XRCC1介導(dǎo)DNA復(fù)制損傷修復(fù)及其在歐夾竹桃苷抗腫瘤作用的機(jī)制研究

1、XRCC介導(dǎo)DNA復(fù)制損傷修復(fù)及其在歐夾竹桃苷抗腫瘤作用的機(jī)制研究DNA復(fù)制叉(DNAreplication fork)是DNA復(fù)制的基本結(jié)構(gòu),它的完整性對基因組穩(wěn)定性的維持至關(guān)重要 , 直接決定了細(xì)胞的命運(yùn)。在機(jī)體內(nèi)外各種復(fù)制壓力 的作用下，DNA復(fù)制叉極易受到干擾,產(chǎn)生損傷,導(dǎo)致DNA復(fù)制停滯。嚴(yán)重者可以影響基因組的穩(wěn)定性，誘發(fā)細(xì)胞的癌變、凋亡、壞死等。DNA復(fù)制叉穩(wěn)定性的維持是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過程，需要多種DNA損傷修復(fù)蛋白的參與。X 線修復(fù)交錯(cuò)互補(bǔ)基因 1(X-ray repair cross complementing gene 1,XRCC1)是一個(gè)重要的DNA損傷修復(fù)基因。它的編碼

2、蛋白XRCC主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,即氨基端的結(jié)構(gòu)域 (NTD,1-183 氨基酸區(qū)域 )、羧基端的乳腺癌易感基因羧基端2結(jié)構(gòu)域(BRCT II)、中間的乳腺癌易感基因羧基端 1結(jié)構(gòu)域(BRCT I)。XRCC可以借助其結(jié)構(gòu)域與DNA聚合酶P、DNA接酶3 a等多種DNA損傷修復(fù)蛋白結(jié)合。XRCC主要參與DNA的單鏈損傷修復(fù)(Single strand break repair,SSBR) 和堿基切除修復(fù) (Base excision repair,BER) 。已有研究表明，XRCC1可以在DNAM制叉處聚集。但XRCC對DNA復(fù)制叉停 滯的重新啟動(dòng)方面的研究 , 目前尚未見報(bào)道。聚腺苷二磷酸核

3、糖聚合酶 (Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP) 是存在于多 數(shù)真核細(xì)胞中的一個(gè)多功能蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶。它通過識別結(jié)構(gòu)損傷的 DNA片段而被激活，被認(rèn)為是DNA損傷的感受器。研究表明,在DNA單鏈損傷修復(fù)過程中,XRCC1在 PARFB的作用下聚集到損傷位點(diǎn)。DNA依賴蛋白激酶(DNA-de pen de nt p rotein kin ase,DNA -PK)由催化亞單位(DNA-PKcatalyticsubunitQNA-PKcs)、調(diào)節(jié)亞單位(KU,包括 Ku70、Ku80) 組成,它是DNA損傷修復(fù)的重要酶,主要通過非同源性末端接合(Non-homolog

4、ousend joining,NHEJ) 的方式, 參與 DNA 雙鏈斷裂 (double-strand breaks,DSBs)的損傷修復(fù)。當(dāng)DNA雙鏈斷裂，Ku70、Ku80快速的識別、結(jié)合DNA斷端,激活DNA-PKcs, 招募DNA接酶IV-XRCC4復(fù)合體到DNA斷端，修復(fù)連接斷裂的DNA雙鏈。研究表 明,XRCC1 寸DNA單鏈損傷的修復(fù)作用,需要DNA-PK勺磷酸化作用。根據(jù)以上研究,我們提出假設(shè):XRCC1在 PARP酶或DNA-PK勺作用下,聚集到DNAS制叉停滯處,并促進(jìn)DNAS制又停滯的重新啟動(dòng)。同源重組(Homologous recombination,HR) 主要通過

5、利用未受損傷的另一條染色體作為模版 , 來修復(fù)與 其相似的受損傷的染色體。DNA單鏈損傷修復(fù)主要通過激活P ARP酶的活性來實(shí)現(xiàn)。同源重組為主導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)與PARP主導(dǎo)的DNA單鏈斷裂損傷修復(fù)可以互相補(bǔ)充代償。在正常組織細(xì)胞中 , 兩種修復(fù)方式共存 , 共同保障細(xì)胞的存活。 抑制其中一種 機(jī)制不會(huì)產(chǎn)生致命的影響 ;然而, 在某些病變組織中 (如腫瘤細(xì)胞 ), 往往存在其中 某一種修復(fù)方式缺陷 , 此時(shí)若阻斷剩余的修復(fù)方式即可選擇性地殺死病變組織細(xì) 胞。這種理論被稱為合成致死(SyntheticLethal)。近年來,隨著研究的深入,越來越多的靶向DNA損傷修復(fù)通路的小分子抑制劑被

6、研發(fā)用于腫瘤的治療。如PARP抑制劑奧拉帕尼(Olaparib)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA) 批準(zhǔn)應(yīng)于治療同源重組修復(fù)缺陷的腫瘤患者。然而, 由于同源重組修復(fù)缺陷主要見于卵巢癌、 乳腺癌患者, 而在其他腫瘤細(xì)胞相 對較少出現(xiàn),這就限制了 PARP1抑制劑的使用范圍。歐夾竹桃苷 (Oleandrin) 是從中草藥夾竹桃中提取分離出來的一種單體化合 物,它具有很好的抗腫瘤作用。 我們前期研究發(fā)現(xiàn) , 歐夾竹桃苷能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 的DNA單鏈結(jié)構(gòu)增多及XRCC的表達(dá)增加，提示可能引起DNA損傷。據(jù)此,我們提出假設(shè) :歐夾竹桃苷抑制同源重組修

7、復(fù)。如果成立 ,歐夾竹桃苷與Olaparib聯(lián)合使用，將擴(kuò)大PARp卬制劑的使用范圍,為腫瘤的治療提供一個(gè)新 的策略。本實(shí)驗(yàn)分成兩部分進(jìn)行研究：(1)探求XRCC對寸DNA復(fù)制叉停滯、重新啟動(dòng)的 作用機(jī)制,及PARP1 DNA-PKes在這個(gè)過程中對XRCC的調(diào)控作用；(2)明確DNA損傷修復(fù)反應(yīng)在歐夾竹桃苷抗腫瘤中的作用,并探求一種新的靶向DNA傷修復(fù) 反應(yīng)的抑制劑。第一部分XRCC介導(dǎo)DNA復(fù)制損傷修復(fù)的機(jī)制研究目的：研究XRCC對DNAK制叉停滯的保護(hù)及其重新啟動(dòng)的影響,并探討PARP1DNA-PKcs對XRCC1的調(diào)控作用。方法:(1)為了探討XRCC在 DNAM制叉停滯處表達(dá),我們用

8、羥基脲 (Hydroxyurea,HU) 干預(yù)人的骨肉瘤細(xì)胞 (U20S), 免疫熒光(Immunofluorescence,IF) 檢測 XRCC表達(dá),以及 XRCC分別與 5-乙炔基-2 脫 氧尿嘧啶核苦(5-ethynyl-2 -deoxyuridine,EdU)、細(xì)胞周期蛋白 A(Cyclin-A)的共定位情況。為了探討在DNA復(fù)制叉停滯時(shí)，PARP1對XRCC的調(diào)控作用, 我們用HU與Olaparib 起干預(yù)U20S細(xì)胞,免疫熒光檢測XRCC焦點(diǎn)(foci)的形 成,觀察當(dāng)PARP的活性被抑制以后,XRCC啲表達(dá)。(3)為了探討XRCC在 DNAS制叉停滯處的聚集,對DNAK制叉停滯

9、的保護(hù)及其重新啟動(dòng)的作用,我們用HU干預(yù)EM9-V(XRCC基因缺陷)、EM9-XH(XRCC表達(dá) 正常)細(xì)胞,DNA纖維形成實(shí)驗(yàn)(DNAfiber)檢測DNA復(fù)制叉停滯和重新啟動(dòng)的情 況；(4)克隆形成實(shí)驗(yàn),檢測在HU的復(fù)制壓力作用下，XRCC1 寸細(xì)胞增殖的影響；(5) 為了明確RAD51 寸DNA復(fù)制叉停滯的保護(hù)作用,我們用HU干預(yù)U20S細(xì)胞,蛋白質(zhì) 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot) 檢測RAD51的表達(dá);(6)為了明確Mre11對XRCC1 表達(dá)的影響,我們用Mirin(Mre11抑制劑)干預(yù)U20S細(xì)胞,HU干預(yù)EM9-V EM9-XH細(xì)胞,免疫熒光分別檢測 XRCC1 M

10、re11的表達(dá);Mirin 干預(yù)EM9-V EM9-XH細(xì)胞,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測在XRCC1 Mre11都缺陷的情況下,細(xì)胞的增殖狀況。并采用Mirin與Olaparib共同干預(yù)U20S細(xì)胞,免疫熒光檢測 PARP對Mirin誘導(dǎo)的XRCC表達(dá)的影響;(7)為了觀察蛋白激酶 2(Casein Kinase 2,CK2)對XRCC俵達(dá)的影響，我們用 HU干預(yù) EM9-V EM9-XH EM9-CKMB胞,western blot 檢測 XRCC1的表達(dá)；在HU干預(yù)的U20S細(xì)胞中,加入CK2抑制劑TBB,western blot檢測XRCC1的表達(dá);(8)為了檢測DNA-PKcs對XRCC1的影響

11、,我們用HU干預(yù)DNA-PKes缺陷的V3-3細(xì)胞和野生型的AA8細(xì)胞,免疫熒光檢測XRCC焦點(diǎn)的陽性細(xì)胞;DNA-PKcs特異性的siRNA基因沉默U20S細(xì)胞的DNA-PKes再用HU干 預(yù),western-blot 檢測 XRCC俵達(dá);HU 處理 GFP-XRCC1-U20細(xì)胞,檢測 XRCC與DNA-PKes共定位情況;(9)為了進(jìn)一步研究XRCC在 DNA-PKc啲作用下,對DNA復(fù)制叉的影響,我們用siRNA基因沉默EM9-V和EM9-Xhlffl胞的DNA-PKcs然后進(jìn) 行DNA fiber實(shí)驗(yàn),檢測DNA復(fù)制叉的停滯和重新啟動(dòng)情況。結(jié)果:(1)在HU的復(fù)制壓力作用下,XRCC

12、1焦點(diǎn)陽性細(xì)胞的百分比增加,XRCC1 焦點(diǎn)與EdU共定位,且僅僅在Cyclin-A陽性的細(xì)胞中表達(dá),表明XRCC在DNAS 制叉停滯處聚集；(2)PARP1的活性被抑制,HU無法誘導(dǎo)XRCC的表達(dá)增加，表明XRCC在 DNA復(fù)制叉停滯處的聚集依賴于 PARP的調(diào)控作用;(3)與EM9-Xhlffl胞相比,EM9-V細(xì)胞的DNA復(fù)制叉停滯百分比顯著增高,表明XRCC可以保護(hù)停滯的DNA復(fù)制叉并促進(jìn)其重新啟動(dòng)： 在HU的復(fù)制壓力作用下，EM9-V細(xì)胞的克隆形 成受到抑制,而EM9-XH細(xì)胞的克隆形成無明顯影響,提示在HU作用下,XRCC1可 以促進(jìn)細(xì)胞的存活；(5)在HU的作用下,XRCC啲表達(dá)

13、在2h較高,而RAD51在 24h表達(dá)較高,提示隨著DNA復(fù)制叉停滯時(shí)間的延長，RAD51介導(dǎo)的同源重組修復(fù)可能 參與DNA復(fù)制叉停滯的修復(fù);(6)Mre11抑制劑Mirin可以誘導(dǎo)U20S細(xì)胞XRCC1 表達(dá)增加；在HU的作用下,EM9-V細(xì)胞中Mre11表達(dá)顯著高于EM9-XH細(xì)胞,提示Mre11也參與了對DNA復(fù)制叉停滯的修復(fù);(7)當(dāng)CK2活性被抑制以后,HU無法誘導(dǎo)XRCC的表達(dá)增加,提示XRCC的表達(dá)要依賴CK2的磷酸化作用;(8)在DNA-PKcS缺陷的V3-3細(xì)胞,HU無法誘導(dǎo)XRCC的表達(dá)增加；免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),XRCC1與 DNA-PKes共定位,表明XRCC的表達(dá)要依賴D

14、NA-PKcS勺調(diào)控作用;(9)DNA-PKcs被基因沉默以后QNA復(fù)制叉停滯增加,表明DNA-PKcS呆護(hù)停滯 的DNAS制叉,并促進(jìn)其重新啟動(dòng)。結(jié)論:(1)XRCC1在PARP1 DNA-PKc啲調(diào)控作用下,募集到DNAM制叉停滯處,保護(hù)停滯的DNAS制叉,并促進(jìn)其重新啟 動(dòng);(2)XRCC1在DNAK制叉處的聚集,可以促進(jìn)細(xì)胞的存活;(3)XRCC1的表達(dá)依賴 于CK2的磷酸化作用；(4)Mre11、RAD5何以保護(hù)停滯的DNAM制叉。第二部分DNA損傷修復(fù)反應(yīng)在歐夾竹桃苷抗腫瘤作用機(jī)制中的研究目的：探討DNA損傷修復(fù)反應(yīng)在歐夾竹桃苷抗腫瘤作用中的機(jī)制,并尋求一種新的同源重 組抑制劑。方

15、法 :(1) 為了探討歐夾竹桃苷的抗腫瘤作用 ,我們體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞 (A549、H1299),予以歐夾竹桃苷干預(yù),流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡；(2)為了探討歐夾竹桃苷對DNA損傷的影響,我們體外培養(yǎng)A549H1299細(xì)胞,予以歐夾竹桃苷 干預(yù)后,免疫熒光、westernblot檢測RPA 丫 H2AX表達(dá);(3)為了探討歐夾竹桃苷對DNA損傷修復(fù)通路的影響,我們體外培養(yǎng)A549H1299細(xì)胞,予以歐夾竹桃苷 干預(yù)后western blot 檢測RAD51 XRCC的表達(dá);(4)為了檢測歐夾竹桃苷對細(xì)胞周期的影響,我們體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,予以歐夾竹桃苷干預(yù)后,流式細(xì)胞儀檢 測細(xì)胞周期的阻滯情況 ;(5) 為了驗(yàn)證歐夾竹桃苷對同源重組修復(fù)的影響 , 我們用XRCC特異性的siRNA基因沉默A549細(xì)胞的XRCC基因 ,然后予以歐夾竹桃苷干預(yù), 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:(1) 歐夾竹桃苷干預(yù)后 , 肺癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加 , 增殖受到抑制 ;(2)歐夾竹桃苷可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的 DNA損傷蛋白RPA 丫 H2AX表達(dá)增加;(3)歐夾竹桃苷誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的RAD5