人血管生成素樣蛋白4說明書

1、人血管生成素樣蛋白 4 ELISA 檢測試劑盒 日本 IBL編號: 27749 簡介 血管生成素樣蛋白 4 （ANGPTL4） 是 ANGPTL 蛋白家族成員之一，由 406 氨基酸 組成。它包含一個 N 末端螺旋域，聯(lián)結子和 C 末端纖維蛋白原樣域，是一種分 泌信號多肽，蛋白組構與血管生成素相似。 ANGPTL4 是由肝臟和脂肪組織分泌， 并裂解產(chǎn)生循環(huán)CCD和FLD碎片。ANGPTL4在脂質和葡萄糖代謝過程中發(fā)揮 至關重要的作用。 并且它可通過損壞調節(jié)器分子來抑制脂蛋白脂酶活性， 進而提 高血漿中甘油三酯的濃度。 同時它可由血管完整性調節(jié)， 從乳癌細胞中轉移至肺。 試劑盒采用兩種抗體，分別

2、特異性地識別人血管生成素樣蛋白 4 的 N 末端片段 實驗原理 此試劑盒是一種夾心法的 ELISA 試劑盒，使用了兩種高特異性的抗體。 TMB 作 為顯色劑，顯色的強度與人樣品中 ANGPTL4 的量成正比 檢測范圍 : 23.44 T,500 pg/mL 預期用途 此日本 IBL 檢測試劑盒能用于人血清， EDTA 血漿中人血管生成素樣蛋白 4的定 量檢測 有些正常個體，血液樣品會低于檢測靈敏度 當要檢測細胞培養(yǎng)基，由于試劑盒檢測一些 FBS （FCS）樣品，會檢測到很高水 平的ANGPTL4，樣品必須進行適當?shù)那皽蕚?。（如陰性培養(yǎng)基質控等） 試劑盒組成 1. 微孔板： 包被有抗人ANGPT

3、L4（K3-21A1A）小鼠IgG單抗，親合純化96孔x 1 2. 標記抗體： （30倍濃縮），HRP標記抗人 ANGPTL4 （K2-19A1A）小鼠IgG，親合純化0.4mlx 1 3. 標準品：重組人全長 ANGPTL40.5mL x 2 4. EIA 緩沖液：30mL x 1 5. 標記抗體稀釋液：1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS12mL x 1 6. 顯色劑： TMB 底物液15mL x 1 7. 終止液： 1N 硫酸12mL x 1 8. 洗滌緩沖濃縮液 :（40倍濃縮）， 0.05%吐溫 20的磷酸緩沖液 50mL x 1 移液器和槍頭 去離子水 坐標紙（對數(shù) /對數(shù)

4、） 試管（用于標準品稀釋） 操作指南 實驗所需材料但試劑盒未提供 酶標儀（ 450nm） 量筒和燒杯 冰箱（4C） 吸水紙 孵箱（37 C） 洗瓶（用于洗板） 一次性微移液管 試劑準備 1. 洗滌緩沖液制備： 此洗滌液是一種40倍濃縮液。先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸 取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應保存于冰箱 內，并于2周內用完 2. 稀釋標記抗體的制備： 標記抗體是一種30倍濃縮液，用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋 30倍，即得。 例：如果只測一條板，8孑L，則需要標記抗體800ul(30ul的標記抗體+870ul 的標記抗體稀釋液，混勻，使用時

5、每孔加100ul) 濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗 剩余的濃縮標記抗體應裝于密封瓶內，保存在4C 3. 標準品的制備： 吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內，充分混勻，得到3,000 pg/mL的人 ANGPTL4標準品 4.標準品的稀釋： 準備8個試管用于標準品的稀釋，每管加入 230ul的EIA緩沖液 每管的濃度如下 1號管 2號管 3號管 4號管 5號管 6號管 7號管 8號管 1,500 pg/mL 750 pg/mL 375 pg/mL 187.5 pg/mL 93.75 pg/mL 46.88 pg/mL 23.44 pg/mL 0pg/ml （試驗樣品空白） 吸取230ul的

6、標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次 連續(xù)進行2倍比稀釋，7管標準品范圍為23.44 - 1500pg/mL.第8管為樣品空白， 濃度為0 pg/mL 230 pL s：a(riafd 詛u血門 麗嗆HHQyHyHH 12 -a 總：肓 z 5 Cone. (pg/mL) .500 750 375 燉5 出耳追S8 蓉3 0 5.樣品稀釋： 樣品如需稀釋，必須用 EIA緩沖液稀釋，若預先不知樣本濃度的大概范圍，則 需對的樣本進行幾個不同稀釋比例預實驗，然后確定最佳稀釋比例 實驗步驟 使用前，所有試劑應平衡至室溫，大約 30mi n,然后充分混勻，確保試劑質量無 變化，

7、標準曲線和樣品檢測同時進行 試劑 檢測樣品 標準品 樣品空白 試劑空白 檢測樣品 100ul 稀釋標準品（1-7 管）100ul EIA緩沖液（第8 管）100ul EIA緩沖液 100ul 蓋板，37C下溫育60min 洗板7次 酶標抗 體 100ul 100ul 100ul - 蓋板，4C下溫育30min 洗板9次 顯色劑 100ul 100ul 100ul 100ul 室溫避光溫育30min 終止液 100ul 100ul 100ul 100ul 加終止液后，30mi n內，以試劑空白作參比 于酶標儀450nm處讀取OD值 1）確定試劑空白孔，并加入100ul EIA緩沖液。 2） 取1

8、00ul樣品空白（8號管），檢測樣品和標準品（1 - 7號管）加入到相應的 微孔中。 3）蓋板，37 T下溫育60min 4） 用洗滌瓶劇烈洗板，在微孔中加入洗滌液，浸泡 15-30秒，棄去洗滌液。重復 7次，最后在吸水紙上拍干，去除殘留液滴 如果使用自動洗板機，先用自動洗板機洗 4次，再按上述手工用洗瓶洗3次 5）除試劑空白對照孔外，其余每孔加100ul酶標抗體， 6）蓋板，4C下溫育30min 7）按照步驟4）洗板9次 8） 將所需量的顯色劑加入到試管中，然后在每一微孔中加入100 ul顯色劑。為了 避免污染，請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。 9）室溫避光（黑暗處）溫育30min,加入顯

9、色劑后溶液顏色會變成藍色 10）在每孔加100 ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色 11）擦去微孔板底部的污垢或水滴，確保溶液表面無氣泡產(chǎn)生。終止液加入 后，30min內，在酶標儀450nm處讀數(shù) 特別注意 1試驗樣品采集后應立即檢測或是凍存，凍存的樣品避免反復凍融，檢測前應 在低溫下先將其完全溶解混勻 2試驗樣品如需稀釋，必須用EIA緩沖液稀釋 3. 試驗樣品和標準品建議做雙份檢測 4. 試驗樣品應在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測 5. 只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導致試驗失敗 6. 在吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭孔壁 7. TMB底物液應貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避

10、免接觸金屬 8. 加入終止液后，30min內必須于酶標儀讀數(shù) 結果計算 繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應減去試驗樣品空白值，包括標準品和未知的樣品。 以標準品的0D值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標紙上描點，繪制光滑標準曲線，從標 準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度 標準曲線示范 Cone. (pg/mLJ Absorbanoe i450nm 1.500 2.460 750 1 364 375 0.705 167.5 0.401 938 0.212 46 B8 0.125 23.44 0.070 0 (T *5t Sarrzle 6-lank) 0.023 t才PT L4 二tu.” 典型標準曲線僅供演示說明用

11、，不能用于數(shù)據(jù)的獲取。每次實驗必須建立標準曲 線。 性能指標 1回歸檢測結果 Specimen Theoreti csl Value (pgjmL ? Llessjnernent Value (pg mL % 509.00 444.57 114 5 Human Seruir 2S2.7S 257.0? 113. 171.20 163.32 104.& 120 57 116.44 105 5 472 52 442.59 1069 rtjrrian Plasnra 26S21 255 C9 104 4 (EDTAHx2) 173 84 r 61.34 1078 1T075 114.46 102.0

12、 tS27 04 1 573.50 IIS 1 10%FOS added 1282.89 11D8.SO 1054 RPM 1*1640 (x4) 1038 31 1011.00 102 7 927.70 & 17.25 101,1 2板內差 Measurement 叮日 ue tpq.irL- SO value CV value (%) n 501 49 44.20 146.49 1302 S 9 3&.04 4 13 10 6 26 3板間差 Measure me nt 曲 ue (pg/mL SO lue CV value (%) n 600 62 57 &6 97 6 170.66 1

13、5.06 a.B e 39 4 1 93 49 6 4特異性 Cofnpdund Crass Reactivity Human ANGP7L4 100 % Human ANGP TL2 c0.1 % Human ANGP TL3 0.1 % 5靈敏度 17.53 pg/mL 靈敏度是根據(jù)實驗室標準委員會（NCCLS ）標準測得 常規(guī)處理注意事項 1所有試劑置于2 - 8C保存.實驗前將試劑平衡至室溫（約30分鐘） 2瓶裝標準品是凍干品，故小心打開瓶蓋 3終止液是強酸物質.使用時，避免其接觸皮膚和衣膚. 4棄置用過的物質前，用水沖洗 5濃縮酶標抗體可能會出現(xiàn)沉淀，但這并不會影響實驗 6使用試劑后應洗手 7切勿混用不同批