DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享)

1、DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 作者：作者：Dr.FengDr.Feng DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件 ）(課件分享) DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 實驗目的實驗目的 掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的原理和方法。的原理和方法。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 實驗原理實驗原理 DNA分子在瓊脂糖中泳動時有電荷效應和分子篩效應，但主分子在瓊脂糖中泳動時有電荷效應和分子篩效應，但主 要為要為分子篩效應分子篩效應。 在在 pH 值為值為 8.08.3 時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸

2、全部 解離，核酸分子帶解離，核酸分子帶負電負電，在電泳時，在電泳時向正極移動向正極移動。 采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩分子篩的作用下，的作用下， 使使分子大小和構象不同的核酸分子分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從泳動率出現(xiàn)較大的差異，從 而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。 核酸分子中嵌入核酸分子中嵌入熒光染料（如熒光染料（如 EB ）后，在紫外燈下可觀察到后，在紫外燈下可觀察到 核酸片段所在的位置。核酸片段所在的位置。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 實驗器材和試

3、劑實驗器材和試劑 實驗器材實驗器材： 橋是平板電泳槽、電泳儀、微波爐、紫外透射儀橋是平板電泳槽、電泳儀、微波爐、紫外透射儀 樣品樣品： DNA分子量標準品，質粒分子量標準品，質粒 試劑試劑 瓊脂糖瓊脂糖 1電泳緩沖液（電泳緩沖液（TBE） 6上樣緩沖液上樣緩沖液 溴化乙錠溴化乙錠(EB) ：10mg/ml DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 上樣緩沖液 0.25溴酚蘭；溴酚蘭；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘油水溶液甘油水溶液 作用：作用： 增加樣品密度增加樣品密度，使其比重增加，以確保，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加均勻沉入加 樣孔內樣孔內 在電泳中形成肉眼可見的指在電

4、泳中形成肉眼可見的指 示帶，可示帶，可預測核酸電泳的速度和位置預測核酸電泳的速度和位置 使樣品呈色使樣品呈色，使加樣操作更方便，使加樣操作更方便 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 天然瓊脂（天然瓊脂（agar）:又名瓊膠、菜燕、凍粉又名瓊膠、菜燕、凍粉 從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。從石花菜及其它紅藻類植物提取出來的一種線狀高聚物。 瓊脂糖（瓊脂糖（agaroseagarose） 瓊脂膠（瓊脂膠（agaropectinagaropectin）: :含硫酸根和羧基的強酸性多糖，含硫酸根和羧基的強酸性多糖，在電場在電場 作用下能產生較強的電滲現(xiàn)象。作用下能產生較

5、強的電滲現(xiàn)象。 瓊脂瓊脂 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定分離鑒定和和純化純化DNA片段片段的標準方法。的標準方法。 該技術操作該技術操作簡便快速簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心 法）所無法分離的法）所無法分離的DNA片段。片段。 當用低濃度的熒光嵌入染料當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) 染色染色,在紫外光下至少可以檢出在紫外光下至少可以檢出1-10ng的的DNA條帶條帶,從而可以確從而可以確 定定DNA片段

6、在凝膠中的位置。片段在凝膠中的位置。 此外此外,還可以從電泳后的凝膠中還可以從電泳后的凝膠中回收特定的回收特定的DNA條帶條帶,用于以后用于以后 的克隆操作。的克隆操作。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 電泳指示劑：電泳指示劑： 核酸電泳常用的指示劑有兩種核酸電泳常用的指示劑有兩種 溴酚藍溴酚藍（ bromophenol blue, Bb ）；）； 二甲苯青二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它攜帶的電荷量比），它攜帶的電荷量比 溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 核酸電泳

7、的染色劑 最常用的染色劑最常用的染色劑 溴化乙錠（溴化乙錠（ethidium bromide，EB） 是一種熒光染料，是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫紫 外線外線激發(fā)下，發(fā)出激發(fā)下，發(fā)出桔紅色熒光桔紅色熒光 可在凝膠電泳液中加入終濃度為可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的的EB，有時亦可在電，有時亦可在電 泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min EB染料有許多優(yōu)點，如染料有許多優(yōu)點，如染色操作簡便、快速，靈敏度高，染色操作簡便、快速，靈敏度高，10ng 或更少的或更少的DNA即可檢出

8、即可檢出。 （注意：注意：EB被認為是一種強致癌物質被認為是一種強致癌物質，操作時應盡量小心，配置，操作時應盡量小心，配置 和使用和使用EB時都應帶上手套，且注意不要把時都應帶上手套，且注意不要把EB灑到桌面或地板灑到桌面或地板 上。上。 ） 銀染色銀染色 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 影響瓊脂糖凝膠電泳的因素影響瓊脂糖凝膠電泳的因素 DNA分子的大小分子的大?。簩嶒炞C明，：實驗證明，DNA片段遷移距片段遷移距 離與其分子量的對數(shù)成反比；離與其分子量的對數(shù)成反比； 瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度：一定大小的：一定大小的DNA片段在不同濃片段在不同濃 度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相

9、同；度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同； DNA分子的構型分子的構型：不同構型的：不同構型的DNA在瓊脂糖凝在瓊脂糖凝 膠中的電泳速度差別較大膠中的電泳速度差別較大 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) (1) 操作簡單操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。 (2)瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠結構均勻結構均勻，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰， 分辨率高，重復性好。分辨率高，重復性好。 (3)瓊脂糖瓊脂糖透明無紫外吸收透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外監(jiān)測及，電泳過程和結果可直接用紫外監(jiān)測及

10、定量分析。定量分析。 (4)電泳后區(qū)帶電泳后區(qū)帶易染色易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可 長期保存。長期保存。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 銀染色銀染色 銀染色液中的銀染色液中的銀離子銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復合物可與核酸形成穩(wěn)定的復合物，然，然 后用還原劑如甲醛使后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶 染成黑褐色。染成黑褐色。 主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝

11、膠染 色。色。 靈敏度比靈敏度比EB高高200倍倍，但銀染色后，但銀染色后，DNA不宜回收不宜回收 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 實驗操作實驗操作 制備瓊脂凝膠 膠板的制備 加樣 電泳 紫外透射儀檢測 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 操作步驟 1. 準備準備 用蒸餾水將電泳用蒸餾水將電泳 槽和梳子沖洗槽和梳子沖洗 干凈，放在水干凈，放在水 平桌面上，并平桌面上，并 架好梳子架好梳子 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 2. 配制配制1%瓊脂糖凝膠及倒膠瓊脂糖凝膠及倒膠 具體步驟：具體步驟： 三角瓶內：三角瓶內：0.6g瓊脂糖瓊脂糖 +60ml

12、(0.5TBE) 煮膠溶解煮膠溶解 冷卻至冷卻至60(不燙手不燙手) 加加EB 倒板倒板 室溫下充分凝固室溫下充分凝固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 將膠板放入電泳槽將膠板放入電泳槽 向電泳槽中加入向電泳槽中加入0.5xTBE緩沖液至剛沒過凝膠表面緩沖液至剛沒過凝膠表面12nm。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 3. 加樣加樣 將將DNA樣品（樣品（5ul）與）與6 上樣上樣 緩沖液（緩沖液（1ul） 混勻后，用微量混勻后，用微量 加樣槍小心加入樣品孔內。加樣槍小心加入樣品孔內。 注意加樣槍的槍頭注意加樣槍的槍頭不可插入不可插入 過深過深，以免刺穿凝膠，導致，以免刺穿凝膠

13、，導致 樣品外溢。樣品外溢。 每加完一個樣品要每加完一個樣品要更換槍頭更換槍頭， 以以防止防止EB污染污染。 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析（精品課件）(課件分享) 4. 電泳電泳 接通電源，一般紅色為正極，黑色為負極，切記接通電源，一般紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由樣品由 負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負），電壓為5 V/cm （長度以兩個電極之間的距離計算）（長度以兩個電極之間的距離計算） 根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿12cm處，停