第2章發(fā)酵工業(yè)菌種

1、第第2章章 發(fā)酵工業(yè)菌種發(fā)酵工業(yè)菌種 在發(fā)酵工業(yè)中，工業(yè)生產(chǎn)水平主要由三個要素決在發(fā)酵工業(yè)中，工業(yè)生產(chǎn)水平主要由三個要素決 定，即：定，即： 1、 生產(chǎn)菌種性能生產(chǎn)菌種性能 2、發(fā)酵及提取工藝條件、發(fā)酵及提取工藝條件 3、 生產(chǎn)設(shè)備生產(chǎn)設(shè)備 其中，生產(chǎn)菌種是最重要的因素，是發(fā)酵的其中，生產(chǎn)菌種是最重要的因素，是發(fā)酵的 靈魂。靈魂。 2.1 發(fā)酵工業(yè)常用菌種發(fā)酵工業(yè)常用菌種 一、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求一、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求 1 菌種不能是病源菌菌種不能是病源菌 2 發(fā)酵周期短，生產(chǎn)能力強發(fā)酵周期短，生產(chǎn)能力強 3 發(fā)酵過程中不產(chǎn)或少產(chǎn)與目標產(chǎn)物性質(zhì)相似的副發(fā)酵過程中不產(chǎn)或少產(chǎn)與目標產(chǎn)物性質(zhì)相似的

2、副 產(chǎn)物產(chǎn)物 4 原料來源廣價格低廉，菌種能高效地將原料轉(zhuǎn)化原料來源廣價格低廉，菌種能高效地將原料轉(zhuǎn)化 成產(chǎn)品成產(chǎn)品 5 對需添加的前體有耐受能力，且不能將前提作為對需添加的前體有耐受能力，且不能將前提作為 一般碳源利用一般碳源利用 菌種純，遺傳性能穩(wěn)定，不易變異退化菌種純，遺傳性能穩(wěn)定，不易變異退化 可以在易于控制的條件下發(fā)酵可以在易于控制的條件下發(fā)酵 二、發(fā)酵工業(yè)常用菌種二、發(fā)酵工業(yè)常用菌種 細菌：細菌： 自然界分布最廣、數(shù)量最多的一類微自然界分布最廣、數(shù)量最多的一類微 生物，單細胞原核生物。生物，單細胞原核生物。 工業(yè)常用的有枯草桿菌、短桿菌工業(yè)常用的有枯草桿菌、短桿菌 還常用作基因工程

3、載體的宿主細胞，用還常用作基因工程載體的宿主細胞，用 于構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)外源物質(zhì)。于構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)外源物質(zhì)。 酵母菌酵母菌 ： 單細胞真核生物，主要分布于含糖較單細胞真核生物，主要分布于含糖較 多的酸性環(huán)境中。常用的有啤酒酵母、酒精酵多的酸性環(huán)境中。常用的有啤酒酵母、酒精酵 母。母。 霉菌霉菌 ： 是一群在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、是一群在營養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、 網(wǎng)狀、絮狀菌絲真菌的通稱。分布于偏酸性環(huán)網(wǎng)狀、絮狀菌絲真菌的通稱。分布于偏酸性環(huán) 境中，常用的有根霉、毛霉、青霉等境中，常用的有根霉、毛霉、青霉等 放線菌：放線菌： 最大價值在于能生產(chǎn)多種抗生素，從最大價值在于能生產(chǎn)多種抗生素，

4、從 微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素有微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素有60%以上的是來自于以上的是來自于 放線菌。分布于有機質(zhì)豐富的微堿性環(huán)境中。放線菌。分布于有機質(zhì)豐富的微堿性環(huán)境中。 常用的有鏈霉菌屬、小單孢屬等。常用的有鏈霉菌屬、小單孢屬等。 其它類：其它類： 藥用真菌：如靈芝、茯苓、冬蟲夏草等藥用真菌：如靈芝、茯苓、冬蟲夏草等 藻類：如螺旋藻藻類：如螺旋藻 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選 菌種分離菌種分離：將混雜著各種微生物的樣品按照實際需：將混雜著各種微生物的樣品按照實際需 要和菌株特性采取迅速、準確、有效的方法對它們進要和菌株特性采取迅速、準確、有效的方法對它們進 行分離、篩選，進

5、而得到所需的微生物的過程。行分離、篩選，進而得到所需的微生物的過程。 符合發(fā)酵工業(yè)要求的菌種可從如下途徑獲得：符合發(fā)酵工業(yè)要求的菌種可從如下途徑獲得： 1 從菌種保存機構(gòu)直接購買所需的菌株從菌種保存機構(gòu)直接購買所需的菌株 2 從自然界分離篩選從自然界分離篩選 3 從生產(chǎn)過程中發(fā)酵水平高的批號中重新進行分篩從生產(chǎn)過程中發(fā)酵水平高的批號中重新進行分篩 從自然界分離篩選菌種的一般步驟：從自然界分離篩選菌種的一般步驟： 樣品采集樣品采集 樣品預處理樣品預處理 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng) 菌種分離菌種分離 初篩、復篩初篩、復篩 性能鑒定性能鑒定 2.2.1 樣品采集樣品采集 總原則是總原則是：（1） 樣品來源越廣

6、，獲得新菌種的可樣品來源越廣，獲得新菌種的可 能性越大；能性越大； （2）要了解目標產(chǎn)物的性質(zhì)和可能產(chǎn)目標產(chǎn)物的）要了解目標產(chǎn)物的性質(zhì)和可能產(chǎn)目標產(chǎn)物的 微生物種類及其生理特征。微生物種類及其生理特征。 了解微生物的代謝規(guī)律。如初級代謝基本相同，了解微生物的代謝規(guī)律。如初級代謝基本相同， 但通常絲狀菌及產(chǎn)芽孢細菌才能進行次級代謝。但通常絲狀菌及產(chǎn)芽孢細菌才能進行次級代謝。 考慮微生物的生理特征。如營養(yǎng)類型、生長環(huán)境考慮微生物的生理特征。如營養(yǎng)類型、生長環(huán)境 等。等。 1 土樣選擇 如酵母菌 果園 產(chǎn)蛋白酶菌 魚、肉加工廠 高溫酶產(chǎn)生菌 火山或溫泉 耐壓菌 油井或海洋深處 采樣深度采樣深度 離地

7、表離地表5-25cm處較好。處較好。 季節(jié)條件季節(jié)條件 避免雨季，一般以秋季最理想。避免雨季，一般以秋季最理想。 采樣方法采樣方法 用無菌器具按規(guī)范取樣，記錄采樣用無菌器具按規(guī)范取樣，記錄采樣 地點、時間、環(huán)境情況等以備考證。地點、時間、環(huán)境情況等以備考證。 2.2.2 樣品的預處理樣品的預處理 預處理可提高菌種的分離效率，常使用的預處理可提高菌種的分離效率，常使用的 方法有：方法有： （1） 物理方法：物理方法： 熱處理：常用來減少樣品中的細菌數(shù)。熱處理：常用來減少樣品中的細菌數(shù)。 膜過濾和離心法：用來濃縮水中的微生膜過濾和離心法：用來濃縮水中的微生 物細物細 胞。胞。 （2） 化學方法：化

8、學方法： 在培養(yǎng)基中添加某些化學成分來增加特定在培養(yǎng)基中添加某些化學成分來增加特定 微生物數(shù)量。微生物數(shù)量。 （3）誘餌法： 將一些固體物質(zhì)加到待分離的土壤或水中做 成誘餌富集目的菌。 2.2.3 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng) 利用不同微生物生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)的 要求不同，投其所好取其所抗，使目的菌成為人 工環(huán)境下的優(yōu)勢菌。 （1）控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：如唯一碳源 （2）控制培養(yǎng)條件：如T、DO、pH、添加抑制劑 等 2.2.4 菌種分離菌種分離 常用的純培養(yǎng)分離方法有： （1）平板劃線法 （2）稀釋分離法 （3）簡單平板分離法 （4）涂布分離法 （5）毛細管分離法 （6）小滴分離法 通常某些菌種在分離

9、時就可進行篩選，一般這 些菌在平板上培養(yǎng)時，其產(chǎn)物可與指示劑、顯色劑 或底物等反應(yīng)而直接定性地鑒定。 常用的平板快速檢測法有： （1）變色圈法 （2）透明圈法 （3）生長圈法 （4）抑菌圈法 2.2.5 菌種的初篩和復篩 目的是選擇產(chǎn)物合成能力較高的菌株。并不 是所有菌種都能利用平板快速檢測法鑒定，因此 就要使用常規(guī)的生產(chǎn)性能鑒定，即初篩和復篩。 （1）初篩：以量多為原則 （2）復篩：結(jié)合生產(chǎn)工藝條件 2.3 性能鑒定性能鑒定 （1）確定菌種類型 （2）測定一系列生產(chǎn)指標，包括菌種毒性試驗和 生產(chǎn)性能鑒定。 常用的鑒定菌種的方法有： （1） 經(jīng)典的分類鑒定法（細胞的形態(tài)和習性） （2）現(xiàn)代分類

10、鑒定法（遺傳型的鑒定、細胞化學成分 等） （3）將菌種送到權(quán)威機構(gòu)鑒定 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良 一、菌種改良目的： 1 提高產(chǎn)物產(chǎn)量 2 提高產(chǎn)物純度，減少副產(chǎn)物 3 改良菌種性能，改善發(fā)酵過程 4 改變生物合成途徑，獲得高新產(chǎn)品 二、菌種改良的方法二、菌種改良的方法 1 自然選育：自然選育： 在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用微生物 的自然突變而進行菌種篩選的過程。 引起自然突變的因素： （1）多因素低劑量的誘變效應(yīng) （2） 互變異構(gòu)效應(yīng) 2、誘變育種：、誘變育種： 人工采用物理、化學和生物的方法促使微生物發(fā) 生突變的育種手段。 （1）選擇出發(fā)菌株：原則是要對誘變劑的敏感性

11、強， 變異幅度大，產(chǎn)量高 （2）同步培養(yǎng)：使生理狀態(tài)一致 （3）制備單細胞或單孢子菌懸液：能均勻接觸誘變 劑 （4） 誘變處理：誘變劑種類、劑量大小、處理時 間 （5）篩選變異菌株： 平板快速檢測法 形態(tài)變異的利用 高通量篩選 3 、雜交育種：、雜交育種： 微生物雜交的本質(zhì)是基因重組。 4、原生質(zhì)體融合：、原生質(zhì)體融合： 原生質(zhì)體融合和雜交育種都是在細胞水平上 的操作。原生質(zhì)體融合可以在種間、種內(nèi)、屬間 發(fā)生。 5、基因工程育種：、基因工程育種： 2.5 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏 2.5.1 菌種變異及退化機理菌種變異及退化機理 一、菌種退化： 指生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良菌

12、 種，由于進行接種傳代或保藏之后，群體中某些生 理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。 1、退化表現(xiàn)： 2、退化原因： 從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。 （1） 基因突變：根本原因 （2） 連續(xù)傳代：直接原因 3、防止菌種退化的措施： （1）減少傳代次數(shù) （2）選擇合適的培養(yǎng)條件 （3）利用不易衰退的細胞傳代 （4）采用有效的菌種保藏方法 二、退化菌種的復壯 1、純種分離法 2、淘汰退化的個體 2.5.2 菌種保藏技術(shù)菌種保藏技術(shù) 一、菌種保藏原理 采用低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)等手段使微生 物的代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀 態(tài)。 二、常用的菌種保藏方法 1、斜面低溫保藏法（定期移植保

13、藏法） 方法： 原理：低溫 適用范圍：各類微生物 保存期限：不產(chǎn)芽孢的細菌每月需移植一次 產(chǎn)芽孢的細菌3個月移植一次 酵母、霉菌、放線菌36個月移植一次 優(yōu)點：方法簡便，便于操作 缺點：保存時間短，變異退化幾率大 2、液體石蠟覆蓋保藏法 方法： 原理：低溫、缺氧 適用范圍：酵母、霉菌、放線菌和好氣性細菌 保存期限：不同種類M保藏期限不同，一般為 110年 優(yōu)點：方法簡單，不需特殊設(shè)備，保藏期限相 對較長 缺點：對厭氧菌及可分解利用烴類的M保藏效 果較差 3、砂土管保藏法 方法：制備砂土管 制備斜面培養(yǎng)物 制 備菌懸液 干燥 保藏 原理：低溫、缺氧、干燥、缺營養(yǎng) 適用范圍：耐干燥的菌種，如細菌芽孢、 放線菌及真菌孢子 保存期限：幾年幾十年 優(yōu)點：簡單易行，保藏時間長 缺點：工作量大，費人力，對干燥敏感的 M不適用 4、冷凍干燥保藏法 方法：選擇和制備保護劑 準備菌種和菌 液 預凍 冷凍干燥 保藏 原理：低溫、缺氧、干燥 適用范圍：除某些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌， 其他各類M均可采用 保存期限：一般可