laballiace高效液相色譜系統(tǒng)培訓(xùn)教材.doc

1、LabAlliace高效液相色譜系統(tǒng)培訓(xùn)教材一、液相色譜系統(tǒng)的基本原理1、色譜法分類(lèi)按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）。 氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法（GSC）和氣液色譜法（GLC），其中以GLC應(yīng)用最廣。液相 色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法（LSC）和液液色譜法（LLC）。此外還有超臨界流體 色譜法（SFC），它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相） 為流動(dòng)相（常用C02）,因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析 時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法

2、（AC）、分配色譜法（DC）、離子交換色譜法 （IEC）、排阻色譜法（EC,又稱(chēng)分子篩、凝膠過(guò)濾（GFC）、凝膠滲透色 譜法（GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳）。按操作形式可分為紙色譜法（PC）、薄層色譜法（TLC）、柱色譜法。2、液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相（mobile phase中的各組分經(jīng)過(guò) 固定相時(shí)，由于與固定相（stationary phase發(fā)生作用（吸附、分配、離 子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同， 從而先后從固定相中流出。又稱(chēng)為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特 （Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植

3、物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法（Chromatography）因之得名 后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色 譜法。液相色譜法開(kāi)始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用 液位差輸送流動(dòng)相，稱(chēng)為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常 有幾個(gè)小時(shí))。高效液相色譜法(High performanee Liquid Chromatography, HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需 用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法(High Pressure

4、LiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜法 (High Speed Liquid Chromatography, HSLP)。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。3、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)HPLC有以下特點(diǎn)：高壓一壓力可達(dá)150300kg/cm2。色譜柱每米降壓為 75 kg/cm2 以上。高速一流速為 0.1100.0 ml/min。高效一可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度一紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01 ng。同時(shí)消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快一通常分析一個(gè)樣品在1530 min,有些樣品甚至在5 min 內(nèi)

5、即可完成分辨率高一可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高一紫外檢測(cè)器可達(dá) 0.01 ng,熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)o.ipg。柱子可反復(fù)使用一用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收一樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單 一組分或做制備。4、高效液相色譜分離原理高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分 配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排 阻色譜法。a. 液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離 原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸 附-解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510 am適

6、用于分離分子量2001000的組分，大多數(shù)用于非離子型 化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。b. 液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué) 鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流 動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽 和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的 區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分 離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如08、C8、氨基柱、氰基柱和

7、苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC）。正相色譜法采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷）， 常加入乙醇、異丙醇、四氫咲喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。 常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物 （如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及 氨基酸類(lèi)等）。反相色譜法 一般用非極性固定相（如Cl8、C8）；流動(dòng)相為水或 緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫咲喃等與水互溶的 有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè) HPL

8、C應(yīng) 用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已 應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的 解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的 PH值。但需要注意的是，C18和C8 使用的pH值通常為2.57.5（28）,太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太 低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.510范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動(dòng)相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒(méi)有明 顯的界線(xiàn)（如氨基鍵合固定相）。c. 離子交換色譜法 固定相是離子交換

9、樹(shù)脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱(chēng) 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）或季氨基（陰離子交換樹(shù)脂）。被分離組分在色譜 柱上分離原理是樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子 及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不 同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。 被分離組分在離子交換柱 中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹(shù)脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān) 外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可改變化合物的 解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子 強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于

10、分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。d. 離子對(duì)色譜法 又稱(chēng)偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。 它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物 后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、 辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng) 的離子對(duì)。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽， 如四丁基溴化銨、四丁基銨磷 酸鹽。離子對(duì)色譜法常用ODS柱（即C18）,流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈- 水，水中加入310 mol/L的離子對(duì)試劑，在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行 分離。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性

11、質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、 離子強(qiáng)度有關(guān)。e. 排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是 可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(zhǎng)； 大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中， 直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩 對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。5、固定相和流動(dòng)相在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實(shí)現(xiàn)最理想分離， 是 色譜工作者的重要工作，也是用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu) 化的任務(wù)之一。本節(jié)著重討論填料基質(zhì)、化學(xué)鍵合固定相和流動(dòng)相的 性質(zhì)及其選擇。（1）基質(zhì)（擔(dān)體）HPLC填料可以是

12、陶瓷性質(zhì)的無(wú)機(jī)物基質(zhì)， 也可以是有機(jī)聚合物 基質(zhì)。無(wú)機(jī)物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無(wú)機(jī)物基質(zhì)剛性大，在溶劑 中不容易膨脹。有機(jī)聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯 -二乙烯苯、聚甲 基丙烯酸酯。有機(jī)聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入 有機(jī)基質(zhì)中，導(dǎo)致填料顆粒膨脹，結(jié)果減少傳質(zhì)，最終使柱效降低。A基質(zhì)的種類(lèi)1）硅膠硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強(qiáng)度外，還提供一一 個(gè)表面，可以通過(guò)成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上各種配基，制成反相、離 子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料 適用于廣泛的極性和非極性溶劑。缺點(diǎn)是在堿性水溶性流動(dòng)相中不穩(wěn) 定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析

13、pH范圍為28。硅膠的主要性能參數(shù)有： 平均粒度及其分布。 平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。 比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì) 的k值越大。 含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大， 溶質(zhì)的k值越大。 含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小， 其表面硅醇基的活性越強(qiáng)，對(duì)溶質(zhì)的吸附作用越大。 端基封尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。 幾何形狀。硅膠可分為無(wú)定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價(jià)格較便宜，缺點(diǎn)是渦流擴(kuò)散項(xiàng)及柱滲透性差；后者無(wú)此缺點(diǎn)。 硅膠純度。對(duì)稱(chēng)柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長(zhǎng)，堿 性成份不拖尾。2）氧化鋁具

14、有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會(huì)在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵 合相在水性流動(dòng)相中不穩(wěn)定。不過(guò)現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了在水相中穩(wěn)定的氧 化鋁鍵合相，并顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。3）聚合物以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料 是用于普通壓力下的HPLC,它們的壓力限度比無(wú)機(jī)填料低。苯乙烯 -二乙烯苯基質(zhì)疏水性強(qiáng)。使用任何流動(dòng)相，在整個(gè)pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強(qiáng)堿來(lái)清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙 烯-二乙烯苯疏水性更強(qiáng)，但它可以通過(guò)適當(dāng)?shù)墓δ芑揎椬兂捎H水 性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在 p

15、H13下反復(fù)沖洗。所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮。用于 HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分 子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶 瓷性基質(zhì)中慢，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。 對(duì)于大分子像 蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此, 聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。B .基質(zhì)的選擇硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的 HPLC分析，尤其是小分子量的 被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)， 主要用來(lái)制成分 子排阻和離子交換柱。硅膠氧化鋁苯乙烯-二乙烯苯甲基丙烯酸酯耐有機(jī)溶劑+適用pH范圍+抗膨脹/收

16、縮+耐壓+表面化學(xué)性質(zhì)+效能+注：+好 +般 +差（2）化學(xué)鍵合固定相將有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠表面的游離羥基上 而形成的固定相稱(chēng)為化學(xué)鍵合相。這類(lèi)固定相的突出特點(diǎn)是耐溶劑沖 洗，并且可以通過(guò)改變鍵合相有機(jī)官能團(tuán)的類(lèi)型來(lái)改變分離的選擇 性。A .鍵合相的性質(zhì)目前，化學(xué)鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體， 用烷烴二甲基 氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應(yīng)，形成 Si-0-Si-C 鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個(gè)/nm2,由于空間位阻效應(yīng)(不可能將較大的有機(jī)官能團(tuán)鍵合到全部硅醇基上)和其它因素的影響，使得大約有 4050%的硅醇基未反應(yīng)。殘余的硅醇基對(duì)鍵合相

17、的性能有很大影響， 特別是對(duì)非極性鍵合 相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對(duì)極性溶質(zhì)(特別是堿性化合 物)產(chǎn)生次級(jí)化學(xué)吸附，從而使保留機(jī)制復(fù)雜化(使溶質(zhì)在兩相間的 平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形 拖尾)。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后，要用三甲基氯 硅烷(TMCS)等進(jìn)行鈍化處理，稱(chēng)封端(或稱(chēng)封尾、封頂，end-capping), 以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些 ODS填料是不封尾的， 以使其與水系流動(dòng)相有更好的 濕潤(rùn)”性能。由于不同生產(chǎn)廠(chǎng)家所用的硅膠、 硅烷化試劑和反應(yīng)條件不同，因 此具有相同鍵合基團(tuán)的鍵合相，其表面有機(jī)官能團(tuán)的鍵合量往往差別 很

18、大，使其產(chǎn)品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%) 來(lái)表示，也可以用覆蓋度來(lái)表示。所謂覆蓋度是指參與反應(yīng)的硅醇基 數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。pH值對(duì)以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來(lái) 說(shuō)，硅膠鍵合相應(yīng)在pH=28的介質(zhì)中使用。B .鍵合相的種類(lèi)化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL) 鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離 主要是基于極性鍵合基團(tuán)與溶質(zhì)分子間的氫鍵作用，極性強(qiáng)的組分保 留值較大。極性鍵合相有時(shí)也可作反相色譜的固定相。常用的非極性鍵合相主

19、要有各種烷基（C1C18）和苯基、苯甲基等，以C18應(yīng)用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長(zhǎng)對(duì)樣品容量、溶質(zhì) 的保留值和分離選擇性都有影響，一般來(lái)說(shuō)，樣品容量隨烷基鏈長(zhǎng)增 加而增大，且長(zhǎng)鏈烷基可使溶質(zhì)的保留值增大， 并常?？筛纳品蛛x的 選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度， 分離極性化合物時(shí)可 得到對(duì)稱(chēng)性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相 似。另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長(zhǎng)的烷基鏈保護(hù)了硅膠基質(zhì) 的緣故，但C18基團(tuán)空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子 化合物時(shí)柱效較低。C.固定相的選擇分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對(duì)雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀

20、化合物的分離有較好的選擇 性。氨基鍵合相具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力， 對(duì)某些多官能團(tuán)化合物如 甾體、強(qiáng)心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類(lèi)分 子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類(lèi)的分析，但它不 能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因?yàn)樗鼈冎g會(huì)發(fā)生反 應(yīng)生成Schiff堿。二醇基鍵合相適用于分離有機(jī)酸、甾體和蛋白質(zhì)。分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。 利用特殊 的反相色譜技術(shù)，例如反相離子抑制技術(shù)和反相離子對(duì)色譜法等， 非 極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODSQctadecyl sila ne）是應(yīng)用最為廣泛的非極性鍵合相，它對(duì)各種類(lèi) 型

21、的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物 的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。另外，美國(guó)藥典對(duì)色譜法規(guī)定較嚴(yán)，它規(guī)定了柱的長(zhǎng)度，填料的 種類(lèi)和粒度，填料分類(lèi)也較詳細(xì)，這樣使色譜圖易于重現(xiàn)；而中國(guó)藥 典僅規(guī)定填料種類(lèi)，未規(guī)定柱的長(zhǎng)度和粒度，這使檢驗(yàn)人員難于重現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)，在某些情況下還浪費(fèi)時(shí)間和試劑。（3）、流動(dòng)相A .流動(dòng)相的性質(zhì)要求一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性 好、易于得到純品和低毒性等特征。選好填料（固定相）后，強(qiáng)溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少， 相應(yīng)的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面吸附增加， 相應(yīng)的容量因子k升高。因此，k值是

22、流動(dòng)相組成的函數(shù)。塔板數(shù) N 一般與流動(dòng)相的粘度成反比。所以選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)方 面： 流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹(shù)脂和 排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填 床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧 化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。 純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)， 特別是當(dāng)溶劑所 含雜質(zhì)在柱上積累時(shí) 必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波 長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折 光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。 粘度要低（應(yīng)2cp）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的

23、擴(kuò)散、傳質(zhì)， 降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長(zhǎng)。最好選擇沸點(diǎn)在 100C以下的流動(dòng)相。 對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀， 不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。 樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。B .流動(dòng)相的選擇在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。 在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；在反相色譜中，溶 劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑， 再加入一定量的能與水 互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫咲喃等。極性調(diào)整劑的性質(zhì) 及其所占比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有

24、顯著影響。一般情況 下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿(mǎn)足多數(shù)樣品的分離要求，且流動(dòng)相粘度小、 價(jià)格低，是反相色譜最常用的流動(dòng)相。但 Snyder則推薦采用乙腈-水 系統(tǒng)做初始實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榕c甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小， 并可滿(mǎn)足在紫外185205nm處檢測(cè)的要求，因此，綜合來(lái)看，乙腈- 水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。在分離含極性差別較大的多組分樣品時(shí)， 為了使各組分均有合適 的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。參考資料：乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價(jià)格是甲醇的67 倍。反相色譜中，如果要在相同的時(shí)間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇 /水 作為沖洗劑時(shí)其沖洗強(qiáng)度配比與乙腈/水或四氫咲喃/水的沖洗強(qiáng)

25、度配 比有如下關(guān)系：C乙腈=0.32C 2甲醇+ 0.57C甲醇C四氫呋喃=0.66C甲醇C為不同有機(jī)溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強(qiáng)度相當(dāng)于89%的乙腈冰或66%的四氫咲喃/水的沖洗強(qiáng)度。C.流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3 pKa）或弱堿（7 pKa）樣品 時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在 固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱(chēng)為反相離子抑制技術(shù)。 對(duì)于弱 酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸 的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析 弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸

26、鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量 弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作 用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺） 又稱(chēng)為減尾劑或除尾劑。D .流動(dòng)相的脫氣HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡， 影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、 基線(xiàn)穩(wěn)定性，甚至使無(wú)法檢測(cè)。（噪聲增大，基線(xiàn)不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。 此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷 基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑 pH的變化，對(duì)分離或分

27、析結(jié)果 帶來(lái)誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫咲喃）形成有紫外吸收的絡(luò) 合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在 260nm以下）,并導(dǎo)致檢 測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基線(xiàn)漂移 或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還會(huì)引起 淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響 應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影 響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高 UV檢測(cè)器的性能，也將改善 在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽 真空、超聲、吹氦等。對(duì)混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考 慮低沸點(diǎn)溶劑揮

28、發(fā)造成的組成變化。超聲脫氣比較好，1020分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一 般500ml溶液需超聲2030min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線(xiàn)（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣 后，氣體立即開(kāi)始回到溶劑中。在14小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體 所飽和。在線(xiàn)（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。最常用的在線(xiàn)脫氣法為鼓泡， 即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，此方 法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦） 將空氣替換出來(lái)。此外還有在線(xiàn)

29、脫氣機(jī)。一般說(shuō)來(lái)有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。 在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)脫氣法在電化學(xué)檢測(cè) 時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。E.流動(dòng)相的濾過(guò)所有溶劑使用前都必須經(jīng) 0.45µm （或0.22µm ）濾 過(guò)，以除去雜質(zhì)微粒，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ窃跇?biāo)簽上標(biāo)明已濾過(guò)”。用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相（脂溶性）濾膜和水相（水 溶性）濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過(guò)濾有機(jī)溶劑，過(guò)濾水溶液時(shí)流速 低或?yàn)V不動(dòng)。水相濾膜只能用于過(guò)濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否 則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對(duì)于混合流動(dòng)相， 可在混合前分別濾過(guò)，

30、如需混合后濾過(guò)，首選有機(jī)相濾膜?，F(xiàn)在已有 混合型濾膜出售。F.流動(dòng)相的貯存流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存 在塑料容器中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增 塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能 造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化， 也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯 存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在 3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾 過(guò)。容器應(yīng)定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除 去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長(zhǎng)的微生物。 因甲醇有防腐作用，所以盛 甲

31、醇的瓶子無(wú)此現(xiàn)象。G .鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問(wèn)題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼 反應(yīng)。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶 劑（如CC14、CHC13等）與各種醚類(lèi)（如乙醚、二異丙醚、四氫咲 喃等）混合后，可能會(huì)反應(yīng)生成一些對(duì)不銹鋼有較大腐蝕性的產(chǎn)物， 這種混合流動(dòng)相應(yīng)盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如 CH2C12 ）與一些反應(yīng)性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜置時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生 結(jié)晶?？傊?，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和干燥的飽和烷烴 混合，則不會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似問(wèn)題。H . HPLC用水HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測(cè)器基線(xiàn)的校正和反相柱的洗脫。

32、進(jìn)行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時(shí)，沒(méi)有有機(jī)物污染是非常重要的。測(cè)高錳酸鉀顏色保留時(shí)間的定性方法反 應(yīng)慢，對(duì)很低水平的有機(jī)物（對(duì) HPLC可能還是太高了）不夠靈敏， 特別是不能定量?？傆袡C(jī)碳（TOC）分析儀（把有機(jī)物氧化成CO2，測(cè) 游離的CO2）常用于I類(lèi)（NCCLS）水中低濃度有機(jī)物的測(cè)定。I類(lèi)水標(biāo)準(zhǔn):NCCLSASTM電阻率，MQcm 25 C，最小10.018.0硅酸鹽，mg/L,最大0.050.003微粒，µm濾器0.220.2微生物，CFU/ml10分三檔美國(guó)藥典24版（2000年）要求TOCV 0.5 mg/L （用標(biāo)準(zhǔn)蔗糖溶液 1.19 mg/L

33、）,電導(dǎo)率在室溫 pH 6 時(shí)w2.4µS/cm （即0.42c） HPLC級(jí)水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250400nm的吸收度分別不得過(guò) 0.01、0.01和0.05。增加不揮發(fā)物，w 3ppm（中國(guó)藥典純水w 10ppr）二、LabAllianee液相色譜系統(tǒng)組成泵進(jìn)樣器色譜柱（柱溫箱）檢測(cè)器工作站柱后衍生裝置旁通閥入口單向模式切換調(diào)節(jié)流速RLTEFWUTLEF泵頭出口單向開(kāi)泵/關(guān)泵Series皿泵前視圖手動(dòng)進(jìn)樣閥AS1000/3000自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱LabAlliance201型檢測(cè)器LabAllianee工作站界面三、LabAl

34、lianee液相色譜系統(tǒng)常見(jiàn)使用故障及維護(hù)1、泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)為了延長(zhǎng)泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作： 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封圈、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去 流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好用微孔濾膜（0.2或 0.45um）過(guò)濾。泵的入口都應(yīng)連接0.2um過(guò)濾頭（或片）。泵的濾頭應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。 流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如 果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是 由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體

35、將和上 述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將 泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶 劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。 輸液泵的工作壓力決不要超過(guò)規(guī)定的最高壓力，否則會(huì) 使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。 流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的 穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無(wú)法正常工作如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故 障：沒(méi)有流動(dòng)相流出，又無(wú)壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量 氣體，這時(shí)可打開(kāi)排氣閥，用一個(gè)50ml針筒在泵出口

36、處抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。 壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是 單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入甲醇水溶液中超聲清洗。 有時(shí)可能是流動(dòng)相濾頭內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺?微生物部分堵塞，這時(shí)，可卸下濾頭浸入甲醇水溶液內(nèi)超聲除 氣泡。 壓力過(guò)高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力 降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時(shí)應(yīng)逐段進(jìn) 行。2、手動(dòng)進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣器?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求： 密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色 譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。手動(dòng)進(jìn)樣閥和自動(dòng)進(jìn)樣器的維護(hù)注意事項(xiàng)包括：樣品溶液

37、進(jìn)樣前必須用 0.45um濾膜過(guò)濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。 轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相 受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過(guò)泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣 位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。3、色譜柱的維護(hù)色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹(shù)脂）、多孔碳等，其粒度一般為

38、3,5,7,10 am 等，柱效理論值可達(dá)516萬(wàn)/米。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對(duì)于同系物分析，只要500即可；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬(wàn)的柱子，因此一般1030cm左右的柱長(zhǎng)就能滿(mǎn)足復(fù)雜混合物分析的需要。柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以 外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部 位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比 較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶 加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱

39、外效應(yīng)對(duì)柱效的 影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。1 .柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過(guò)拋光。也有 人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與 拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜 柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑 0.220µm（510µm），取決于填 料粒度，目的是 防止填料漏出。色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類(lèi)，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分

40、析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm （常用4.6mm，國(guó)內(nèi) 有 4mm 和 5mm），柱長(zhǎng) 1030cm ;窄徑柱（narrow bore，又 稱(chēng)細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn ），內(nèi)徑 12mm，柱長(zhǎng)1020cm ；毛細(xì)管柱（又稱(chēng)微柱 microcolu mn ）,內(nèi)徑 0.20.5mm ;半制備柱，內(nèi)徑5mm :實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長(zhǎng) 1030cm ;生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是 為了避免管壁效應(yīng)。2. 柱的發(fā)展方向因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng)310cm，填料粒徑23µm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)

41、譜 （MS）聯(lián)接，而發(fā)展出 窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore ）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省流動(dòng)相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度；容易控制柱溫；易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。但由于柱體積越來(lái)越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1100µl/min 的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地 進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測(cè)器， 電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。3. 色譜柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)

42、十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下 列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí) 應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以 反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降 低柱效。選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅 膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使