) 轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移 播散腫瘤細胞 （DTC）微轉(zhuǎn) 移休眠灶 循環(huán)腫瘤細 胞（CTC） 循環(huán)腫瘤 微栓 （CTM） 凋亡的CTC 侵潤 腫瘤細胞 擴增 血管生成 上皮間質(zhì) 轉(zhuǎn)化 （EMT） 間質(zhì)上皮 轉(zhuǎn)化 （MET） 轉(zhuǎn)移到骨 髓和其他 器官 CTC檢測檢測 預(yù)測PFS及OS 指示預(yù)后效果 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測與分期 有助于腫瘤個體化治療的藥物篩選和治療方案的確定 是傳統(tǒng)的影像學(xué)及其他生物標志物的補充檢測手段 有助于尋找新的腫瘤標識物以及開發(fā)新的抗腫瘤藥物 腫瘤細胞作為生物標志物 外周血和肺靜脈血中

4、的循環(huán)腫瘤細胞（外周血和肺靜脈血中的循環(huán)腫瘤細胞（CTCs） 臨床意義臨床意義: 轉(zhuǎn)移的輔助標志物？轉(zhuǎn)移的輔助標志物？ 可以預(yù)測治療？可以預(yù)測治療？ 預(yù)后因子？預(yù)后因子？ 最小損傷的突變檢測最小損傷的突變檢測? 獲取獲取CTCCTC需要解決的技術(shù)問題需要解決的技術(shù)問題 從紅細胞和白細胞中從紅細胞和白細胞中富集富集惡性腫瘤細胞惡性腫瘤細胞 將惡性腫瘤細胞與紅細胞、白細胞、正常上將惡性腫瘤細胞與紅細胞、白細胞、正常上 皮細胞、造血干細胞等皮細胞、造血干細胞等區(qū)分區(qū)分開來開來 每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個 循環(huán)腫瘤細胞，而10mL血液中含有的白 細胞約有1億個，紅細胞有500億個。 三種技

5、術(shù)三種技術(shù) 過濾法過濾法 ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells 8m孔徑過濾膜，漏檢孔徑過濾膜，漏檢 體積較小的腫瘤細胞體積較小的腫瘤細胞 敏感性低敏感性低 梯度密度法梯度密度法 腫瘤細胞和單核細胞密腫瘤細胞和單核細胞密 度小于度小于1.077g/ml CTC純度低，混入較多白純度低，混入較多白 細胞細胞 腫瘤細胞會遷移至血漿腫瘤細胞會遷移至血漿 層，而聚集后容易下沉層，而聚集后容易下沉 聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺泛影葡胺(Ficoll- Hypaque)對細胞有毒性對細胞有毒性 免疫磁珠法免疫磁珠法 腫瘤細胞表面抗原腫瘤細胞表面抗原

6、CTC純度低，混入較多純度低，混入較多 白細胞白細胞 不能有效排除細胞碎片不能有效排除細胞碎片 假陽性和假陰性高假陽性和假陰性高 Cell Search-免疫磁珠免疫磁珠+流式細胞分析流式細胞分析+化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光 %Probability of Survival Time from Baseline (Months) 0246810121416182224262830 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 20 Logrank p 5 CTCs n=87 (49%) 5 CTCs n=90 (51%) CellSearch CellSearc

7、h 是全球第一也是唯一經(jīng)是全球第一也是唯一經(jīng)FDAFDA批準可用于批準可用于 臨床的循環(huán)腫瘤細胞（臨床的循環(huán)腫瘤細胞（CTCCTC）產(chǎn)品產(chǎn)品 1983 磁流體 J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63. Epub 2011 Mar 21.J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63. Epub 2011 Mar 21. Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-Evaluation and

8、 prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non- small-cell lung cancer.small-cell lung cancer. 肺癌是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，85%的 肺癌患者為非小細胞肺癌，大多數(shù)患者發(fā) 現(xiàn)時已是晚期，其5年生存率只有2%。 目前，仍然缺乏有效的生物標記物 預(yù)測治療的有效性。CTC是一個潛 在的療效預(yù)測因子。 驗證能否在NSCLC患者中檢測出 CTC及CTC能否預(yù)測治療有效性。 背景背景 實驗流程實驗流程 病人病人 入組入組 基線基線CTC 檢測檢測 化療一化療一

9、 個療程個療程 CTC 檢測檢測 統(tǒng)計統(tǒng)計 分析分析 患者入組標準患者入組標準 未做過化療，且4周內(nèi)未做過放療 病理學(xué)確診為非小細胞肺癌 IIIA, IIIB, IV期 準備進行標準的細胞毒療法 5年內(nèi)未患過惡性腫瘤 實驗方法實驗方法 CellSave 專用收集管采集血液 采集血后于室溫儲存并于96小 時內(nèi)進行檢測 Cellsearch 系統(tǒng)進行檢測 患者化療前患者化療前CTC數(shù)量（基線數(shù)量（基線CTC）與臨床特征的關(guān)）與臨床特征的關(guān) 系系 IV期患者期患者CTC數(shù)量明顯多于數(shù)量明顯多于IIIB期患者，期患者， IIIB期患者的期患者的CTC數(shù)量又明顯多于數(shù)量又明顯多于IIIA期患者期患者。

10、肝轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移患者中肝轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移患者中 CTC數(shù)量明顯多于其它轉(zhuǎn)數(shù)量明顯多于其它轉(zhuǎn) 移患者。移患者。 患者化療前患者化療前CTC數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移地點的關(guān)系數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移地點的關(guān)系 所有非小細胞肺癌 病人 所有期非小細胞 肺癌病人 基線基線CTCCTC數(shù)量與無進展生存期和總生存期的關(guān)系數(shù)量與無進展生存期和總生存期的關(guān)系 基線基線CTC數(shù)量少于數(shù)量少于5的患者無進展生存期和總生存期明顯高于基的患者無進展生存期和總生存期明顯高于基 線線CTC數(shù)量大于等于數(shù)量大于等于5的患者。的患者。 化療前后化療前后CTCCTC數(shù)量與患者無進展生存期和總生存期的關(guān)系數(shù)量與患者無進展生存期和總生存期的關(guān)系 化療后化療

11、后CTC數(shù)量少于數(shù)量少于5的患者無進展生存期和總生存期明顯高于的患者無進展生存期和總生存期明顯高于CTC 數(shù)量大于數(shù)量大于5的患者。的患者。 化療前后化療前后CTC數(shù)量都少于數(shù)量都少于5 的患者無進展生存期和總生存期明顯高于的患者無進展生存期和總生存期明顯高于 只有一次測出只有一次測出CTC數(shù)量少于數(shù)量少于5的患者。的患者。 化療前后化療前后CTC的數(shù)量變化反映臨床療效的數(shù)量變化反映臨床療效 化療前化療后 化療后化療后CTC數(shù)量減少患者的臨床療效好于數(shù)量減少患者的臨床療效好于CTC數(shù)量增加的患者數(shù)量增加的患者 結(jié)結(jié) 論論 CTC能在能在IV期非小細胞肺癌患者中檢出期非小細胞肺癌患者中檢出 CT

12、C數(shù)量的變化反映了臨床療效數(shù)量的變化反映了臨床療效 CTC數(shù)量與數(shù)量與OS 和和PFS相關(guān)，是非小細胞肺癌的一個相關(guān)，是非小細胞肺癌的一個 新的預(yù)后判斷因子新的預(yù)后判斷因子 CTCCTC在判斷是否存在轉(zhuǎn)移中有重要參考價值在判斷是否存在轉(zhuǎn)移中有重要參考價值 對于原發(fā)性肺癌患者，CTC計數(shù)在有遠處轉(zhuǎn)移的肺癌患 者中有顯著升高，相關(guān)性優(yōu)于CEA。 CTCCTC升高對于判斷遠處轉(zhuǎn)移的敏感性達升高對于判斷遠處轉(zhuǎn)移的敏感性達71%71%，特異性達，特異性達83%83% CTCCTC計數(shù)和血清計數(shù)和血清CEACEA水平在不同切點的診斷價值水平在不同切點的診斷價值 治療前和治療后治療前和治療后CTC的數(shù)量變化

13、反映療效的數(shù)量變化反映療效 大多數(shù)患者的大多數(shù)患者的CTCCTC數(shù)量在第一個化療療程后（數(shù)量在第一個化療療程后（2222天）下天）下 降，提示療效好。降，提示療效好。 The Annals of Thoracic Surgery Volume 87,Issue 6,June 2009, Pages 1669-1675 The Annals of Thoracic Surgery Volume 87,Issue 6,June 2009, Pages 1669-1675 Circulating Tumor Cells in Pulmonary Venous Blood of Primary Lun

14、g Cancer Patients Circulating Tumor Cells in Pulmonary Venous Blood of Primary Lung Cancer Patients 鱗癌中鱗癌中periCTC和和pvCTC的數(shù)量明顯高于腺癌的數(shù)量明顯高于腺癌 N Engl J Med 2008;359:366-77.N Engl J Med 2008;359:366-77. Detection of Mutations in EGFR in Circulating Lung-Cancer CellsDetection of Mutations in EGFR in Circu

15、lating Lung-Cancer Cells 吉非替尼是較好地治療非小細胞肺癌的靶 向藥物，但是EGFR的基因型決定了藥物 的治療效果。 目前，檢測EGFR的基因型需要選取 患者的腫瘤組織，找到一種非侵入 性的方法檢測EGFR迫在眉睫。 驗證能否在CTC中檢測EGFR的基因 型，且與藥物療效相關(guān)。 背景背景 CTC中中EGFR突變與腫瘤組織中突變與腫瘤組織中EGFR突變的一致突變的一致 性（性（SARMS方法）方法） CTC中中EGFR基因型有基因型有17個與腫瘤組織中的一樣，準確率為個與腫瘤組織中的一樣，準確率為94%， CTC數(shù)量與病情進展的關(guān)系數(shù)量與病情進展的關(guān)系 吉非替尼治療后吉非

16、替尼治療后CTC數(shù)量下降，伴隨著疾病進展數(shù)量下降，伴隨著疾病進展CTC數(shù)量也隨之上升。數(shù)量也隨之上升。 腫瘤大的患者腫瘤大的患者CTC數(shù)量比腫瘤小的患者多。數(shù)量比腫瘤小的患者多。 CTC數(shù)量 影像學(xué)腫瘤 變化 檢測檢測CTC中中EGFR的基因型與組織中檢測結(jié)果高度符合的基因型與組織中檢測結(jié)果高度符合 可以通過可以通過CTC來檢測非小細胞肺癌患者腫瘤的基因型來檢測非小細胞肺癌患者腫瘤的基因型 CTC數(shù)量與疾病進展密切相關(guān)數(shù)量與疾病進展密切相關(guān) 結(jié)結(jié) 論論 小細胞肺癌患者活檢組織及相對應(yīng)的CTC中的CD56 活檢組織中的活檢組織中的CD56和和CTC中的中的CD56表達具有一致性表達具有一致性 肺

17、癌組織 肺癌肝轉(zhuǎn)移組織 Baseline blood CAC 腫瘤細胞 a, monosomy 6p11-q12; b, amplification EGFR, c- MYC; EGFR (red) 5.p15.3 (green), 6p11-q12 (aqua), c-MYC (yellow). c, trisomy CEP3 and monosomy CEP17; d, polysomy CEP3, CEP7, CEP17 and 9p21.3. CEP3 (red), CEP7 (green), CEP17 (aqua), 9p21.3 (yellow). 外周循環(huán)腫瘤細胞的異常情況與手

18、術(shù)切除的腫瘤細胞具有高度一致性。外周循環(huán)腫瘤細胞的異常情況與手術(shù)切除的腫瘤細胞具有高度一致性。 Baseline blood CTC 腫瘤細胞 CTC中的染色體異常分子標記物與疾病的復(fù)發(fā)和生存密切相關(guān)中的染色體異常分子標記物與疾病的復(fù)發(fā)和生存密切相關(guān) CTCCTC計數(shù)計數(shù)CTCCTC的分子特性的分子特性 n指示預(yù)后 n輔助檢測抗癌藥物的反應(yīng)作為 預(yù)測和/或藥物動力學(xué)生物標志物 n聯(lián)合已知的分期因素，獲取更精確 的預(yù)后 n判斷病人是否需要輔助化療 n檢測癌癥復(fù)發(fā) n輔助診斷 n實時活檢腫瘤的生物學(xué)行為 n闡明預(yù)后和預(yù)計的分子學(xué)特征 n檢測抗藥情況基于獲得連續(xù) 樣本的便利性 n提高對生物過程機制的了解 n發(fā)現(xiàn)并鑒定新治療靶點 CTCCTC的應(yīng)用：從細胞計數(shù)到分子特性的應(yīng)用：從細胞計數(shù)到分子特性 FISHFISH分析分析CTCCTC生物學(xué)特性生物學(xué)特性 白細胞有兩份CEP7（綠色），EGFR（紅色）和MET