微生物教程第八章微生物的遺傳變異和育種

1、第八章 微生物的遺傳變異和育種 第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 一、三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn) （一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 后來(lái)，有三位科學(xué)家將第三組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下改 進(jìn)：從高溫滅活的S型細(xì)菌中提取幾種細(xì)胞成分(如 DNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖等)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) AveryAvery實(shí)驗(yàn)，如圖示： （二）噬菌體感染試驗(yàn) 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) Pr 只含S不含PDNA只含P不含S原理 步驟 1：用含同位素35, P32的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌 2：讓T2感染上述大腸桿菌使其打是S35P32標(biāo)記 3： 吸附10分鐘后 攪動(dòng) 離心 上清液 沉 淀 結(jié)果：上清液中含15%放射擊性；沉淀中含85%放射性 煙草花葉病毒（TMV）是一種只含RNA

2、的植物 病毒，其中94%是蛋白質(zhì)外殼，6%是RNA?？稍跓煵?上引起病斑。把TMV放在水和苯酚中震蕩，可將病 毒的蛋白質(zhì)外殼和RNA分開(kāi)，分開(kāi)的蛋白質(zhì)外殼和 RNA分子又能重新組合成具有感染力的完整病毒粒 子。另一株與TMV近緣的霍氏車(chē)前花葉病毒（HRV）， 也可引起病斑。但兩種病斑的表征不同。 1956年，F(xiàn)raenkel-conrat利用這兩株植物病 毒的核酸和蛋白質(zhì)的拆、合及相互對(duì)換進(jìn)行實(shí)驗(yàn)如 下圖。 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) TMV HRV HRV TMV 原始株 拆開(kāi) 重建 感染 分離純化 二、 遺傳物質(zhì)存在的部位和方式 質(zhì)粒：凡游離于原核生物核基因組以外，具有獨(dú)立復(fù) 制能力的小型共價(jià)閉合

3、環(huán)狀的dsDNA分子。 質(zhì)粒特點(diǎn)： 從結(jié)構(gòu)上看為超螺旋結(jié)構(gòu) 從大小上看，相對(duì)分子質(zhì)量為106108（相當(dāng)核基因組 的1） 從功能上看，質(zhì)粒上存在核內(nèi)沒(méi)有的基因，賦予了原 核生物并非必不可少的特殊功能，如：產(chǎn)毒、接合、抗 藥、固氮等。 a)從存在形式上看，是一種復(fù)制子，分為嚴(yán)緊型復(fù)制（ 與核染色體的復(fù)制同步）與松弛型復(fù)制（不與核染色體 的復(fù)制同步）。 （二） 原核生物的質(zhì)粒 少量質(zhì)?？稍诓煌觊g轉(zhuǎn)移，如：F 因子或R因子等。有些質(zhì)粒具有與核染色體 發(fā)生整合或脫離的功能，稱(chēng)附加體.如F因 子。 此外，質(zhì)粒還有基因重組功能，可在 質(zhì)粒間、質(zhì)粒與核染色體之間發(fā)生基因重組。 一些有代表性的質(zhì)粒： F因

4、子、R因子、Col質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、巨 大質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒。 F因子：又稱(chēng)性因子，是E.coli等細(xì)菌決定性別 的質(zhì)粒，當(dāng)然除E.coli外，亦發(fā)現(xiàn)其他菌也有 此質(zhì)粒。如假單胞菌屬、鏈球菌屬。有性菌毛 的細(xì)菌體內(nèi)均含性質(zhì)粒，且性菌毛根數(shù)與性質(zhì) 粒數(shù)目相等（1-4），故屬于松弛型。 R因子：亦稱(chēng)抗藥質(zhì)粒、R質(zhì)粒存在于細(xì)菌中， 使菌體具有抗藥性的質(zhì)粒。最初是在痢疾桿菌 中提取出來(lái)。 Col質(zhì)粒：又稱(chēng)大腸桿菌素質(zhì)粒，許多細(xì)菌都能 產(chǎn)生使其他原核生物抑制或致死的蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì) 菌毒素。大腸桿菌素都是由Col質(zhì)粒編碼。 Ti質(zhì)粒：亦稱(chēng)誘癌質(zhì)粒主要存在于根癌 菌株中，由Ti質(zhì)粒引起植物的根癌。 巨大質(zhì)粒：比一般質(zhì)

5、粒大幾十倍至幾百 倍。 其他質(zhì)粒：降解性質(zhì)粒只存在于假單胞 菌屬，能夠編碼可降解復(fù)雜物質(zhì)的酶類(lèi)。 幾個(gè)重要概念： 基因突變：簡(jiǎn)稱(chēng)突變，是遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳性的變化，可自發(fā)或 誘導(dǎo)產(chǎn)生。 野生型菌株：從自然界分離到的菌株，簡(jiǎn)稱(chēng)野 生型。 突變株：即野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀 的菌株。 第二節(jié)基因突變和誘變育種 一、基因突變 （一）突變類(lèi)型 根據(jù)突變的菌株能否在選擇性培養(yǎng)基上 加以鑒別，可分為：選擇性突變和非選擇性 突變兩大類(lèi)。前者在選擇性培養(yǎng)基上通過(guò)表 型就可以區(qū)別開(kāi)，主要有：營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗 性突變型、條件致死突變型；后者在選擇培 養(yǎng)基上不能用表型區(qū)別開(kāi)，主要有：形態(tài)

6、突 變型、抗原突變型、產(chǎn)量突變型。 選擇性突變 營(yíng)養(yǎng)缺陷型：由于野生型基因發(fā)生突變，而喪失了合成某 一種或某幾種生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸的能力，無(wú)法在基 本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，此類(lèi)菌株稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 抗性突變型：由于基因突變，野生型菌株產(chǎn)生了對(duì)某種理 化因子抗性的突變類(lèi)型。如一些抗生素抗藥性菌株。 條件致死突變型：菌株在基因突變后，在一定條件下可正 常地生長(zhǎng)、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一條件下卻 無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖，這類(lèi)突變類(lèi)型稱(chēng)為條件致死突變型。例 如：某些T4噬菌體突變株在25 下可感染其宿主E.coli， 而至37時(shí)卻不能感染。 非選擇性突變 形態(tài)突變型：指?jìng)€(gè)體形態(tài)或群體形態(tài)因突變而 與野生型

7、不同。例如： S形菌落突變?yōu)镽形菌 落，鞭毛有無(wú)或莢膜有無(wú)的突變。 抗原突變型：由于突變使抗原結(jié)構(gòu)與野生型不 同。如：細(xì)胞壁缺陷變異（如L型細(xì)菌）。 產(chǎn)量突變型：通過(guò)基因突變而獲得在代謝產(chǎn)物 產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。若產(chǎn)量 顯著高于原始菌株者稱(chēng)正突變，反之則稱(chēng)負(fù)突 變。 突變率：某一細(xì)胞（或病毒粒子）在某一世代中 發(fā)生某一性狀突變的幾率。 如突變率為10-8表示細(xì)胞在1億次分裂過(guò)程中， 會(huì)發(fā)生1次突變。 突變是獨(dú)立發(fā)生的，互相不影響，同一細(xì)胞 中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)或兩個(gè)以上突變的幾率極低。 雙重或多重突變的幾率是各個(gè)基因突變幾率 的乘積。 （二）突變率 自發(fā)性：是在沒(méi)有人為干涉的條件下產(chǎn)生

8、的突。 不對(duì)應(yīng)性：指突變性狀與引起突變的原因之間無(wú)直接的對(duì) 應(yīng)關(guān)系。 稀有性：一般突變尤其是自發(fā)突變，幾率極?。◣茁蕿?10-6-10-9）。 獨(dú)立性：某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。 可誘變性：使用誘變劑，可顯著提高突變幾率，在遺傳育 種上較常用。 穩(wěn)定性：突變后的新性狀可以穩(wěn)定地遺傳給下一代。 可逆性：由野生型基因變異為突變型基因，稱(chēng)正向變異。 由突變型基因返回到原始的野生型基因，稱(chēng)回復(fù)突變。 （三） 突變的特點(diǎn) 7個(gè)共同點(diǎn)： （四）基因突變自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)證明 變量試驗(yàn) 大腸桿菌稀釋培養(yǎng)物 10 ml 10 ml (在同一個(gè)大管中作整體培養(yǎng))(培養(yǎng)前先分成50小管) 3 7

9、 1 4 4 3 5 抗噬菌體菌落數(shù) 抗噬菌體菌落數(shù) 涂布試驗(yàn) 涂布敏感菌5104個(gè) 共12個(gè)平板 5104個(gè)菌落 5000個(gè)細(xì)菌/菌落 6個(gè)平板共353個(gè)菌落 6個(gè)平板共28個(gè)菌落 噴入T1保溫重新涂布后 噴入T1保溫 結(jié)論：該抗性突變發(fā)生在與噬菌體T1接觸之前，噬 菌體的加入只起到甄別該類(lèi)自發(fā)突變是否發(fā)生、存 在，決不是誘發(fā)該類(lèi)突變的原因。 影印培養(yǎng)試驗(yàn) 原始敏 感菌種 影印培養(yǎng) 無(wú)藥 培養(yǎng)基 含藥 培養(yǎng)基 結(jié)論：對(duì)鏈霉素敏感的E.coli K12細(xì)胞在未接觸過(guò)任何一點(diǎn) 鏈霉素的條件下，由1245689 1012的移種可篩選出大量抗鏈霉素的突變株。 ( (五）基因突變的機(jī)制 突變機(jī)制是多樣

10、性的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，具體見(jiàn) 下圖。 誘發(fā)突變：簡(jiǎn)稱(chēng)誘變，指通過(guò)人為的方法，利用物 理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變幾率 的手段。 1.1.誘變機(jī)制 誘變劑：能夠提高突變幾率的任何因素。 堿基的置換 移碼突變 染色體畸變 （1 1）堿基置換 它只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換，屬 于典型的點(diǎn)突變。 嘌呤置換嘌呤（嘧啶置換嘧啶）轉(zhuǎn)換 嘌呤置換嘧啶或者嘧啶置換嘌呤顛換 A . T A . T A . T G . C A . BU 酮式 G . BU 烯醇式 G . C A . BU G . BU A . BU G . C A . T 烯醇式 酮式 （2 2）移碼突變 指誘變劑使DNA序

11、列中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè) 核苷酸增加或減少，從而使該部位后面的全 部遺傳密碼的閱讀框架改變，引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn) 譯錯(cuò)誤的一類(lèi)突變。 移碼突變屬于DNA的輕微損傷，也是一種 點(diǎn)突變，由移碼突變所產(chǎn)生的突變株稱(chēng)為移 碼突變株。 移碼突變的幾種情況如下圖示 移碼突變的結(jié)果：正常鏈上增加或是缺失1、2或4、5個(gè) 堿基時(shí)，均可引起移碼突變，而增加或缺失3或6個(gè)不影 響讀碼，只引起較短的增加或缺失。 （六）紫外線(xiàn)對(duì)DNADNA的損傷及其修復(fù) 二、突變與育種 （一）自發(fā)突變與育種 從生產(chǎn)中育種 在利用微生物進(jìn)行大生產(chǎn)的過(guò)程中，微 生物會(huì)以10-6左右的突變率自發(fā)突變，其中 可能出現(xiàn)一定幾率正突變株。 2)定向培育優(yōu)良

12、菌株。 利用自然突變，對(duì)微生物群體采用特定 的選擇條件選育出優(yōu)良菌株。但總的來(lái)說(shuō)， 方法古老，自發(fā)突變的目的性不強(qiáng)，周期 長(zhǎng)。 （二） 誘變育種 誘變育種是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理 均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯 著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選 方法， 從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科 學(xué)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。（無(wú)目的的誘變，有目 的的篩選） 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 出發(fā)菌株 計(jì)算出 誘變 大多死亡 少數(shù)存活 存活率 多數(shù)未變 少數(shù)突變 突變率 多數(shù)負(fù)變 少數(shù)正變 正變率 多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 高產(chǎn)率投產(chǎn)率 多數(shù)不宜投產(chǎn) 少數(shù)適宜投產(chǎn) 2 2、誘變育種應(yīng)考慮的幾個(gè)

13、原則： 選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑，如紫外線(xiàn)、激光和離子 束，烷化劑、堿基類(lèi)似物等。 艾姆斯試驗(yàn)(Ames test(Ames test）：是一種利用細(xì)菌 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來(lái)檢測(cè)環(huán)境或食品中是否 存在化學(xué)致癌劑的簡(jiǎn)便有效的方法. . 利用微生物營(yíng)養(yǎng)缺陷型（hishis ）的回 復(fù)突變來(lái)檢測(cè)環(huán)境或食品中化學(xué)致癌劑。（“三 致”致癌，致畸，致突變） 艾姆斯試驗(yàn)(Ames test(Ames test）：是一種利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷 型的回復(fù)突變來(lái)檢測(cè)環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑 的簡(jiǎn)便有效的方法. . 利用微生物營(yíng)養(yǎng)缺陷型（hishis ）的回復(fù)突變來(lái)檢測(cè) 環(huán)境或食品中化學(xué)致癌劑。（“三致”致癌，致畸，

14、致突 變） 保溫 可疑“三致”試樣 鼠肝勻漿 （含羥化酶） 吸入 濾紙片 S.t.his 陽(yáng)性陰性 S.t.his 回變 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株。 A.A.選生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株; ; B.B.已具有優(yōu)良性狀的菌株; ; C.C.對(duì)誘變劑敏感性較高的菌株等。 處理單細(xì)胞或單孢子懸液。 目的：使每個(gè)細(xì)胞均勻接觸誘變劑并防止長(zhǎng)出不純 菌落。 選用最佳誘變劑量。 紫外線(xiàn)的劑量指強(qiáng)度與作用時(shí)間之乘積; ;化學(xué)誘變 劑的劑量則以在一定外界條件下，誘變劑濃度與處理時(shí)間 來(lái)表示。 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)。 該法包括同一誘變劑的重復(fù)使用，兩種或多種誘變 劑的先后或同時(shí)使用。 利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量之間相關(guān)

15、指標(biāo)。 如淀粉水解試驗(yàn)，就是利用淀粉酶變色圈（用碘 液顯色）的大小來(lái)估計(jì)突變代謝產(chǎn)物量的多少。 設(shè)計(jì)或創(chuàng)造高效篩選方案。 如在實(shí)際中，篩選工作常分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn) 行。 3 3、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選（重點(diǎn)） 1 1）與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類(lèi)培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基（MMMM，-）：僅能滿(mǎn)足某一微生物的野生 型菌株生長(zhǎng)所需要的最低成分的組合培養(yǎng)基，（該培養(yǎng) 基都是人工培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能在其上生長(zhǎng)）。 完全培養(yǎng)基（CMCM，+）：所有營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株均可在 其上生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。 一般地，完全培養(yǎng)基是天然或半人工合成的。 補(bǔ)充培養(yǎng)基（SMSM，AA、BB或ABAB）：凡只能滿(mǎn)足相應(yīng) 的營(yíng)養(yǎng)

16、缺陷型突變株生長(zhǎng)需要的組合或半組合培養(yǎng)基 2 2）與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類(lèi)遺傳型個(gè)體 野生型：從自然界分離到的沒(méi)有發(fā)生過(guò)任何 突變，可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型：野生型菌株因?yàn)橥蛔?，失去了?成某種酶的能力，使得該酶產(chǎn)物不能產(chǎn)生，只能在 加有這種產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。 該型不能在-上生長(zhǎng)，只能在+或相應(yīng)的補(bǔ) 充培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。該型非自身合成。 原養(yǎng)性：營(yíng)養(yǎng)缺陷型經(jīng)回變或其他的基因改 造，回復(fù)為與野生型相同的形狀的菌株. .（與野 生型從現(xiàn)象上無(wú)任何區(qū)別。） 3 3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選方法 一般要經(jīng)過(guò)誘變、淘汰野生型、檢出和鑒定營(yíng) 養(yǎng)缺陷型四個(gè)步驟 。 u 步 誘變劑處理

17、：與一般誘變處理相同 u 步 淘汰野生型（即篩選出基因突變的類(lèi)型），現(xiàn)舉兩種方法。 A A抗生素法（最常用）。 a a青霉素：抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，故可殺 死生長(zhǎng)、繁殖狀態(tài)的細(xì)菌，對(duì)休眠狀態(tài)的無(wú)用。 方法：將誘變后的菌培養(yǎng)到含青霉素的基本培養(yǎng)基上， 即野生型被淘汰，留下的為休眠狀態(tài)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 b b制霉菌素：主要與真菌細(xì)胞膜上的甾醇作 用，引起膜損傷。 方法：將誘變后的孢子培養(yǎng)到含制霉菌素的基本培 養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌絲者為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。 B B菌絲過(guò)濾法：適用于進(jìn)行絲狀生長(zhǎng)的真菌和 放線(xiàn)菌。其原理是：在基本培養(yǎng)基中，野生型菌株 的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型的孢子則不能。 可用大孔

18、擦鏡紙反復(fù)過(guò)濾篩選出。 A A夾層培養(yǎng)法（“三明治”狀） u步 檢出缺陷型 現(xiàn)舉出四種方法： 小菌落是第二次長(zhǎng)起 來(lái)的（營(yíng)養(yǎng)缺陷型） B B限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 在基本培養(yǎng)基上，加微量的天然成分（不同于補(bǔ)充培養(yǎng)基）， 營(yíng)養(yǎng)缺陷型形成微菌落，而野生型形成正常大小的菌落。 微量蛋白質(zhì)的完全培養(yǎng)基上 小菌落是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株 C C逐個(gè)檢出法 將誘變處理的細(xì)胞涂在含有完全培養(yǎng)基的平板，長(zhǎng) 成菌落，再將其接種至基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)菌落（為營(yíng)養(yǎng)缺陷型）。 含誘變劑的液體培養(yǎng)基 菌種 涂布 培養(yǎng) 基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)菌落 完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 D D影印平板法 完全培養(yǎng)基 影印接種 基本培養(yǎng)基 將誘變處理的細(xì)胞涂不于含有完全培養(yǎng)基的平 板，長(zhǎng)出菌落，利用影印接種工具將該菌落轉(zhuǎn)移到