原核表達(dá)調(diào)控3分子生物學(xué)(1)

1、7.6 轉(zhuǎn)錄水平上的其他調(diào)控方式 轉(zhuǎn)錄過程涉及轉(zhuǎn)錄機器附著于DNA，識別啟動子序列，起始 RNA的合成，延伸和終止。轉(zhuǎn)錄的任何一步都受到調(diào)控。轉(zhuǎn)錄水 平上以下其它調(diào)控方式： 因子的調(diào)節(jié)作用 組蛋白類似蛋白的調(diào)節(jié)作用 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用 抗終止因子的調(diào)節(jié)作用 7.6.1 因子的調(diào)節(jié)作用 不同的因子可以獨立地起作用，但是，為了保證細(xì) 胞準(zhǔn)確地響應(yīng)不同的環(huán)境信號變化，因子之間常常 交互作用構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式，使得原核基因的表達(dá)穩(wěn) 定而平衡。 因子本身的活性受蛋白水解酶的調(diào)控，也能被同源 的抗因子失活?？挂蜃幽軌蚺c特定的因子結(jié)合， 阻止它們與RNA聚合酶組裝。 原核生物RNA聚合酶 2 亞基（ fact

2、or ）的功能是幫助核心酶識別啟動子，它不是RNA鏈延 伸必需的。 能提高RNA聚合酶與特異啟動子的親和力，也能降低與非特異啟動子 的親和力。 新生RNA鏈達(dá)到6-9個核苷酸，形成穩(wěn)定的酶-DNA-RNA復(fù)合物時，因 子釋放。 The factor 通過降低核心酶與非特異序列的親和力,和增加其與啟動子 的親和力來幫助核心酶識別啟動子。 無 factor 的核心酶也能在DNA模板上合成RNA，但不能正確地起始 轉(zhuǎn)錄。 E.coli有不同的 factor 分別轉(zhuǎn)錄不同類型的基因。 這在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用。 連續(xù)置換 7.6.1.1 噬菌體spo1基因的表達(dá) 7.6.1.2 枯草桿菌的孢子形成

3、過程中的級聯(lián)調(diào)控枯草桿菌的孢子形成過程中的級聯(lián)調(diào)控 芽 孢 的 形 成 與 釋 放 芽孢形成過程中的芽孢形成過程中的因子激活級聯(lián)因子激活級聯(lián) F激活早激活早 期芽孢形期芽孢形 成基因的成基因的 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 E激活母激活母 細(xì)胞前期細(xì)胞前期 分化基因分化基因 的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄 隔膜 G激活晚激活晚 期芽孢形期芽孢形 成基因的成基因的 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 K激活母細(xì)激活母細(xì) 胞后期分化胞后期分化 基因的轉(zhuǎn)錄基因的轉(zhuǎn)錄 級聯(lián)保證了芽孢形成過程中各個步驟按正確的順序發(fā)生。級聯(lián)保證了芽孢形成過程中各個步驟按正確的順序發(fā)生。在在 級聯(lián)中每一級聯(lián)中每一因子控制著芽孢形成的一個階段，并且控制著因子控制著芽孢形成的一個階段，并

4、且控制著 在下一階段發(fā)揮作用的在下一階段發(fā)揮作用的因子合成。因子合成。并且在母細(xì)胞和芽孢之間并且在母細(xì)胞和芽孢之間 存在著信息交換，使前芽孢和母細(xì)胞中的基因表達(dá)相互協(xié)調(diào)。存在著信息交換，使前芽孢和母細(xì)胞中的基因表達(dá)相互協(xié)調(diào)。 抗抗因子與抗抗因子與抗抗因子因子 7.6.1.3 熱激蛋白的表達(dá) 大腸桿菌的最適生長溫度是大腸桿菌的最適生長溫度是37。當(dāng)溫度上升至。當(dāng)溫度上升至46時，時， 大腸桿菌幾乎停止生長。在大腸桿菌幾乎停止生長。在46下細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)大約下細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)大約30 為一組相當(dāng)保守的熱激蛋白（為一組相當(dāng)保守的熱激蛋白（heat shock protein, HSP）。）。 很多

5、熱激蛋白是分子伴侶（很多熱激蛋白是分子伴侶（molecular chaperones）和蛋白酶。）和蛋白酶。 分子伴侶的作用是介導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊；蛋白酶的作用則是分子伴侶的作用是介導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊；蛋白酶的作用則是 降解受到熱損傷而又不能修復(fù)的蛋白質(zhì)。降解受到熱損傷而又不能修復(fù)的蛋白質(zhì)。 熱激蛋白的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。熱激蛋白基熱激蛋白的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。熱激蛋白基 因的啟動子被因的啟動子被32 32而不是通常的 而不是通常的70 70識別。 識別。32 32也不能識別 也不能識別 7070啟動子，因為 啟動子，因為這兩種這兩種因子識別的啟動子序列不一樣因子識別的啟動子序

6、列不一樣 HSP的誘導(dǎo)合成是由于細(xì) 胞內(nèi)的32水平瞬間升高引 起的。 在熱激條件下，在熱激條件下，32 的合成會增加，的合成會增加，熱激誘熱激誘 導(dǎo)導(dǎo)32合成發(fā)生在翻譯合成發(fā)生在翻譯 水平。水平。 另一方面，在熱激條另一方面，在熱激條 件下件下32的穩(wěn)定性也增的穩(wěn)定性也增 加了。加了。 7.6.2 組蛋白類似蛋白的調(diào)節(jié)作用 細(xì)菌中存在一些組蛋白類似蛋白，能非特異地結(jié)合DNA， 維持其高級結(jié)構(gòu)（例如H-NS）。H-NS先結(jié)合到DNA上， 然后通過Pr-Pr interaction形成多聚體以幫助維持DNA的高 級結(jié)構(gòu)；H-NS與大腸桿菌基因組上分散的大量基因的調(diào)控 區(qū)有較高的親和性，這些基因大都

7、與環(huán)境條件的變化有關(guān)， H-NS的結(jié)合能抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。 7.6.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用 大腸桿菌中大約有300多個基因編碼與啟動子區(qū)結(jié)合的蛋白， 它們能激活或抑制轉(zhuǎn)錄，稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。 它們大多是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，能與特定的啟動子 結(jié)合。 有些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能調(diào)控很多基因的表達(dá)（如CRP, FNR, IHF, Fis），有些只能調(diào)節(jié)一兩個啟動子。 許多基因的啟動子區(qū)有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點，共同作 用才能使RNA聚合酶順利起始基因轉(zhuǎn)錄。 7.6.4 抗終止作用 抗終止蛋白阻止轉(zhuǎn)錄的終抗終止蛋白阻止轉(zhuǎn)錄的終 止作用，因此止作用，因此RNARNA聚合酶聚合酶 能夠越過終止子繼續(xù)

8、轉(zhuǎn)錄能夠越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄 DNADNA。 抗終止因子在抗終止因子在RNAPRNAP到達(dá)終到達(dá)終 止子之前與之結(jié)合。止子之前與之結(jié)合。 主要見于噬菌體和少數(shù)細(xì)主要見于噬菌體和少數(shù)細(xì) 菌。菌。 噬菌體是以E.coli為宿主的溫和病毒。它一旦感染細(xì)菌就會以2種 方式繁殖。 溶源途徑：噬菌體感染E.coli后，將其基因組整合到細(xì)菌染色體 上，隨著細(xì)菌染色體的復(fù)制而復(fù)制。整合有噬菌體基因組的細(xì) 菌稱為溶源菌，這一過程稱為溶源途徑。 溶菌途徑：噬菌體感染宿主后也可以利用細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的養(yǎng)料進(jìn) 行繁殖，最終使宿主裂解而死亡，這一過程稱為溶菌途徑。溶 菌途徑需要噬菌體DNA的復(fù)制和病毒外殼蛋白的形成。 噬菌體裂

9、解周期中的級聯(lián)調(diào)控依賴于抗終止作用 噬菌體裂解周期中的級聯(lián)調(diào)控依賴于抗終止作用 溶源性細(xì)菌在正常情況下非常穩(wěn)定；但在細(xì)菌受某 些外界物理或化學(xué)因素(如紫外線、絲裂霉素C等)的 作用，就會有效的轉(zhuǎn)向溶菌途徑。原噬菌體便脫離 細(xì)菌染色體而進(jìn)行自主復(fù)制，于是細(xì)菌裂解，游離 出大量的噬菌體，這一過程稱為溶源性誘導(dǎo)。 對繁殖途徑的選擇依賴于細(xì)胞對2種選擇性基因表 達(dá)程序的選擇。 Bacteriophage Lambda 極早期： 早期： 晚期： 7.7 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生物最經(jīng)濟的調(diào)控方式。但轉(zhuǎn)錄生成mRNA以后，再 在翻譯或翻譯后水平進(jìn)行“微調(diào)”，是對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的補充，它使基因表達(dá)的調(diào)

10、控更加適應(yīng)生物本身的需求和外界條件的變化。調(diào)控方式有： mRNA自身結(jié)構(gòu)元件對翻譯起始的調(diào)控 mRNA穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)錄水平的影響 調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用 反義RNA的調(diào)節(jié)作用 稀有密碼子對翻譯的影響 重疊基因?qū)Ψg的影響 翻譯的阻遏 魔斑核苷酸水平對翻譯的影響 7.7.1 mRNA自身結(jié)構(gòu)元件對翻譯起始的調(diào)控 大腸桿菌有14%的基因起始密碼子是GUG、3%為UUG，另有兩 個是AUU，這些密碼子與fMet-tRNA的配對能力比AUG弱，從而 導(dǎo)致翻譯效率下降。 mRNA的二級結(jié)構(gòu)也是翻譯起始調(diào)控的重要因素。因為核糖 體的30S亞基必須與mRNA結(jié)合，要求mRNA5端有一定的 空間結(jié)構(gòu)。SD序列的微小變

11、化，往往會導(dǎo)致表達(dá)效率成百 上千倍的差異，這是由于核苷酸的變化改變了形成mRNA 5 端二級結(jié)構(gòu)的自由能，影響了30S亞基與mRNA的結(jié)合，從 而造成了蛋白質(zhì)合成效率上的差異。 RBS的結(jié)合強度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及與AUG的距離。 SD與AUG相距一般以410核苷酸為佳，9核苷酸最佳。 核糖開關(guān)核糖開關(guān)(riboswitch) : mRNA一些非編碼區(qū)的序列折疊成一定的構(gòu) 象，這些構(gòu)象的改變應(yīng)答于體內(nèi)的一些代謝分子、離子濃度或溫度等， 從而通過這些構(gòu)象的改變達(dá)到調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄的目的。 調(diào)控機制 1：轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 ：主要是控制終止子和抗終止子的形成，達(dá)到調(diào)控的目的 2：翻譯水平的調(diào)控：控制

12、剪切功能 GlcN6P與核酶結(jié)合，有活性的核酶會切割glmS mRNA，阻止蛋白質(zhì)翻譯。 7.7.2 mRNA穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)錄水平的影響 所有細(xì)胞都有一系列核酸酶，用來 清除無用的mRNA。一個典型的 mRNA半衰期為2-3min。mRNA分 子被降解的可能性取決于其二級結(jié) 構(gòu)。 7.7.3 調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用 細(xì)菌中有些mRNA結(jié)合蛋白可激活靶基因的翻譯。相反， mRNA特異性抑制蛋白則通過與核糖體競爭性結(jié)合mRNA 分子來抑制翻譯的起始。大腸桿菌中的核糖體蛋白就存在 翻譯抑制現(xiàn)象。 阻抑蛋白靶基因作用位點 R17 R17 外殼蛋白R17R17復(fù)制酶核糖體結(jié)合位點的發(fā)夾結(jié)合 T4 RegAT4

13、RegAT4T4早期mRNAmRNA含有起始密碼子的各種序列 T4 DNA T4 DNA 聚合酶T4 DNA T4 DNA 聚合酶S-DS-D序列 T4 p32T4 p32基因3232單鏈55前導(dǎo)序列 與mRNA起始區(qū)結(jié)合抑制翻譯的阻抑蛋白 7.7.4 反義RNA的調(diào)節(jié)作用 RNA調(diào)節(jié)是原核基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的另一種重要機制。 細(xì)菌響應(yīng)環(huán)境壓力的改變，會產(chǎn)生一些非編碼小RNA分子， 能與mRNA中的特定序列配對并改變其構(gòu)象，導(dǎo)致翻譯過 程的開啟或關(guān)閉等作用。 1983年年Mizuno、 Simous、 Kleckner同時發(fā)現(xiàn)反義同時發(fā)現(xiàn)反義RNA （antisense RNA）。）。 反義反

14、義RNA(antisense RNA)是與是與mRNA互補的互補的RNA分子。分子。 7.7.4.1 反義RNA的作用 反義RNA能與mRNA分子特異性地互補結(jié)合，從而抑制該mRNA的加工與 翻譯。可調(diào)控原核細(xì)胞中基因表達(dá)、控制噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)以及抑制轉(zhuǎn) 座子的轉(zhuǎn)位作用等。 在真核細(xì)胞中也存在反義RNA，但功能尚未全部搞清楚。 通過人工合成反義RNA的基因，并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出反義RNA，即能 抑制特定基因的表達(dá)，阻斷該基因的功能，有助于了解該基因?qū)?xì)胞生長 和分化的作用。同時也有對腫瘤實施基因治療的可能性。 7.7.4.2 反義RNA的作用機制 反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序

15、列和（或）編碼區(qū)，引起 翻譯的直接抑制或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對 RNase的敏感性增加，使其降解。 反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶 mRNA的翻譯功能。其作用機制可能是反義RNA與靶mRNA的上游 序列結(jié)合后阻止了核糖體的結(jié)合。 反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA和mRNA有不完 全的互補序列，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在mRNA上緊隨雜 交區(qū)之后的是一段U豐富區(qū)。其結(jié)構(gòu)類似于終止子結(jié)構(gòu)，從而使轉(zhuǎn) 錄開始不久后即終止。 7.7.4.3 人工合成構(gòu)建反義RNA 通過人工設(shè)計在天然狀態(tài)下不存在的反義RNA，可調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。 由于

16、對靶mRNA的SD序列上游區(qū)的結(jié)構(gòu)了解甚少，因此，很難設(shè)計用 于和靶mRNA SD序列上游區(qū)結(jié)合的反義RNA。 在原核生物中針對SD序列及其附近區(qū)域的反義RNA的作用可能更有效。 在真核生物中，對應(yīng)于5端非編碼區(qū)的反義RNA比針對編碼區(qū)的反義 RNA更有效。也有實驗表明針對第一內(nèi)含子的反義RNA也同樣有效。 如果在靶mRNA上找到一段連續(xù)的U序列，就可以設(shè)計出反義RNA， 與該U序列上游的mRNA鏈互補，以形成類似終止子結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)錄水 平上抑制靶基因的表達(dá)。 Regulation of target RNAs by OxyS and DsrA. The left box shows a sch

17、ematics of inhibition mechanisms of OxyS and the right box inhibition by DsrA. 7.7.5 稀有密碼子對翻譯的影響 dnaG、rpoD及rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個操縱子，而這3個基 因產(chǎn)物在數(shù)量上卻大不相同，每個細(xì)胞內(nèi)50個拷貝的DnaG蛋白，2800 個拷貝的RpoD蛋白；40000個拷貝的RpsU蛋白?；蜣D(zhuǎn)錄出來的三個 蛋白相應(yīng)的mRNA拷貝數(shù)大體相同，由于翻譯的調(diào)控使得蛋白的拷貝數(shù) 發(fā)生了很大的變化。 細(xì)胞可通過翻譯調(diào)控不同蛋白含量的高低。即使對于同一 操縱子上不同的基因，其產(chǎn)物在數(shù)量上也可大不相同

18、。 許多調(diào)控蛋白在細(xì)胞內(nèi)含量很低，編碼這些蛋 白的基因中高頻率地使用了很多稀有密碼子，稀 有密碼子對應(yīng)次要（低豐度）的tRNA。因此，翻 譯速度受tRNA供應(yīng)的限制，影響了蛋白質(zhì)合成的 總量。 而其它基因中利用這些稀有密碼子頻率很低。 7.7.6 重疊基因?qū)Ψg的影響 正常情況下，trp操縱子中5個基因產(chǎn)物是等量的，但trpE突變后，其鄰近的 trpD產(chǎn)量比下游trpBA產(chǎn)量要低得多。研究trpE和trpD以及trpB和trpA兩對基 因中核苷酸序列與翻譯的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)trpE基因的終止密碼子和trpD基因的起 始密碼子共用核苷酸。 trpE-ThrPheSTP .ACUUUCUGAUGGCU.

19、 MetAla-trpD trpB-GluIleSTP .GAAAUCUGAUGGAA. MetGlu-trpA 偶聯(lián)翻譯是保證兩個 基因產(chǎn)物在數(shù)量上相 等的重要手段。 galT的終止密碼子與K的起始密碼子相隔3個核苷酸，但K基因 的SD序列卻位于T基因的終止密碼子之前。當(dāng)T翻譯終止時， 核糖體覆蓋了SD序列和K基因的起始密碼子，還沒有脫落就 開始了K的翻譯。 7.7.7 翻譯的阻遏 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控一般都是蛋白質(zhì)或某些小分 子物質(zhì)對基因轉(zhuǎn)錄的阻遏或激活，而在翻譯 水平上也發(fā)現(xiàn)了類似的蛋白質(zhì)阻遏作用。 大腸桿菌RNA噬菌體 Q包含有3個基因，當(dāng) 噬菌體感染細(xì)菌，RNA進(jìn)入細(xì)胞后，這條稱 為(+)鏈的RNA可直接作為模板指導(dǎo)RNA復(fù) 制酶的翻