醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文-123

1、溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)科科研項目項目名稱：申請者:所在學(xué)申請日期溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)科科研項目申請書簡表項目名稱研究性質(zhì)包基礎(chǔ)研究應(yīng)用研究實驗發(fā)展起止年月2011-6-15 至 201牛6J申請金額50000密級機密秘密內(nèi)部包一般姓名蔣淑麗性別女出生年月1989. 7政治面貌預(yù)黨民族漢職稱學(xué)歷本科學(xué)位學(xué)士部門部門電話家庭電話手機E-Mail究項U申請人研究類別隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤基因治療實驗研究和臨床應(yīng)用都有了很大 進步，而對膀胱癌的研究有助于其他部位癌癥研究的發(fā)展。從其理論基礎(chǔ)和 相關(guān)實驗硏究進展進行了分析，并就腫瘤基因治療的新途徑、取得的主要成 就、存在的問題及展望進行了綜述。關(guān)鍵詞 色素上皮衍生因子

2、 膀胱癌色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表達(dá)及其對膀胱癌治療作用的研究立論依據(jù)一、趨勢判斷和需求分析國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢（含知識產(chǎn)權(quán)狀況和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)狀況）；經(jīng)濟建設(shè)和社會發(fā)展需求： 科學(xué)技術(shù)價值、特色和創(chuàng)新點。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi)統(tǒng)計其發(fā)病率占全身腫瘤的第8位，在男性其標(biāo) 準(zhǔn)發(fā)病率9.9/10萬：在女性，其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率為2.3/10萬，占第25位。死亡率在男性為4.2/10萬，占全身腫 瘤死亡率的第9位，在女性為1.1/10萬，占第16位。在我國，膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤，占全 身惡性腫瘤的3.2%, 1995年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為7/10

3、萬人，上海市城區(qū)發(fā)病率為&6/10萬 人1，且今后發(fā)病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機制和治療方而的 研究始終是臨床基礎(chǔ)研究的重點之一。目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措 施，但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá)80%,其中大約16%-25%復(fù)發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有10%發(fā)展為浸潤性或轉(zhuǎn)移性癌，因此，尋找一種新的、更有效的生物 治療方法，是當(dāng)前臨床迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中，無論是化療還是免疫治療，主要機制是通過直接殺死腫瘤細(xì) 胞、阻斷腫瘤細(xì)胞分裂或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

4、的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實體性腫瘤生長，腫瘤細(xì)胞的 增殖固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài) 下，人體內(nèi)的脈管系統(tǒng)在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡(luò)式的相互作用下處于平衡狀態(tài)：病理狀態(tài)下，尤 苴是發(fā)生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當(dāng)腫瘤生長達(dá)到腫瘤組織超過2mm時就會有新 生血管形成，如果沒有新生血管生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止2, 3?？寡苌莎煼ㄊ遣?同于目前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策略，具有髙效低毒和不易產(chǎn)生耐藥性的特點4。有關(guān)血管生長因子 和血管生長抑制因子在腫瘤中所起作用，以及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤

5、研究的一個熱 點。近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子（pigmcmepitheliumderivedfactor.1/2PEDF)是一種對腫瘤有抑制作用的細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子是Tombran-Tink等在實驗中發(fā)現(xiàn)的，由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，分子雖:為50KD5,屬于scrpin卵白蛋白/PAT-2亞群，其基因全長16 kb,位于染色體17pl3.1-pter。多項研究表明，PEDF是一種天然的高效的新生血管抑制劑7,并通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化起到抑制腫瘤 生長的作用。Tombran-Tink等將PEDF基因立位于染色體17pl3.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關(guān)系密切，提示該基因可能是抑癌基

6、因或腫 瘤相關(guān)基因5。對腫瘤細(xì)胞進行編碼PEDF的腺病毒轉(zhuǎn)染，在血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growthfactor, VEGF)存在的情況下，PEDF明顯阻止了血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成和遷移。對想有CNV/AMD患者 的體外實驗也發(fā)現(xiàn)，PEDF大量減少的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞有明顯遷移;而對照組含有正常水平PEDF,則抑制 了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移6。Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中是腫瘤細(xì)胞分化調(diào)控的主要的抗血管生 成的抑制劑7。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)展中，PEDF作為VEGF的拮抗因子，起到了抑制作用。對 裸小鼠的在體實驗以及鼠的肺癌模型也同樣證明了PEDF

7、對腫瘤的抑制作用。其機制乃因PEDF減少腫瘤 微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長，在腫瘤的治療前景上非常 樂觀8。我們最近對PEDF在膀胱癌中表達(dá)情況的初步研究發(fā)現(xiàn)，PEDF任膀胱癌組織中表達(dá)明顯低于正常膀胱組 織，而且PEDF表達(dá)情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負(fù)相關(guān)，提示PEDF在膀胱癌的 發(fā)生、發(fā)展中具有一龍的作用，PEDF的正常表達(dá)可能抑制膀胱癌細(xì)胞的生長、增殖，PEDF有可能成為 膀胱癌生物學(xué)治療的一種有效的新方法。目前國內(nèi)、外尚未見此項研究的相關(guān)報道。因此我們設(shè)想，擴 大樣本量，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF的

8、表達(dá)水平，進一步研究PEDF 在膀胱癌中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料分析PEDF表達(dá)與膀胱癌分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系；通 過研究膀胱癌組織中PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，PEDF與血小板反應(yīng)素-1表達(dá)的相關(guān)性，探討膀癌組織中PEDF表達(dá)與腫瘤血管形成的相關(guān)性及可能的作用機制；通過研究PED F表達(dá)與金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的相關(guān)性，探討PEDF表達(dá)與膀胱癌浸潤的相關(guān)性：通過研究PEDF表達(dá)與已知的對腫瘤生長有明確 調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子a (TNF-a)、白細(xì)胞介素la (IL-la)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)和白介素8 (IL-8)等細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性，探討P

9、EDF表達(dá)對膀癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機制，從而探討PEDF在膀胱癌發(fā) 生、發(fā)展過程中的可能作用機制：任此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞 株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進一步探討PEDF表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用以及對膀胱 癌的治療效果，為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種有效的新方法。參考文獻吳階平，吳階平泌尿外科學(xué)，山東科學(xué)技術(shù)岀版社，2004.5： 898-917二、研究內(nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵研究的總體目標(biāo)：(1)研究PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展 及轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機制。(2)研究PEDF對膀胱癌細(xì)胞的治

10、療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法研究的創(chuàng)新點：本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的英他研究，應(yīng)用分子生物學(xué)方法從研究PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā) 生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系入手，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能的作用機 制。在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱 癌模型，探討PEDF對膀胱癌的治療作用。目前，本項研究國內(nèi)、外尚未見報道。本研究的順利完成， 將為膀胱癌的生物學(xué)行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種新的有效方法。研究的主要內(nèi)容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相

11、關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF表達(dá)狀況，并檢測VEGF、TSP-1、MMP-9, TNF-a、IL-la、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)和IL-8的表達(dá)狀況：采用免疫組化技術(shù)檢測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度(microvascular density, MVD),分析PEDF與VEGF、TSP-1、MMP-9 TNF-ct、IL-la、血栓調(diào) 蛋白和IL-8表達(dá)的相關(guān)性，PEDF與MVD的相關(guān)性：并結(jié)合臨床資料分析研究PEDF表達(dá)與膀胱癌想者5年生存率之 間的關(guān)系；闡明PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)

12、移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌 發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株作為對照，觀察檢測VEGF、TNF-a的表達(dá)情況及膀胱癌細(xì)胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白(購自吉泰生物科技有限公司) 宜接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內(nèi)作為治療組，以未注射PEDF組為陰性對照組。觀察各組的MVD. VEG F及腫瘤增殖情況，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，評估PEDF對膀胱癌的治療效果， 為進一步過度到臨床應(yīng)用提供依據(jù)。需要解決的技術(shù)

13、關(guān)鍵：(1) 連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染成功率。(2)PEDF左量檢測：我們已有對前列腺癌、腎癌、膀胱癌等組織標(biāo)本的PEDF定量分析的基礎(chǔ)，已形成較成 熟技術(shù)條件、設(shè)備和研究經(jīng)驗。(3)膀胱癌裸鼠模型的構(gòu)建。我們已有成功構(gòu)建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗。研究方法：方法(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究:實驗組對照組膀胱癌組織非癌膀胱組織標(biāo)本B 期z癌旁膀胱組正常膀胱組炎性膀胱組A期C期 D期織織織例數(shù)320120 .應(yīng)用SYBR Green I實時左量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)技術(shù)，對膀胱癌、非癌膀胱組織

14、中PEDF進行定量測定。 .Western blot 法檢測 VEGF、TSP-l、MMP-9。 .ELISA法檢測TNF-a、IL-la.血栓調(diào)肖蛋白、IL-8濃度。 .免疫組化方法檢測標(biāo)本MVD。 .整理臨床資料：膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否轉(zhuǎn)移、5年生存率。 .數(shù)據(jù)統(tǒng)汁分析(使用SPSS統(tǒng)計分析軟件):PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。PEDF與TSP-1表達(dá)的相關(guān)性PEDF勺MMP-9表達(dá)的相關(guān)性PEDF與TNF-a. IL-la、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度的相關(guān)性。PEDF與組織MVD相關(guān)性。PEDF與膀胱癌分期的相關(guān)性。PEDF 膀胱癌惡性程度(分級)的相關(guān)性。P

15、EDF 與膀胱癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關(guān)性。方法(2) PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療：以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞作為對照，檢測 VEGF、TNF-a濃度，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡情況，分析相關(guān)性。.以RT- PCR法擴增PEDF基因。 .將擴增后的PEDF基因連接入腺病毒載體，轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞。并以空載轉(zhuǎn)染為對照。 . Western blot法檢測VEGF、TSP-l、MMP-9表達(dá)。 .觀察膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡情況。 .統(tǒng)計分析。方法(3) PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。

16、以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi) 作為治療組，以未注射PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織MVD、VEGF表達(dá)情況、腫瘤增殖情 況，評價PEDF對膀胱癌的治療效果。 .以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型。 .將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。 .應(yīng)用免疫組化方法檢測MVD;應(yīng)用Western blot法檢測VEGF. TSP-l、MMP-9：觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與VEGF的相互作用關(guān)系及其對腫瘤生長的作用機制。技術(shù)路線：(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究：膀胱癌標(biāo)本120例癌旁膀胱組織標(biāo) 本120例正常膀胱組織標(biāo) 本

17、120例炎性膀胱組織標(biāo) 本120例1RT-PCR 檢測 PEDF mRNA表達(dá)Western blot 法檢測 VEGF、 TSP-ELISA法檢測TNF-a、IL-la、血栓調(diào)節(jié)蛋白免疫組化方法檢測 標(biāo)本微血管密度 (MVD)結(jié)合臨床資料，數(shù)拯統(tǒng)訃分析(2) PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療：將PEDF轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，檢測VEGF、TSP-l、MMP-9、TNF-a濃度，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡1 /2RT PCR法擴增PEDF基因情況。結(jié)果分析（3） PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：觀察PEDF與VEGF、MVD相關(guān)性及其對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用I構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型I注射PEDF貴白未注射（對

18、照）先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基M研究（包括勞子生物學(xué)研究）和I缶床研究,如：裸鼠膀胱腫瘤凋亡、增 殖、侵襲情況癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系、VEGF表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系 等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究的技術(shù)方法，如RT-PCR、southern、northern雜交、DNA測序、擁有獨立的泌尿外科免疫、病理、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實驗 室，實驗室設(shè)備完善，技術(shù)方法先進，擁有PCR-擴增儀、酶標(biāo)儀、各種電泳槽、凝膠成像設(shè)備、細(xì)胞房及各種基礎(chǔ)實驗設(shè)備等，為本課題的順利進行提供 了有力的技術(shù)和儀器設(shè)備保證。細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒載體

19、構(gòu)建等技術(shù)，積累了較豐富的研究經(jīng)驗。最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織中PDEF表達(dá)的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱癌組織 中PDEF表達(dá)的檢測方法，對本課題的順利進行提供了便利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正常膀胱 組織PEDF表達(dá)情況的對照性研究，初步結(jié)果顯示如下：（1）龍量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見：PEDF在正常膀胱組織中高表達(dá)，而在膀胱癌組織中表達(dá)明顯降低（見圖1）。M N1 N2 N3 T1 T2 T31 M0進度安排100500250MXPEDFGAPDH（2）注：Nl, N2N3：正常膀胱組織TL T2T3：膀胱癌組織GAPDH：內(nèi)參照M：為標(biāo)記分子址恪11:正常膀

20、胱組織與膀胱癌組織PEDF立量PCR2013-3 至 2014-6PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療預(yù)期成果：（1）明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達(dá)情況以及其與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。（2）PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。（3）PEDF對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨床應(yīng)用提供強有力的實驗依據(jù)。成果以論文的形式表達(dá)，并申請“PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術(shù)”的專利；擬發(fā)表論著57篇，其 中國內(nèi)權(quán)威雜志4一5篇，SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒左。本課題實施過程中，形成一整套的細(xì)胞因子檢測方法、膀胱癌細(xì)胞株培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì) 胞技術(shù)、裸鼠膀胱癌模型的建立及PEDF治療裸鼠膀胱癌模型等方