探析體外血管生成三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建

1、探析體外血管生成三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建摘要：目的 建立臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEQs的體外血管生成的三維培養(yǎng)模 型。方法 以酶消化法獲得以HUVEC為主的混合細(xì)胞懸液，經(jīng)反復(fù)貼壁法分離 純化HUVEC,s通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。采用夾心培養(yǎng)法構(gòu)建HUVEC的體外血管生成三維培養(yǎng)模型。結(jié)果HUVECs在膠原凝膠之間，24 h左右血管樣結(jié)構(gòu)的分支之間相互溝通連接形成復(fù)雜的狀結(jié)構(gòu)，2d后凝膠內(nèi)的細(xì)胞開始退化，3 d 發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞出現(xiàn)崩解。24 h凝膠經(jīng)1 E染色可見細(xì)胞索及原始血管腔形成。 結(jié)論成功建立體外血管生成的三維培養(yǎng)模型。夾心培養(yǎng)法是較為成熟的體外血 管生成的三維培養(yǎng)方法，具有操作簡便、三維血

2、管樣結(jié)構(gòu)形成數(shù)量多、絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù) 雜等特點。關(guān)鍵詞：內(nèi)皮，血管；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞，培養(yǎng)的；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)； 臍靜脈；新生血管化，病理性血管生成即由原有血管出芽生長形成新生血管的過程，血管生成參與多種生理 和病理過程，如發(fā)育、再生、炎癥和腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移等 1丄。腫瘤血管生成 已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點，通過抑制腫瘤血管生成進(jìn)行抗腫瘤治療， 被認(rèn)為是 非細(xì)胞毒性治療腫瘤中最具前途的方法之一口 L。內(nèi)皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)法是利用血管內(nèi)皮細(xì)胞在三維條件下形成血管狀 結(jié)構(gòu)的特點，模擬體內(nèi)的血管形成過程，是揭示體內(nèi)血管形成的最佳體外模型。 本研究利用分離純化的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）選用夾心培養(yǎng)法構(gòu)建體外血 管生

3、成的三維培養(yǎng)模型，目的在于獲得體外三維血管樣結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)一步在體外 研究血管生成的抑制實驗。這對評估各種影響因素對血管生成的影響具有實際應(yīng) 用價值，并為今后針對腫瘤性血管生成的腫瘤治療方法提供實驗依據(jù)。1 材料與方法材料主要器材及試劑超凈工作臺（HW 山（X）,蘇州蘇凈集團(tuán)）；體積分?jǐn)?shù)為的CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國REVC公司）；倒置顯微鏡（Olympus CK40日本）、 臺式冷凍高速離心機(jī)（HERMLEBORTECHNZ323K德國）；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（MBE GZX 907，上海博迅公司）；胎牛血清及M199培養(yǎng)液（美國Hyclone產(chǎn)品）、鼠尾 膠、I型或U型膠原酶、胰酶（1 : 250）消

4、化液（美國Sigma公司）、血管內(nèi)皮生 長因子（VEGF美國Peptrotech 公司），鼠抗人單克隆 CD31抗體、CD34抗體、 第毗因子抗體（美國 Santa Cruz公司），UltraSensitiveTM SP 超敏試劑盒（福 州邁新公司）。對象取福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院育齡健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后 的新鮮胎兒臍帶組織，長約 20 cm置于含100卩/mL青霉素、100卩g/mL鏈霉 素的4 C PBS緩沖液中分離純化。方法HUVEC啲分離純化并鑒定酶消化法獲取HUVEC混懸液參照文獻(xiàn)方法。在無菌條件下，將新鮮的胎兒臍帶臍靜脈一端置入已磨平的16號針頭，止血鉗固定，注入PBS緩沖液反復(fù)沖

5、洗至無血跡。止血鉗夾住靜脈另一端，以20 mL的注射器向臍靜脈內(nèi)徐徐注入交原酶溶液，至血管充盈。立即將臍帶放入37 C培養(yǎng)箱內(nèi)，1525 min 后取出。松開止血鉗，通過注射器向臍靜脈內(nèi)灌注PBS液,收集流出液置離心管 內(nèi)，1 000 r/min 離心10 min。棄上清，以M199完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，并 接種于預(yù)先以明膠覆蓋的100 mL的玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)。反復(fù)貼壁法純化HUVECs將接種HUVEC混懸液的培養(yǎng)瓶于培養(yǎng)箱 內(nèi)靜置20 min。倒置顯微鏡下觀察見部分細(xì)胞貼壁，稍加搖蕩不浮起，將培養(yǎng) 液連同尚未貼壁的細(xì)胞一起倒入或吸到另一培養(yǎng)瓶中。重復(fù)上述操作23次后，將HUVEC和成纖維細(xì)胞分

6、離開，所得的細(xì)胞混懸液為HUVEC與血液系統(tǒng)細(xì)胞的 混合液。將混合液靜置培養(yǎng)，24 h后換液，使用PBS漂洗貼壁生長的HUVEC,s 洗脫懸浮生長的血液系統(tǒng)細(xì)胞，得到純化的HUVECS見到貼壁生長的HUVEC,s 以后隔天換液，待長滿后1 : 23傳代培養(yǎng)。A:4 h左右開始貼壁,形成單層多細(xì)胞集落，細(xì)胞呈梭形（X 100）； B:接種培養(yǎng)5 d后細(xì)胞融合生長，并 鋪滿培養(yǎng)瓶底，呈鋪路石狀（X 100）； C: HUVEC呈圓形，胞核及核仁清晰可見（X 400）HUVEC啲鑒定 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測 CD31 CD34第毗因子 的表達(dá)，使用SP染色法，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。用已知標(biāo)準(zhǔn)片

7、作為陽性對 照，同時用PBS替代第一抗體做陰性對照。體外血管生成的三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建參照文獻(xiàn)方法加于改良。取7份鼠尾膠溶液、1份10X M199培養(yǎng)液、1份胎牛血清和1份mol/L HEPES液 及終濃度40 ng/mL的VEGF在冰浴下迅速混合成膠原工作液。于 12孔細(xì)胞培 養(yǎng)板每孔加入500卩L，置細(xì)胞培養(yǎng)板于體積分?jǐn)?shù)為的 CO2孵箱約23 h，直到 膠原工作液形成凝膠。取指數(shù)生長期細(xì)胞用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度成1X 106 mL1細(xì)胞懸液。每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，置體積分?jǐn)?shù)為的 CO2孵箱中約12 h，直 到細(xì)胞在膠原凝膠上貼附。吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入500卩L膠原工作液，置體積分?jǐn)?shù)為的C

8、O2孵箱 23 h，至上層膠原形成凝膠。之后每孔加入 1 mL M199完全培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)24 h后，取部分孔板將凝膠進(jìn)行4呦性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、水平連續(xù)切片、E染色等處理，顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞在凝膠中的生長情況?？蓳?jù)實驗要求于12孔培養(yǎng)板重復(fù)配制數(shù)孔，便于分組比較。2 結(jié)果原代培養(yǎng)的HUVEC形態(tài)原代培養(yǎng)的HUVEC在4 h左右開始貼壁，形成單層多細(xì)胞集落，細(xì)胞呈梭形；伴隨細(xì)胞迅速生長，集落增大初長出的細(xì)胞 為梭形，一般5d左右融合成片，細(xì)胞互不重疊，呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，此 時細(xì)胞呈多角形、梭形或卵圓形；11 E染色時，密集區(qū)細(xì)胞核呈橢圓

9、形，淡藍(lán) 色，密集區(qū)邊緣和稀疏區(qū)的梭形細(xì)胞胞核呈梭形，著色深，呈紫藍(lán)色（圖1）。HUVEC免疫化學(xué)染色鑒定分離純化獲得的HUVEC,鏗CD31CD34第毗因子染色顯示，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著， 三者在內(nèi)皮細(xì)胞均為陽 性表達(dá)（圖2）。體外血管生成的三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建情況倒置相差顯微鏡下可見HUVEC在膠原凝膠之間起初呈單個排列，細(xì)胞圓形或卵圓形，隨著培養(yǎng)時間 延長細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，伸長成梭形、形成突起，相鄰細(xì)胞突起相互連接， 逐漸從凝膠表面向凝膠內(nèi)遷移，出現(xiàn)少量的由細(xì)胞遷移連接形成的血管樣結(jié)構(gòu)， 12 h后血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量增多，并且相互之間出現(xiàn)連接溝通，隨著時間推移，血 管樣結(jié)構(gòu)越趨復(fù)

10、雜，24 h左右血管樣結(jié)構(gòu)的分支之間相互溝通連接形成復(fù)雜的 狀結(jié)構(gòu)，2 d后凝膠內(nèi)的細(xì)胞開始退化，3 d發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞出現(xiàn)崩解。HUVECs 在體外三維培養(yǎng)24 h,凝膠水平連續(xù)切片后行11 E染色，可見到由內(nèi)皮細(xì)胞索 形成的管狀結(jié)構(gòu)（圖3）。A:12 h后,相鄰細(xì)胞突起相互連接,逐漸從凝膠表面向凝膠內(nèi)遷移，細(xì)胞遷移連接形成血管樣結(jié)構(gòu)，并且相互之間出現(xiàn)連接溝通； B：24 h,血管樣結(jié)構(gòu)的分支之間相互溝通連接形成復(fù)雜的狀結(jié)構(gòu) ；C:2 d,凝膠內(nèi) 的細(xì)胞開始退化；D:3 d,大部分細(xì)胞出現(xiàn)崩解；E:培養(yǎng)24 h,凝膠水平連續(xù)切 片后行II E染色，可見到由內(nèi)皮細(xì)胞索形成的管狀結(jié)構(gòu)。3 討 論血

11、管內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)在認(rèn)識正常的血管新生和腫瘤血管生成及 血管病理生理等過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。內(nèi)皮細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)模型是模擬及 揭示體內(nèi)血管形成過程的最佳體外模型。血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于循環(huán)血液與血管壁內(nèi)皮下組織之間的單層細(xì)胞，具有多種重要的生理功能。本實驗采用的是人 HUVECs它是體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要來源，除具有來源充足、獲取方便、能獲得較多細(xì)胞等優(yōu)點外，與來源 于動物的內(nèi)皮細(xì)胞相比，實驗條件和結(jié)果更符合人體情況。1980年，F(xiàn)olkman等首次觀察到內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中具有形成血管樣結(jié)構(gòu)的趨勢，由此揭開了內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的序幕。Marti ns等證實在三維培養(yǎng)體系與二維培養(yǎng)

12、體 系中內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為存在著顯著差異，三維培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞的生長更類似于體內(nèi)血管生成。近20余年來，內(nèi)皮細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)技術(shù)日臻成熟。 體外三維培養(yǎng)技術(shù)主要包括表面培養(yǎng)法、夾心培養(yǎng)法、混合培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng) 法以及基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞聚集體侵襲法等，這些方法目的相同、價值相似，但選用何種方法在不同的基質(zhì)及條件中有不同的選擇。本實驗所采用的是被廣大學(xué)者所采用的夾心培養(yǎng)法，它操作簡單方便，較適合常規(guī)倒置顯微鏡連續(xù)觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài) 改變及遷移、血管樣結(jié)構(gòu)形成的過程，并可借助計算機(jī)輔助技術(shù)進(jìn)行血管樣結(jié)構(gòu) 的數(shù)目及長度的計數(shù)。它為離體細(xì)胞的生長更好的提供三維空間，是在體血管生 成最簡單的模型。本研究所采

13、用的細(xì)胞外基質(zhì)I型膠原是一種比較常用的細(xì)胞外基質(zhì)，它可以增強(qiáng)細(xì)胞的貼附性，凝固后形成具有一定的展性的凝膠，用“三明治法”在 其夾心中接種細(xì)胞，可見細(xì)胞的移行和向膠原內(nèi)浸潤，并形成管腔樣結(jié)構(gòu)。這與Ingber等所闡述的理論相符，即內(nèi)皮細(xì)胞包埋在有展性的膠原中可以分化，形 成靜態(tài)管型；而在硬度較大的膠原中只增殖，形成單層細(xì)胞。本實驗顯示，細(xì)胞 接種12 h后相鄰的細(xì)胞伸展、延長進(jìn)而相連形成血管樣結(jié)構(gòu)，24 h可見到血管樣結(jié)構(gòu)互相連接形成絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，但 2d后凝膠內(nèi)的細(xì)胞開始退化，3 d后發(fā)現(xiàn)大 部分細(xì)胞出現(xiàn)崩解，這可能由于凝膠內(nèi)的促血管生長因子如VRGF勺逐漸耗竭以及其他因素的變化有關(guān)。如何延長三維

14、培養(yǎng)模型中形成的復(fù)雜血管樣結(jié)構(gòu)的時間， 對于利用其作為體外血管生成機(jī)制和抗血管生成的研究可能具有更重要的意義， 筆者已在做進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】Fonsatti E,Altomonte M,Nicotra M R,et al. Endoglin (CD105): apowerfi 1 T.herc.peiT Jctci.rger on tkimor y.ssoci y.ted angiogeni c bl ood vessels .1 I. (Jncogono 20XXs 22:6557 6563.Fonsatti E,Sigalotti L,Arslan P,et al. Emergin

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