第二章基因工程中常用的工具酶

1、第二章 基因工程中常用的工具酶 限制性內(nèi)切酶 主要用于 DNA 分子的特異切割 DNA 甲基化酶 用于 DNA 分子的甲基化 核酸連接酶 用于 DNA 和 RNA 的連接 核酸聚合酶 用于 DNA 和 RNA 的合成 核酸酶 用于 DNA 和 RNA 的非特異性切割 核酸末端修飾酶 用于 DNA 和 RNA 的末端修飾 其它酶類 -用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。 2-1 核酸內(nèi)切限制酶定義： 核酸內(nèi)切限制酶是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子中的某種特定核苷酸序列，并由 此切割 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。2300 種以上不同的核酸內(nèi)切限制酶。到目前為止已經(jīng)從許多種不同的微生物中分

2、離出了核酸內(nèi)切限制酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能(圖)、限制修飾系統(tǒng)的種類(圖)二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名1. 定義： 廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指 II 型限制酶。2. 命名： 限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號(hào)、分離順序。例如：Hi nd川前三個(gè)字母來自于菌種名稱H. influen zae ,圮表示菌系為d型血清型；紅”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI Escherichia coli RIHind川一Haemophilus influensae d 川Sad (II) Streptomyces achromagenes I ( n )三、I型和川型核酸內(nèi)切限制酶的缺點(diǎn)a. I

3、型核酸內(nèi)切限制酶雖然能夠識(shí)別DNA分子中的特定序列，但它們的切割作用卻是隨機(jī)的， 在距特異性位點(diǎn)至少 1000bp 的地方可以隨機(jī)地切割 DNA 分子， 因此這類酶在 基因克隆中顯然是沒有用處的。遠(yuǎn)距離隨機(jī)切割b. 川型核酸內(nèi)切限制酶大約從距離識(shí)別序列25bp處切割DNA分子。一一遠(yuǎn)距離定點(diǎn)切割c. I型核酸內(nèi)切限制酶和川型核酸內(nèi)切限制酶，在切割反應(yīng)過程中，都會(huì)沿著DNA分子移動(dòng)，因此是一種需要能量的過程。一一需要能量的反應(yīng)d. I型和川型核酸內(nèi)切限制酶，一般都是大型的多亞基的復(fù)合物，既具有內(nèi)切酶活性， 又具有甲基化酶活性。一一內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性四、n型核酸內(nèi)切限制酶的特點(diǎn)(1) 基本特

4、點(diǎn)： 在雙鏈 DNA 分子上有一個(gè)特殊的靶子序列，即所謂的識(shí)別序列，并由此切割DNA分子形成鏈的斷裂； 一一識(shí)別序列 2個(gè)單鏈斷裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的； 一一單鏈切割部位 因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片段，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端 此類型核酸內(nèi)切限制酶比較簡單，不需要能量分子 ATP,但需加入Mg+離子，而且是從其識(shí)別序列內(nèi)部切割DNA分子 在結(jié)構(gòu)上是一種單一的成分，即與I型川型酶不同，不具有多種亞基成分；識(shí)別位點(diǎn)又稱切割位點(diǎn)、識(shí)別序列或靶子序列。 絕大多數(shù)H型核酸內(nèi)切限制酶都能夠識(shí)別由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI識(shí)別的序列是

5、GAATTC，我們稱這樣的序列為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文 結(jié)構(gòu)(3)平末端與粘性末端由核酸內(nèi)切限制酶的作用而造成的DNA分子的斷裂作用，通常有下列兩種不同的方式：兩條鏈上的斷裂位置是處于一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，結(jié)果形成一一具平末端的DNA片段。Blunt ends兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)軸排列，結(jié)果形成一一具粘性末端的DNA片段。Cohesive ends粘性末端概念(定義):(圖)*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端的結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的相互作用而重新環(huán)化起來。限制酶的識(shí)別序列與切割頻率具4個(gè)核苷酸組成的識(shí)別序

6、列的限制酶如Sau3A的切割頻率為44=256具由6個(gè)核苷酸組成的識(shí)別序列的限制酶如BanHI的切割頻率為46=4096以上假定條件是，在一條隨機(jī)排列的DNA序列中，假定所有的 4種核苷酸都有同等出現(xiàn)的頻率，那么任何一種4核苷酸或6核苷酸的識(shí)別靶子都有上述的出現(xiàn)頻率。(5)同裂酶(isoschizomers)識(shí)別同樣核苷酸序列的一些來源不同的核酸內(nèi)切限制酶稱為同裂酶。例如Hpal和Mspl就是一對(duì)同裂酶。同裂酶形成同樣的末端。有些同裂酶對(duì)于切割位點(diǎn)上的甲基化堿基的 敏感性有所差別，可用來研究DNA甲基化作用。同尾酶(isocaudamers)一些來源不同、識(shí)別的靶子序列也各不相同，但卻能產(chǎn)生出

7、相同的粘性末端，特稱為同尾酶。例如BamHI、Bgl n、Sau3A等即是一組同尾酶。BamHIGGATCCBgl nAGATCTSau3AGATC*同尾酶在基因克隆中有用處，舉例說明：但產(chǎn)生的重組體中原識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生了變化。(7)識(shí)別多核苷酸序列的酶例如Hind n就是能夠識(shí)別多種核苷酸序列的一種核酸內(nèi)切限制酶:5 -CTPyPuAC-3其Py=嘧啶堿基 C或T; Pu=表示嘌呤堿基 A或G五、影響核酸內(nèi)切酶活性的因素(1)DNA的分子特性a限制酶識(shí)別位點(diǎn)周圍的堿基成分b特定DNA分子中所具有的目標(biāo)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的密度。C.完全消化超盤旋的 DNA要比完全消化等量的線性 DNA需消耗更多的限制

8、酶。d.DNA的甲基化程度完全切割不同來源的 DNA樣品所需的限制酶單位(圖)(2) 酶切消化反應(yīng)溫度a. 最適酶切消化溫度不同的核酸內(nèi)切限制酶的最適的消化溫度是不同的。酶切溫度高于或低于最適溫度，都 會(huì)影響限制酶活性，甚至失活。b. 限制酶的星號(hào)活力限制酶的星號(hào)活力是指在酶反應(yīng)條件發(fā)生改變(變更)的情況下，該酶便失去了識(shí)別其固有的特異序列(識(shí)別位點(diǎn))的能力，而會(huì)在新的識(shí)別位點(diǎn)上發(fā)生DNA分子的切割作用(即識(shí)別序列發(fā)生了改變)。(3) DNA純度酶切反應(yīng)體系中的一些試劑成分，會(huì)改變限制酶的切割特性。因此DNA制劑的純度對(duì)酶的活性會(huì)有很大的影響六、核酸內(nèi)切限制酶對(duì) DNA的消化作用應(yīng)用X射線晶體

9、學(xué)技術(shù)，測定限制酶-DNA復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)的研究，指出n型核酸內(nèi)切酶，是以同型二聚體形式與靶DNA序列發(fā)生作用，以 EcoR I為例，它是以同型二聚體上的6個(gè)氨基酸(每個(gè)亞基各有一個(gè) Glu和2個(gè)Arg殘基)，同識(shí)別序列上的嘌 呤殘基形成12個(gè)氫鍵的形式，而結(jié)合到靶DNA識(shí)別序列并從此發(fā)生鏈的切割反應(yīng)。 2.2 DNA連接酶定義：能催化兩個(gè) DNA片段末端之間-P和-OH基團(tuán)形成磷酸二酯鍵，使兩個(gè)末端連接 的酶稱為 DNA 連接酶(DNA ligase )。目前已經(jīng)知道有四種方法可以在體外將DNA片段連接起來：a. 用DNA連接酶將具有互補(bǔ)粘性末端的片段連接起來b. 用T4 DNA連接酶將平末

10、端的 DNA片段連接起來c. 先在DNA片段兩端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴，然后用 DNA連接酶將之連接起來。d. 先在DNA片段兩端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端，然后再用DNA連接酶將之連接起來。一、連接條件：a.DNA連接酶要求在一條 DNA鏈的3 -末端具有一個(gè)游離的羥基 (-OH)和另一條DNA鏈的5-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P），才能發(fā)揮其連接作用；b.由于在-OH和-P基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種需能的過程（反應(yīng)），因此需要能源分子的存在才能實(shí)現(xiàn)連接反應(yīng)。在大腸桿菌細(xì)胞中連接酶催化的連接能源是：NAD+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化型） 在動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體

11、中，連接酶催化的連接能源是：ATP腺苷三磷酸、最佳連接溫度理論上連接酶體外最佳連接溫度是37 C，但在此溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此實(shí)際上的最佳連接溫度應(yīng)是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般經(jīng) 驗(yàn)認(rèn)為是415C比較合適。、DNA連接酶的反應(yīng)條件（圖）四、末端DNA片段的連接過程（圖） 2.3 DNA聚合酶常用聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I 、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA 聚合酶、T7 DNA聚合酶、修飾的 T7DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等。共同特點(diǎn)：都能夠把將脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸聚合，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況

12、。但大多數(shù)聚合能力差，參入不到10個(gè)核苷酸，就從引物模版解離下來：大腸桿菌DNA聚合酶、Klenow酶、T4 DNA聚合酶。參入數(shù)百個(gè)核苷酸：T7 DNA聚合酶一、大腸桿菌DNA聚合酶I1大腸桿菌DNA聚合酶I 性質(zhì)：5- 3聚合酶活性；5 - 3外切酶活性；3 5外切酶活性聚合作用發(fā)生在引物鏈 3-OH末端同參入的核苷酸之間，當(dāng)這個(gè)外源核苷酸參入之后， 又提供一個(gè)新的3 OH，因此，聚合酶催化的鏈的合成是按5 3方向生長當(dāng)反應(yīng)物中缺乏 dNTPs，表現(xiàn)出3 5外切酶活性，將從游離的3-OH末端逐漸的降解單鏈及雙鏈DNA。2.DNA缺口轉(zhuǎn)移與探針的制備在分子克隆中的主要用途：通過缺口轉(zhuǎn)移，制備

13、供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。原理：5 3外切酶活性從缺口的 5 一側(cè)移去一個(gè)5核苷酸，聚合作用就在 3一側(cè)補(bǔ)上一 個(gè)新的核苷酸。但是聚合酶不能夠在 3-OH和5-P之間形成鍵，因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行，5-側(cè)核苷酸被不斷的移去，3一側(cè)核苷酸又按序的補(bǔ)加，于是缺口沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。一一缺口轉(zhuǎn)移探針制備 （圖）反應(yīng)體系：特定的 DNA ; DNase I; Pol I; 32P dNTPs二、Klenow 酶來源：大腸桿菌 DNA聚合酶I全酶，經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理之后，產(chǎn)生出來分子量為76 x 103dal的大分子功能：5-3聚合酶活性；3-5外切酶活性用途：修補(bǔ)經(jīng)限制酶消化

14、形成的3隱蔽末端標(biāo)記 DNA 片段的末端cDNA 克隆中的第二鏈 cDNA 的合成DNA 序列測定缺點(diǎn)：不能夠有效的標(biāo)記帶有 3突出的 DNA 末端。同位素標(biāo)記 DNA 片段的末端（圖）三、T4 DNA 聚合酶來源： T4 噬菌體感染的大腸肝菌培養(yǎng)物中純化出來的一種特殊的 DNA 聚合酶。它是由 噬菌體基因 43 編碼T4 DNA 聚合酶基本特征（圖）3-5外切酶活性（圖）取代合成法標(biāo)記 DNA 片段（圖）在沒有dNTPs的情況下，3外切酶活性便是 T4 DNA聚合酶的獨(dú)特功能，它作用于雙鏈DNA , 并按 3 5的方向從 3 OH 末端開始降解 DNA。如果反應(yīng)物中只有一種 dNTPs,那么

15、這種降解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的 dNTP互 補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止，從而產(chǎn)生出具有一定長度的 3隱蔽末端 DNA 片段。當(dāng)反應(yīng)物中加 入標(biāo)記的32P-dNTPs，這種局部消化的 DNA片段便起到一種引物模板的作用， T4 DNA 聚合酶的聚合作用超過了外切作用，反應(yīng)物中 32P-dNTPs 逐漸取代了被外切活性刪除掉的 DNA 片段上的原有核苷酸 取代合成。取代合成法制備探針的優(yōu)點(diǎn)： 不會(huì)出現(xiàn)人為的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（用缺口轉(zhuǎn)移法制備的探針則會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)） 應(yīng)用適宜的核酸內(nèi)切限制酶切割，他們便可以很容易地轉(zhuǎn)變成特定序列的探針。四、依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）目前已經(jīng)從許多種

16、RNA 腫瘤病毒中分離到這種酶，但最普遍使用的是來源于鳥類骨髓 母細(xì)胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶。它是由a和B兩條多肽鏈組成的：a多肽鏈具有轉(zhuǎn)錄酶活性 5-3 （聚合活性）和 RNaseH活性。RNaseH活性是由a多肽 鏈經(jīng)蛋白酶水解切割后產(chǎn)生的一種多肽片段，它以5-3或3-5的方向特異的降解RNA-DNA 雜交分子中的 RNA 鏈；B多肽鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的 5-3脫氧核酸外切酶活性它的 53方向的聚合活性， 取決于有一段引物和一條模板分子的存在， 它可以用 mRNA 為模板。以用 mRNA為模板合成cDNA，是反轉(zhuǎn)錄酶的最主要用途。也可以用單鏈 DNA 或 RNA 作模板合成供實(shí)

17、驗(yàn)用的分子探針。圖 1：以 RNA 為模板聚合互補(bǔ) DNA圖 2：雙向外切 DNA-RNA 雜合鏈中的 RNA 鏈五、T7 DNA 聚合酶它是從感染了 T7 噬菌體的大腸肝菌寄主細(xì)胞中純化出來的一種核酸酶。T7DNA 聚合酶是按兩種亞基形式純化出來的 :其中基因 5 蛋白質(zhì)本身是一種非加工的 DNA 聚合酶，具有單鏈的 3-5核酸外切酶活性。 其二，硫氧還蛋白，作為一種輔助蛋白，增加基因5 蛋白質(zhì)同引物模板的親和性，使DNA 的加工合成達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸。此外， T7DNA 聚合酶還具有很高的單鏈及雙鏈的 3-5核酸外切酶活性。T7 DNA 聚合酶的用途 大分子量模板上引物開始的 DNA 延伸合成

18、。合成中，不受 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。同 T4 DNA 聚合酶一樣， T7DNA 聚合酶通過單純的延伸或取代合成標(biāo)記 DNA 的 3-末 端。T7DNA 聚合酶和 T4DNA 聚合酶一樣， 將雙鏈 DNA 的 3和 5 突出末端， 轉(zhuǎn)變成平末端 的結(jié)構(gòu)。 2.4 核酸酶 一、核酸外切酶：一類從多核苷酸鏈的一頭開始按序催化降解核苷酸的酶。 分為單鏈核酸外切酶和雙鏈核酸外切酶 單鏈核酸外切酶：大腸桿菌核酸外切酶1（ exo I）大腸桿菌核酸外切酶（exo Vfl） 雙鏈核酸外切酶：大腸桿菌核酸外切酶川（exo m ）入噬菌體核酸外切酶（入exo ）大腸桿菌核酸外切酶（ exoV）它能夠從5 -末

19、端或3-末端降解DNA分子，產(chǎn)生出寡核苷酸短片段。是一種不需要 Mg2+ 離子的核酸酶 （圖）大腸桿菌核酸外切酶（exo川核酸外切酶川的主要活性是，按3宀5的方向催化雙鏈 DNA自3 -OH末端釋放5-單核苷酸 （圖）入噬菌體核酸外切酶（入exo ）（圖）入核酸外切酶最初是從感染了 入噬菌體的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的。 這種酶催化雙鏈 DNA分子自5 -P末端進(jìn)行逐步的加工和水解， 釋放出5單核苷酸，但它不能降解5 -OH 末端入核酸外切酶的用途有兩個(gè)方面：第一，將雙鏈 DNA轉(zhuǎn)變成單鏈的DNA，供按雙脫氧 法進(jìn)行DNA序列分析使用；第二，從雙鏈 DNA中移去5 突出末端，以便用末端轉(zhuǎn)移 酶進(jìn)

20、行加尾。二、核酸內(nèi)切酶1. S1 核酸酶來自從稻谷曲霉，是一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，它降解單鏈DNA 的速率要比雙鏈DNA快75000倍，酶活性的表現(xiàn)需要 Zn2 + ,最適PH為4.0-4.3。（ 1）主要功能：催化RNA和單鏈DNA分子降解成5、單核苷酸， 作用于雙鏈 DNA 分子的單鏈區(qū)，而且這種單鏈區(qū)可以小到只有一個(gè)堿基對(duì)。圖 1：內(nèi)切單鏈 DNA 或 RNA圖 2：內(nèi)切帶切口的或缺口的雙鏈DNA 或 RNA2）主要用途：測定雜種核酸分子（ DNA-DNA 或 RNA-DNA ）的雜交程度。給 RNA 分子定位。DNA 區(qū)域。測定真核基因中間隔子序列的位置，探測雙螺旋的從限制酶產(chǎn)生

21、的黏性末端中移去單鏈突出序列。打開在雙鏈 cDNA 合成期間形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)等實(shí)驗(yàn)操作。RNA 分子定位 （圖）一個(gè) RNA 分子是由其模板 DNA 中的 4001400之間的核苷酸序列編碼的。這條 RNA 分子同包含核苷酸 400 1400的DNA編碼鏈雜交，然后再用S1核酸酶處理，那么RNA DNA 雜種分子中的單鏈尾巴會(huì)被降解掉，形成一條長度為1000bp 的平末端的 RNADNA 雜種分子，回收這種分子，便可以測定出這段抗 S1 核酸酶的 DNA 片段長度。如果所用的這段 DNA 是放射性標(biāo)記的，其長度可用凝膠放射自顯影測定。2. Bal31 核酸酶來自艾氏交替單胞菌( A.espeji

22、ana) 具有單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性和雙鏈特異的核酸外切酶活性。 當(dāng)?shù)孜锸请p鏈環(huán)形 DNA ，Bal31 的單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性，通過對(duì)單鏈缺口或瞬時(shí) 單鏈區(qū)的降解，將超盤旋的 DNA 切割成開環(huán) DNA ，進(jìn)而成為線性雙鏈 DNA當(dāng)?shù)孜锸蔷€性雙鏈 DNA分子時(shí)Bal31雙鏈特異的核酸外切酶活性，會(huì)從5和3兩末端移去核苷酸。(圖)Bal31核酸酶的活性需要 Ca2+和Mg2+。 它是分子克隆中十分有價(jià)值的工具酶，其主要用途有： 誘發(fā) DNA 發(fā)生缺失突變；定位測定 DNA 片段中限制位點(diǎn)的分布； 研究超盤旋 DNA 分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 并改變因誘變劑處理所出現(xiàn)的雙鏈 DNA 的螺旋結(jié)構(gòu)。誘

23、發(fā) DNA 發(fā)生缺失突變 (圖)定位測定 DNA 片段中限制位點(diǎn)的分布先用 Bal31 核酸酶處理待測的線性 DNA 片段，使之以漸進(jìn)的速度從 5和 3兩末端同時(shí) 降解DNA，并在不同的時(shí)間間隔加入 EGTA，終止Bal31核酸酶的消化作用，然后用苯 酚抽提樣品，再加入我們期望使用的核酸內(nèi)切限制酶進(jìn)行在消化。如此按不同時(shí)間取樣 的 DNA 消化樣品， 同只用核酸內(nèi)切限制酶消化的對(duì)照組 DNA 樣品， 一道進(jìn)行凝膠電泳 分析。 DNA 片段從凝膠中消失的先后次序， 代表這些片段在 DNA 分子中的前后排列位 置。根據(jù)這些結(jié)果，便可以把這些 DNA 片段按正確的順序排列出來，并確定出有關(guān)限 制酶的識(shí)別位點(diǎn)。 2.5 核酸修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶( TdT )末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶能夠催化5-脫氧核苷三磷酸進(jìn)行 5向 3方向的聚合作用，逐個(gè)的將脫氧核苷酸分子加到線性分子的 3-OH 末端， 但是它不需要模板， 4種 dNTPs 都可 以作為它的前體。接受核苷酸聚合的受體 DNA，可以是具有3-OH末端的單鏈DNA，也可以是具有3-OH 末端的雙鏈 DNA平末端不是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的有效底物，但如果用Co2+取代Mg2+離子作為輔助因子，便可以成為它的有效