目錄 實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的吸光分析測(cè)定

1、目 錄實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的吸光分析測(cè)定吸光分析法的原理與儀器一、 改良lowry 比色法（hartree法）二、 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法三、 紫外分光光度法實(shí)驗(yàn)二 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)一、 ph對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響二、 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響三、 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 （堿性磷酸酶km值的測(cè)定）四、 抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響實(shí)驗(yàn)三 氨基酸代謝實(shí)驗(yàn)一、 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定二、 聯(lián)合脫氨基作用的檢定等溫蒸餾定氨法實(shí)驗(yàn)四 肝糖原實(shí)驗(yàn)一、 肝糖原的提取和定量二、 飽食、饑餓和激素對(duì)肝糖原含量的影響實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞與細(xì)胞核的分離技術(shù)一、 細(xì)胞的分離技術(shù)二、 細(xì)胞核的分離與純化實(shí)驗(yàn)七 真核

2、細(xì)胞dna的提取實(shí)驗(yàn)八 快速抽提質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)九 血清蛋白電泳一、 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳定量二、 聚丙酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)三、 血清蛋白質(zhì)的凝膠等電聚焦電泳四、 血清脂蛋白瓊糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)十 血液成分測(cè)定血液樣品的制備一、 血液葡萄糖測(cè)定二、 血液尿素氮測(cè)定-二乙酰一肟法三、 血清總膽固醇測(cè)定前 言生物化學(xué)的迅速發(fā)展，在很大程度上有賴于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步。許多生化理論成果，如果不了解其實(shí)驗(yàn)研究過程，是難以得到深刻的理解與牢固的掌握。因此，學(xué)生在學(xué)習(xí)生物化學(xué)理論的同時(shí)，應(yīng)該對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)有所了解與掌握。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展很快，種類很多，要在短時(shí)間內(nèi)全面掌握是不現(xiàn)實(shí)的。但是學(xué)生能

3、對(duì)一些常用的基本生化實(shí)驗(yàn)方法，通過親自的操作而有所認(rèn)識(shí)，顯然會(huì)有助于生化理論的學(xué)習(xí)與理解。并為將來進(jìn)一步開展醫(yī)學(xué)研究工作奠定基礎(chǔ)。為此，我們選擇了一些常用生化實(shí)驗(yàn)方法，供學(xué)生操作，其中包括了生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)的各個(gè)方面，以定量實(shí)驗(yàn)為主，特別注重了醫(yī)學(xué)生化技術(shù)的基本原理，希望學(xué)生通過這些實(shí)驗(yàn)的全過程訓(xùn)練后，能夠從多方面理解這些技術(shù)的意義及用途，能對(duì)這些生化技術(shù)有比較全面的認(rèn)識(shí)。隨著生物化學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)也越來越多地應(yīng)用到生化的研究領(lǐng)域。我們?cè)诒敬尉帉懙膶?shí)驗(yàn)指導(dǎo)中增加了一些分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，目的是讓學(xué)生對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有所了解，同時(shí)，對(duì)生物化學(xué)研究發(fā)展方向也有所知曉。由于受學(xué)時(shí)數(shù)的約束，

4、我們未能把生物化學(xué)所有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)都編入其中，只局限于一部分對(duì)醫(yī)學(xué)生學(xué)習(xí)生化可能會(huì)有幫助的實(shí)驗(yàn)。另外，限于我們業(yè)務(wù)技術(shù)水平等原因，本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)可能有一些缺點(diǎn)和不夠完善之處，敬請(qǐng)批評(píng)、指正。 編者 20075不遲到早退。實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的吸光分析測(cè)定蛋白質(zhì)是生物體的主要組成成分，也是生命活動(dòng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，體內(nèi)的酶、受體、凝血因子、免疫球蛋白等都是蛋白質(zhì)。因此，不論是生物化學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、微生物學(xué)等醫(yī)學(xué)各基礎(chǔ)學(xué)科，還是臨床檢驗(yàn)及臨床各科的研究工作，都必須把蛋白質(zhì)含量測(cè)定作為一項(xiàng)基本的實(shí)驗(yàn)手段，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)測(cè)定方法的應(yīng)用還會(huì)更廣。測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法很多，基本上都是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理

5、、化學(xué)或者生物學(xué)特征而建立的。目前常用的方法主要有根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或組成的紫外光吸收特征而建立的紫外分光光度法和根據(jù)蛋白質(zhì)與不同試劑起顏色反應(yīng)或與色素結(jié)合，而比色測(cè)定其含量的比色法。不論是紫外分光光度法，還是比色法均要使用分光光度計(jì)。因此，首先要介紹一下吸光分析的原理與儀器。吸光分析法的原理與儀器吸光分析是生化實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)方法。光線的本質(zhì)是電磁波的一種，有不同的波長(zhǎng)，肉眼可見彩色光稱為可見光，波長(zhǎng)范圍在400750，小于400的光線稱為紫外線，大于750的光線稱為紅外線。吸光分析所依據(jù)的是lambert和beer定律。（一）lambert定律：一束單色光通過透明溶液介質(zhì)時(shí)，光能被吸收一部分

6、，被吸收光的多少與溶液介質(zhì)厚度有一定比例關(guān)系。即：式中io為入射光強(qiáng)度。i為通過溶液介質(zhì)后的光強(qiáng)度，l為溶液介質(zhì)的厚度，k為吸光系數(shù)。（二）beer定律：一束單色光通過透明溶液介質(zhì)時(shí)，若溶液介質(zhì)厚度不變，被吸收光的多少與溶液介質(zhì)濃度有一定比例關(guān)系。即：式中c為溶液介質(zhì)的濃度。上述兩式合并可得：令則 a=kcl或a= logt式中a為吸光度，t為透光度。此式即為lambert-beer定律的物理表示式。其含義為：一束單色光通過溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度與厚度成正比。此式即為吸光分析法的基本計(jì)算式。在實(shí)際使用分光光度計(jì)時(shí)，通常是把溶液厚度固定的，因而可直接測(cè)定吸光度來求得溶

7、液介質(zhì)的濃度。平常要測(cè)定一個(gè)待測(cè)樣品的同時(shí)，常把一個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（與待測(cè)樣品性質(zhì)相同），配制成不同的濃度，測(cè)定其相應(yīng)的吸光度，畫出以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（或叫工作曲線）以此查得未知樣品的濃度，還可按照下列公式，對(duì)未知樣品的濃度通過計(jì)算得出： 儀器吸光分析法常常采用的儀器是分光光度計(jì)，其主要型號(hào)有722型分光光度計(jì)和752型紫外分光光度計(jì)等?，F(xiàn)將它們的組成、方法介紹一下：1 722型分光光度計(jì)由光源室、單色器、試樣室、光電管暗盒、電子系統(tǒng)及數(shù)字顯示器等部件組成。結(jié)構(gòu)如圖11所示。圖11 722型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖使用方法：使用儀器前，使用者應(yīng)先了解本儀器的結(jié)構(gòu)、工作原理以

8、及各個(gè)操作旋紐的功能。接通電源，打開電源開關(guān)，指示燈亮。選擇開關(guān)置于“t”，選擇好使用波長(zhǎng)，儀器預(yù)熱20分鐘。打開試樣室蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)“o”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”蓋上試樣室蓋，將比色皿架處于空白校正位置，使光電管受光，調(diào)節(jié)透過率“100%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”。如果顯示不到“100.0”，則可適當(dāng)提高靈敏度（即將靈敏度旋鈕由“1”到“2”檔）。若靈敏度改變了，儀器的“00.0”和“100.0”需重新校正。預(yù)熱后，即可進(jìn)行測(cè)定工作，將選擇開關(guān)置于“a”，調(diào)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，然后將被測(cè)樣品移入光路，顯示的數(shù)據(jù)即為被測(cè)樣品的吸光度值，記錄之。若比

9、色測(cè)定完畢，將比色液取出棄之廢液缸內(nèi)，洗凈比色皿放回原處，儀器選擇開關(guān)回到“t”，關(guān)掉電源。2 752型紫外分光光度計(jì)由光源室、單色器、試樣室、光電管暗盒、電子系統(tǒng)及數(shù)字顯示器等部件組成。其工作原理如圖12所示：tac試樣室圖12 752型紫外分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖使用方法：先接通電源，按電源開關(guān)（開關(guān)內(nèi)2只指示燈）。鎢燈點(diǎn)亮；按“氫燈”開關(guān)（開關(guān)內(nèi)左側(cè)指示燈亮）；氫燈電源接通，再按“氫燈觸發(fā)”按紐（開關(guān)內(nèi)左側(cè)指示燈亮）；氫燈點(diǎn)亮。儀器預(yù)熱30分鐘。預(yù)熱后，將選擇開關(guān)置于“t”選擇所需的波長(zhǎng)，打開試樣室蓋，調(diào)節(jié)“0%（t）”旋鈕，使數(shù)字顯示“00.0”，將比色液裝于石英比色皿中，再放入比色架上，

10、蓋上樣品室蓋，將參比溶液置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0%”（t）若不到100.0%（t）則可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù)。并重新調(diào)“00.0”和“100.0%”。再將選擇開關(guān)置于“a”，旋動(dòng)吸光度調(diào)整旋鈕，使得數(shù)字顯示為“00.0”。將被測(cè)液置光路中，顯示值即為試樣的吸光度值，并記錄之。使用完畢后，將選擇開關(guān)置于“t”，取出比色液棄之，洗凈放回原處，關(guān)掉電源開關(guān)。一、 改良lowry 比色法（hartree法）原理本法主要是利用酚試劑顯色。酚試劑中的主要成分是磷鉬酸和磷鎢酸，蛋白質(zhì)分子中的胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸均能使它們失去1個(gè)、2個(gè)或者3個(gè)氧原子，還原成含有多種

11、還原型的的混合酸，具有特殊的藍(lán)色。由于蛋白質(zhì)肽鍵在堿性條件下發(fā)生烯醇化反應(yīng)，能使銅離子螯合在肽結(jié)構(gòu)中，形成復(fù)合物，從而使電子易于轉(zhuǎn)移到酚試劑上。這樣大大地增強(qiáng)了酚試劑對(duì)蛋白質(zhì)的敏感性。利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。（反應(yīng)如下：）操作1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取蛋白標(biāo)準(zhǔn)血清（濃度為：蛋白7g/dl）。用生理鹽水配制成一系列不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。液：先將標(biāo)準(zhǔn)血清用生理鹽水500倍稀釋。液：取液7.5ml加生理鹽水稀釋至10ml，為667倍稀釋液。液：取液5.0ml加生理鹽水稀釋至10ml為1000倍稀釋液。液：取液5.0ml加生理鹽水稀釋至10ml為2000倍

12、稀釋液。液：取液5.0ml加生理鹽水稀釋至10ml為4000倍稀釋液。另取6支試管編號(hào)，用一支1ml的吸管從稀到濃，吸取上述稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)液置試管中，按下表操作編號(hào)123456蛋白質(zhì)濃度g/ml17.535701051400標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）1.01.01.01.01.0生理鹽水（ml）1.0試劑a（ml）0.90.90.90.90.90.9混勻后置于50水浴10分鐘，冷卻試劑b（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1混勻放置室溫10分鐘試劑c（ml） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0立即混勻，置50水浴中保溫10分鐘，冷卻后比色，在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)650nm比色，

13、以第6管為空白管調(diào)零，讀取其他各管吸光度。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，各管的吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線必須從零點(diǎn)出發(fā)，最好能成一直線，繪好后應(yīng)注明所用儀器的型號(hào)及編號(hào)、波長(zhǎng)、測(cè)定方法、曲線名稱與制作日期。2 蛋白質(zhì)樣品的測(cè)定取試管2支，按下表操作 試管試劑測(cè)定管空白管未知樣品（ml）1.0生理鹽水（ml）1.0試劑a（ml）0.90.9混勻后在50水浴保溫10分鐘，冷卻試劑b（ml）0.10.1混勻，放置室溫10分鐘試劑c（ml）3.03.0立即混勻，置50水浴中保溫10分鐘，冷卻后，在分光光度計(jì)中，以650nm波長(zhǎng)比色，讀取吸光度。再查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得未知樣品中蛋白含量，以mg/m

14、l為單位。試劑1. 試劑a 稱取酒石酸鉀鈉2g及na2co3100g溶于500ml 1.0mol/l naoh溶液中，再用水稀釋至1000ml。2. 試劑b 稱取酒石酸鉀鈉2g及cuso4.5h2o 1g，分別溶于少量水中，混勻后加水至90ml，再加10ml 1mol/l naoh即成。3. 試劑c 市售的酚試劑按1:15倍稀釋即可。自配：稱取na2wo42h2o100g，na2moo42h2o25g溶于700ml水中，加入85%h3po4 50ml，濃hcl100ml，混勻后置圓底燒瓶中回流10h，加入硫酸鋰（li2so4h2o）150g，水50ml及溴水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)沸騰15分鐘以除去余溴，冷

15、卻后稀釋至1000ml，過濾溶液應(yīng)為金黃色，置棕色瓶中保存臨用時(shí)1:15稀釋即可。4. 0.9 nacl注意事項(xiàng)1 測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度最好在15110g范圍內(nèi)，如樣品蛋白濃度過濃，應(yīng)稀釋后再測(cè)定。2 各管在加酚試劑時(shí)必須快速，立即混勻，不應(yīng)出現(xiàn)混濁。二、 考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法原理考馬斯（coomassie）亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)相結(jié)合。這種結(jié)合具有高度敏感性?？捡R斯亮藍(lán)g250磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，其最大吸收峰為595nm。在一定范圍內(nèi)，coomassie亮藍(lán)g250蛋白復(fù)合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白

16、質(zhì)含量的測(cè)定。操作1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備配制1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液。制備一系列稀釋液，其濃度分別為500g/ml 250g/ml 125g/ml 62.5g/ml 31.25g/ml。再按下表操作：（取六支試管編號(hào)）管號(hào)123456蛋白質(zhì)含量（g/ml）50025012562.531.250標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）0.10.10.10.10.1生理鹽水（ml）-0.1染液（ml）555555搖勻，室溫靜置3分鐘。以第六管為對(duì)照管，于波長(zhǎng)595nm處比色，讀取吸光度，以各管吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/ml）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 未知樣品測(cè)定取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生

17、理鹽水至刻度，搖勻。（此樣品稀釋200倍）取試管2支，按下表操作：測(cè)定管對(duì)照管稀釋樣品（ml）0.1生理鹽水（ml）0.1染液（ml）5.05.0混勻。室溫靜置3分鐘，于波長(zhǎng)595nm出比色，讀取吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得稀釋樣品蛋白濃度。未知血清蛋白質(zhì)濃度（g/ml）稀釋樣品濃度稀釋倍數(shù)試劑10.9nacl2標(biāo)準(zhǔn)蛋白：稱取100mg牛血清蛋白，加生理鹽水溶解并稀釋至100ml（容量瓶配制）。3 染液：稱取考馬斯亮藍(lán)g250 0.1g溶于50ml 95%乙醇，再加入100ml 85%(w/v)磷酸，然后加蒸餾水稀釋至1000ml。注意事項(xiàng)1 待測(cè)樣品蛋白的濃度含量應(yīng)在50400ug為宜。2 該法

18、簡(jiǎn)便，靈敏度高，但顯色深淺仍受環(huán)境酸堿度影響。3 若樣品中存在大量十二烷基硫酸鈉（sds）等去垢劑時(shí)，顯色反映也會(huì)受到干擾。三、 紫外分光光度法原理蛋白質(zhì)組成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故可以利用280nm波長(zhǎng)的光吸收程度（即吸光度）來推測(cè)蛋白質(zhì)含量。由于核酸在280nm波長(zhǎng)處也有光吸收，對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm波長(zhǎng)處，如同時(shí)測(cè)定280nm和260nm波長(zhǎng)的吸光度，通過計(jì)算可消除核酸對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定的影響。操作1 稀釋血清（或其他蛋白質(zhì)溶液）：準(zhǔn)確吸取0.1ml血清置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度。（為500倍稀釋）

19、2 測(cè)定吸光度：在紫外分光光度計(jì)上，將稀釋的蛋白質(zhì)溶液盛于石英比色杯中，以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)得280nm和260nm兩種波長(zhǎng)的吸光度。計(jì)算將280nm及260nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。蛋白濃度（mg/ml）1.45a2800.74a260注意事項(xiàng)1 不同的蛋白質(zhì)及核酸的光吸收率不完全相同，按上述經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算仍可產(chǎn)生較大誤差。同時(shí)，該方法適用樣品中核酸含量必須20%；a280/a2601.5。2 本法對(duì)微量蛋白質(zhì)的測(cè)定既快又方便。它還適用有硫酸銨或其它鹽類混合的蛋白質(zhì)樣品，如用其他方法測(cè)定往往比較困難。3 該法最大的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)樣品中不需加任何化學(xué)試劑，故可保存蛋白質(zhì)生物學(xué)

20、活性，即樣品可回收。4 如純蛋白樣品，可根據(jù)該蛋白在280nm附近的標(biāo)準(zhǔn)吸光系數(shù)，直接測(cè)定該蛋白含量。 如牛血清的蛋白的為6.3，則待測(cè)樣品中牛血清的蛋白含量可用下列公式計(jì)算：思考題1 改良lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)并不等于酚試劑法，試從原理上說明之。2比較本次實(shí)驗(yàn)三種不同的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，各有何優(yōu)缺點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)二 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要研究酶催化反應(yīng)的過程與速度，以及各種影響酶催化速度的因素，定量地加以闡述。定量時(shí)的觀察對(duì)象是單位時(shí)間內(nèi)底物的減少或產(chǎn)物增加的量。因?yàn)槊妇哂懈叨炔环€(wěn)定性，反應(yīng)體系的條件必須嚴(yán)格控制，這些條件包括ph、溫度等。如果能正確的選擇和維持這些實(shí)驗(yàn)條件，那么酶量和反

21、應(yīng)速度之間的關(guān)系就可以掌握。酶催化反應(yīng)典型曲線是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度下降。由起初線性部分轉(zhuǎn)變成曲線。這種變化是由于幾種因素的共同作用而產(chǎn)生的。包括底物濃度下降，逆反應(yīng)增加和酶的變性等。用不同量的酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，起初線性部分斜度與酶濃度成正比，而非線性部分則不是這樣，因此測(cè)定酶活性的所有反應(yīng)速度的比較都必須依賴于線性部分。也就是說要測(cè)定最初反應(yīng)速度。在酶促進(jìn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)不同因素的研究所需的底物濃度也不同。例如在測(cè)定底物濃度、抑制劑、激活劑對(duì)酶活性的影響時(shí)，選擇的一系列底物濃度，一般均在其km值左右。而在測(cè)定ph、溫度對(duì)酶活性影響時(shí)選擇的底物一般是其km的10倍左右。本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸

22、酶為例研究ph、溫度、底物及抑制劑對(duì)該酶的影響，酶反應(yīng)速度則利用比色法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的產(chǎn)物量來推斷。一、 ph對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響原理酶促反應(yīng)對(duì)于環(huán)境的酸堿度非常敏感，每一種酶只有在一定的ph時(shí)才表現(xiàn)其最強(qiáng)的活性，此時(shí)的ph稱為最適ph，不同的酶，最適ph也不同，同一種酶作用于不同底物時(shí)其最適ph也可不同，環(huán)境的ph偏離最適ph將引起酶活性的降低，酶促反應(yīng)速度的下降。本實(shí)驗(yàn)通過不同ph下堿性磷酸酶活性的改變，說明最適ph的概念及堿性磷酸酶最適ph的大致范圍。堿性磷酸酶（akp）的專一性較差，能水解多種磷酸酯，但對(duì)于不同的底物，其最適ph不同，本實(shí)驗(yàn)采用磷酸苯二鈉為底物，被堿性磷酸酶水解后則

23、產(chǎn)生游離酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與4氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，可生成紅色的醌類衍生物。根據(jù)紅色的深淺就可測(cè)出酚的含量，從而計(jì)算出酶的活性大小。操作1 取試管六支，編號(hào)按下表操作管號(hào)123456ph值ph8.0ph9.0ph10.0ph11.0ph12.0甘氨酸緩沖液（ml）0.90.90.90.90.9蒸餾水（ml）0.90.01mol/l基質(zhì)（ml）1.01.01.01.01.01.0混勻，37水浴保溫5分鐘酶液（ml）0.10.10.10.10.1ph8.8tris緩沖液（ml）0.1立即混勻，計(jì)時(shí)，37水浴保溫15分鐘 保溫結(jié)束后，各管中先加入naoh終止反應(yīng)，然后再加入其他試

24、劑0.5mol/lnaoh (ml)1.01.01.01.01.01.00.34-氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.00.5鐵氰化鈉（ml）2.02.02.02.02.02.0立即混勻，使顯色完全，室溫放置10分鐘2. 用肉眼比較各管顏色深淺，分別用表示。觀察何種ph值下酶活性最強(qiáng)，并記錄。試劑1. 甘氨酸緩沖液：稱取15.0g甘氨酸加蒸餾水溶解并稀釋至1000ml即為0.2mol/l甘氨酸溶液。于50ml0.2mol/l甘氨酸溶液中按下表加入0.2mol/lnaoh，最后加蒸餾水至110ml，即可配成不同ph值的甘氨酸緩沖液。ph0.2mol/l甘氨酸（ml）0.2mol

25、/lnaoh(ml)8.09.010.011.012.050.050.050.050.050.01.08.832.048.5552. 0.01mol/l基質(zhì)液：稱取磷酸苯二鈉（c6h5po4na2 2h2o）3.79g或磷酸苯二鈉（無結(jié)晶水）2.18g，用水溶解并稀釋至1000ml。加4ml氯仿防腐，置棕色瓶，冰箱內(nèi)保存。此液只能用一周。3酶液：稱取純制的堿性磷酸酶2.5mg，用ph8.8tris緩沖液配制成100ml，冰箱中保存。40.5mol/l naoh50.34氨基安替比林：稱取4氨基安替比林0.3g及碳酸氫鈉4.2g，用蒸餾水溶解并稀釋至100ml。置棕色瓶，冰箱內(nèi)保存。60.4鐵氰

26、化鉀：稱取5g鐵氰化鉀和15g硼酸，各溶于400ml蒸餾水中，溶解后兩液混勻，再用蒸餾水稀釋至1000ml，置棕色瓶，避光保存。7. ph8.8tris緩沖液：稱取三羥甲基氨基甲烷（tris）12.1g，用蒸餾水溶解，并稀釋至1000ml即為0.1mol/l tris溶液。 取0.1mol/l tris溶液100ml，加蒸餾水800ml，再加入0.1mol/l醋酸鎂100ml，混勻后用1醋酸調(diào)節(jié)ph至8.8，用蒸餾水稀釋至1000ml即可。8. 0.1mol/l醋酸鎂：稱取醋酸鎂21.45g，溶解于蒸餾水并稀釋至1000ml。9. 酚標(biāo)準(zhǔn)液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稱取結(jié)晶酚1.5g，溶于0.1mol/

27、l鹽酸至1000ml，為儲(chǔ)備液。標(biāo)定：取25ml上述酚液，加55ml 0.1mol/lnaoh后加熱至65c，再加入0.1mol/l碘液25.0ml，蓋好放置30分鐘后，加濃鹽酸5ml，再以0.1淀粉為指示劑，用0.1mol/l硫代硫酸鈉滴定。反應(yīng)式如下：根據(jù)反應(yīng)，3分子碘（分子量為254）與1分子酚（分子量為94）起作用，因此每ml0.1/l碘溶液（含碘12.7mg）相當(dāng)于酚的g數(shù)為：25ml碘液中被硫代硫酸鈉滴定作用的體積為xml，則25ml酚溶液中所含酚量為：（25x）1.567mg應(yīng)用液按上述標(biāo)定結(jié)果用蒸餾水稀釋成0.1mg/ml作酚標(biāo)準(zhǔn)液。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取試管六支，按下表操作：管號(hào)1

28、23456酚標(biāo)準(zhǔn)液0.1mg/ml（ml）0.050.10.20.30.4蒸餾水（ml）2.01.951.91.81.71.6混勻，在37水浴保溫5分鐘保溫結(jié)束后，各管中先加入naoh終止反應(yīng)，然后再加入其他試劑0.5mol/l naoh（ml）1.01.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.00.5鐵氰化鈉（ml）2.02.02.02.02.02.0混勻，室溫放置17分鐘后，以510nm波長(zhǎng)比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線酚含量（g/ml）0510203040二、 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響原理溫度對(duì)酶活性有顯著的影響。溫度低時(shí)，酶促反應(yīng)減弱或停止；溫度從較

29、低逐漸升高時(shí)，反應(yīng)速度也隨之逐漸增加；當(dāng)溫度上升到某一定值時(shí)，酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值，此溫度稱為酶作用的最適溫度。但酶是蛋白質(zhì)，其本身也因溫度升高而變性，超過最適溫度時(shí)，反而使酶促反應(yīng)降低，一般溫度升至7080c以上，酶活性幾乎全部喪失。應(yīng)該指出，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)酶的最適溫度會(huì)隨著保溫時(shí)間的長(zhǎng)短而有所變化。本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，在不同溫度下保溫一定時(shí)間，觀察酶活性變化。操作取試管五支編號(hào)，按下表操作管 號(hào)1234空白0.1mol/lph10碳酸緩沖液（ml）0.90.90.90.90.90.01mol/l基質(zhì)（ml）1.01.01.01.01.0保溫溫度（5分鐘）冰浴室溫37100酶液（ml）0.

30、10.10.10.1ph8.8tris緩沖液（ml）0.1保溫溫度（15分鐘）冰浴室溫37100室溫保溫結(jié)束后，各管中先加入naoh終止反應(yīng)，然后再加入其他試劑立即加0.5mol/l naoh(ml)1.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.00.5鐵氰化鉀（ml）2.02.02.02.02.0充分混勻，室溫放置10分鐘。用肉眼比較各管顏色之深淺，用表示。并判斷，何種溫度下酶活性最強(qiáng)，作記錄。試劑1. 0.1mol/lph10碳酸緩沖液：稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g，溶解于蒸餾水并稀釋至1000ml。2. 其它試劑同前。三、 底物濃度

31、對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 （堿性磷酸酶km值的測(cè)定）原理在溫度、ph及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶的催化作用有很大的影響。在一般情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶促反應(yīng)的速度（v）隨底物濃度s的增加而迅速增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速度的增加率就比較小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值（即最大速度vm）。底物濃度和反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用米氏方程式來表示（michaelis-menten方程）即： 式中km為米式常數(shù)，vm為最大反應(yīng)速度，當(dāng)v=vm/2時(shí)，則km=s，km是酶的特征性常數(shù)，測(cè)定km是研究酶的一種重要方法。但是在一般情況下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成的是直角雙曲線，難以準(zhǔn)確

32、求得km和vm。若將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程（lineweaver-burk方程），則此方程為直線方程,即以1/v和1/s分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)。（如圖21所示），將各點(diǎn)連線，在橫軸截距為1/km，據(jù)此可算出km值。 圖21 酶反應(yīng)速度倒數(shù)與底物濃度倒數(shù)的關(guān)系曲線本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，測(cè)定不同濃度底物時(shí)的酶活性，再根據(jù)1/v和1/s的倒數(shù)作圖，計(jì)算出其km值。操作1 取試管9支，將0.01mol/l基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度： 管號(hào)試劑0.01mol/l基質(zhì)液(ml)011111123蒸餾水（ml）3765432202 另取9支試管編號(hào)，按下表操作 管號(hào)試劑123456789吸取稀釋后基質(zhì)液1.

33、0mlph10碳酸鈉緩沖液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混勻，37水浴保溫5分鐘酶 液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1最終基質(zhì)濃度（mm）s010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液，立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37準(zhǔn)確保溫15分鐘保溫結(jié)束后，各管中先加入naoh終止反應(yīng)，然后再加入其他試劑0.5mol/l naoh(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5鐵氰化鉀（ml）2.02.02.02

34、.02.02.02.02.02.0充分混勻，放置室溫10分鐘，以1管為對(duì)照于510nm波長(zhǎng)處比色，讀取各管吸光度，做記錄，酶活性計(jì)算及km值計(jì)算1 在37c下保溫15分鐘產(chǎn)生1g酚為1個(gè)酶活性單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出釋放的酚量（g），以此計(jì)算出各管的酶活性（v）。2 以酶活性單位（v）的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，以底物濃度s的倒數(shù)1/s為橫坐標(biāo)，在方格紙上描點(diǎn)并連接成線，求酶的km值。試劑同前實(shí)驗(yàn)。四、 抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響原理凡能降低酶的活性，甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，稱為酶的抑制劑。酶的特異性抑制劑大致上分為可逆性和不可逆性兩大類?？赡嫘砸种朴挚煞譃楦?jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制等。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用

35、特點(diǎn)是使該酶的km值增大，但對(duì)酶促反應(yīng)的最大速度vm值無影響。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用特點(diǎn)是不影響s與酶的結(jié)合，故其km值不變，然而卻能降低其最大速度vm。本實(shí)驗(yàn)選取na2hpo4作為堿性磷酸酶的抑制物，確定其抑制作用屬于哪種類型。操作1 取試管9支編號(hào)，按下表操作： 管號(hào)試劑0.01mol/基質(zhì)（ml）011111123蒸餾水（ml）3765432202 另取9支試管編號(hào)，按下表操作 管號(hào)試劑123456789吸取稀釋基質(zhì)液1.0ml0.04mol/l磷酸氫二鈉（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1ph10碳酸鈉緩沖液（ml）0.80.80.80.80.80.80.80.

36、80.8混勻，37水浴保溫10分鐘左右酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1最終基質(zhì)濃度(mm)s010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液，立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37保溫15分鐘保溫結(jié)束后，各管中先加入naoh終止反應(yīng)，然后再加入其他試劑0.5mol/l naoh(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.34氨基安替比林（ml）1.01.01.01.01.01.01.01.01.00.5鐵氰化鉀（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.02.0充分混勻，放置室溫10分鐘，以1管為對(duì)照于51

37、0nm波長(zhǎng)比色，讀取各管吸光度，并計(jì)算各管酶活性（v）。作圖以酶活性單位（v）的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，以底物濃度s的倒數(shù)1/s為橫坐標(biāo)，在方格紙上描點(diǎn)，并連接各點(diǎn)，求該酶的km值并與前面未加入抑制劑時(shí)測(cè)出的km值作比較。（可在一張坐標(biāo)紙上作圖，以便比較）判斷該抑制作用屬于哪種類型。試劑10.04mol/l磷酸氫二鈉：稱取磷酸氫二鈉14.3g溶解于0.1mol/lph10的碳酸緩沖液中并稀釋至1000ml。2其它試劑同前實(shí)驗(yàn)。注意事項(xiàng)1 該實(shí)驗(yàn)所有的玻璃器材必須清潔，以免污染物影響酶的活性。2 在做該實(shí)驗(yàn)時(shí)，要保證條件的一致性，如研究溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，在時(shí)間的控制上尤為重要，否則，結(jié)果難以

38、解釋。思考題1 除了雙倒數(shù)作圖外，你能舉出其它能將酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)做出直線圖的方法嗎？2 為什么進(jìn)行此種酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定時(shí)，所用各底物濃度不是按等差遞增？3 酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，哪些因素需嚴(yán)格控制？實(shí)驗(yàn)三 肝糖原實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四 氨基酸代謝實(shí)驗(yàn)在氨基酸分解代謝中，聯(lián)合脫氨基作用是大多數(shù)氨基酸的主要代謝方式，通過轉(zhuǎn)氨基作用與谷氨酸氧化脫氨基作用偶聯(lián)而完成。此過程可用下式表示：本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸的氧化脫氨為例，除分別測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamate-pyruvate transaminase，gpt）及谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase,gdh）活性外，又通過抑制劑觀察了肝組織中的聯(lián)合脫氨基

39、作用。 一、 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定 原理在谷丙轉(zhuǎn)氨酶的催化下，丙氨酸和酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。此反應(yīng)可逆，平衡點(diǎn)近于1。無論正向反應(yīng)或逆向反應(yīng)皆可用于測(cè)定此酶的活性，既可測(cè)定所產(chǎn)生的氨基酸，也可測(cè)定所生成的酮酸，因此可有多種測(cè)定方法。 本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸及酮戊二酸作為谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用的底物，利用內(nèi)源性磷酸吡哆醛作輔酶，在一定條件及時(shí)間作用后測(cè)所生成的丙酮酸的量來確定其酶活性。丙酮酸能與2,4二硝基苯肼結(jié)合，生成丙酮酸2,4二硝基苯腙。后者在堿性溶液中呈現(xiàn)棕色，其吸收光譜的吸收峰為439530nm，可用于測(cè)定丙酮酸含量。 酮戊二酸也能與2,4二硝基苯肼結(jié)合，生成相應(yīng)的苯腙，但后者在堿性溶液中

40、吸收光譜與丙酮酸二硝基苯腙稍有差別，在520nm波長(zhǎng)比色時(shí)，酮戊二酸硝基苯腙的吸光度遠(yuǎn)較丙酮酸二硝基苯腙為低（約相差3倍）。經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用后，酮戊二酸減少而丙酮酸增加，因此在波長(zhǎng)520nm處吸光度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與酮戊二酸的mol比基本上呈線性關(guān)系，故可籍以測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。 但是，由于在實(shí)驗(yàn)中不宜過多的酮戊二酸以降低其對(duì)顯色的干擾，因此，對(duì)于作為底物的酮戊二酸濃度作了一定的限制，從而不能保證酶反應(yīng)充分進(jìn)行，以致丙酮酸產(chǎn)量與酶量之間的關(guān)系并不始終呈一直線關(guān)系。當(dāng)酶量增大時(shí)，曲線斜率減小。因此在測(cè)定時(shí)，如酶活性較大（大于100單位），應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。另外2,4-二硝基苯肼對(duì)

41、此顯色反應(yīng)也有一定的干擾，因此，在制作丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，雖沒有加酮戊二酸，丙酮酸二硝基苯腙的吸光度與丙酮酸含量之間的關(guān)系也并不始終呈一直線關(guān)系，丙酮酸含量增大時(shí)，曲線斜率降低，因此，必須采用標(biāo)準(zhǔn)曲線中呈現(xiàn)直線關(guān)系的部分來測(cè)定丙酮酸的生成量。操作1 勻漿制備：（1） 將小白鼠處死，立即取出肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，取肝臟0.5g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入4.5ml預(yù)冷的ph7.4，0.1mol/l磷酸緩沖液，制成10%肝勻漿，冰凍保存，以備進(jìn)行下列各實(shí)驗(yàn)。（2） 取上述肝勻漿0.1ml于另一試管中，加入預(yù)冷的ph7.4，0.1mol/l磷酸緩沖液9.9ml（稀釋100倍）搖勻，即為

42、稀釋肝勻漿。 2. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定：（1）取試管2支，分別注明“測(cè)定管”、“對(duì)照管”，按下表操作： 測(cè)定管對(duì)照管 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物（ml）0.5 37預(yù)溫5分鐘稀釋肝勻漿（ml）0.10.1混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫30分鐘2,4-二硝基苯肼（ml）0.50.5谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物（ml）0.5 混勻后，37水浴中繼續(xù)保溫20分鐘0.4mol/lnaoh(ml)5.05.0（2）混勻后，靜置10分鐘，于520nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。以蒸餾水為空白，讀取測(cè)定管與對(duì)照管的吸光度，將測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其相當(dāng)?shù)谋岷?。?）谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性計(jì)算：本法規(guī)定酶在37與底物作用30分鐘

43、，能產(chǎn)生2.5g丙酮酸者為一個(gè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位。據(jù)此計(jì)算每ml稀釋肝勻漿的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性單位及每g肝組織中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的總活性單位。 試劑1. 標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液（1ml相當(dāng)于500g）：準(zhǔn)確稱取純化之丙酮酸鈉62.5mg，溶于100ml 0.1mol/l h2so4中，此液需臨用前配制。2. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物液：稱取dl丙氨酸1.79g及酮戊二酸29.2mg，先溶于ph7.4 0.1mol/l磷酸緩沖液中，然后用1mol/l naoh調(diào)至ph7.4，再用ph7.4 0.1mol/l磷酸緩沖液稀釋至100ml。儲(chǔ)藏于冰箱內(nèi)，可保存一周。3. ph7.4 0.1mol/l磷酸緩沖液：稱取13.97g

44、 k2hpo4和2.69g kh2po4溶于1000ml蒸餾水中。4. 0.022，4二硝基苯肼溶液：稱取2，4二硝基苯肼 20mg溶于少量1n hci中，加熱溶解后，用1n hci稀釋至100ml。5. 0.4mol/l naoh溶液。6. 生理鹽水。二、聯(lián)合脫氨基作用的檢定等溫蒸餾定氨法原理丙氨酸的脫氨基作用（transdeamination）由谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷氨酸脫氫酶聯(lián)合完成，因此，勻漿中加入的丙氨酸底物，經(jīng)反應(yīng)后，除了產(chǎn)生丙酮酸外，另一產(chǎn)物谷氨酸可以進(jìn)一步氧化脫氨而釋放出氨。即：如果其中任何一個(gè)酶的催化作用受到抑制，則聯(lián)合脫氨基作用就不能順利進(jìn)行，氨也無從產(chǎn)生。苯肼可以與轉(zhuǎn)氨酶的輔酶磷

45、酸吡哆醛的醛基結(jié)合而阻斷其轉(zhuǎn)氨基作用，故本實(shí)驗(yàn)用苯肼作為轉(zhuǎn)氨酶的抑制劑來觀察其對(duì)氨生成的影響。本實(shí)驗(yàn)采用conway擴(kuò)散皿等溫蒸餾定氨法收集釋放的氨進(jìn)行測(cè)定。conway擴(kuò)散皿分內(nèi)外二室（見圖6-1），在外室的一側(cè)加入待測(cè)試樣，另一側(cè)加入濃堿液，內(nèi)室則加入足量的稀鹽酸，當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散皿使試樣與濃堿液混勻時(shí)，其中的氨或銨鹽在堿的作用下生成氨氣擴(kuò)散出來，可被內(nèi)室的鹽酸吸收，生成氯化銨，從而將氨從試樣中分離出來。此過程又稱為氨的等溫蒸餾。內(nèi)室所吸收的氨可用nessler試劑顯色測(cè)定。圖6-1 conway擴(kuò)散皿的結(jié)構(gòu)通過conway擴(kuò)散皿進(jìn)行氨的等溫蒸餾可以避免試樣中其他物質(zhì)對(duì)氨測(cè)定的干擾，有利于氨的正

46、確測(cè)定。操作1. 聯(lián)合脫氨基作用的反應(yīng)體系及保溫：用前面實(shí)驗(yàn)制備的10%肝勻漿，在3支試管中按下表操作： 管號(hào)試劑（1）對(duì)照管（2）測(cè)定管（3）抑制管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物液（ml）0.80.80.81%nad+溶液（ml）0.10.10.11%苯肼溶液（ml）0.10.110%三氯醋酸（ml）0.5 置于37水浴中預(yù)溫5分鐘10%肝勻漿（ml）0.50.50.5各管混勻后立即計(jì)時(shí)，在37水浴中保溫45分鐘，并間隙振搖，使作用完全10三氯醋酸（ml）0.50.51%苯肼溶液（ml）0.12. 等溫蒸餾：取3只conway擴(kuò)散皿按上述試管編號(hào)，在其外室的邊緣上均勻地涂上羊毛脂，以備密封。然后分別在其內(nèi)、

47、外室中按下表加入下列試劑：皿號(hào)試劑（1）（2）（3）內(nèi)室0.01mol/l hcl（ml）1.01.01.0外室一側(cè) 聯(lián)合脫氨基反應(yīng)液（ml）1.01.01.0外室另一側(cè) 50%naoh（ml）0.50.50.5蓋上玻璃，注意密封，然后將conway皿稍傾斜，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)振搖，使外室中反應(yīng)液與堿液混勻，置于37溫箱內(nèi)保溫45分鐘。 3. 顯色：取試管3支，按上述編號(hào)，分別吸取conway皿內(nèi)室液0.5ml，各加蒸餾水2.5ml及阿拉伯膠液2滴，混勻后，再加nessler試劑0.75ml，立即于480nm波長(zhǎng)比色測(cè)定，讀取吸光度。4 .計(jì)算：根據(jù)硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每g肝組織每小時(shí)釋放的氨量。5.

48、硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：（1） 取11只conway皿編號(hào)，在其外室的邊緣上均勻地涂上羊毛脂，以備密封。（2） 室內(nèi)中各加1.0ml 0.01mol/lhcl，外室一側(cè)加入0.5ml 50naoh溶液，另一側(cè)按下表加入0.004mol/l硫酸銨應(yīng)用液及蒸餾水。 皿號(hào)試劑（外室另一側(cè)）12345678910110.004mol/l硫酸銨應(yīng)用液（ml）0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0/蒸餾水（ml）0.90.80.70.60.50.40.30.20.1/1.0相當(dāng)于nh3的mol數(shù)0.40.81.21.62.02.42.83.23.64.0/蓋好玻片，略壓緊，以防漏氣。再

49、使樣品與堿溶液混合，于37恒溫箱中保溫45分鐘。取11支試管按上述conway皿編號(hào)，分別吸取內(nèi)室液0.5ml，各加蒸餾水2.5ml，阿拉伯膠液2滴，混勻后加nessler試劑0.75ml，立即混勻，于480nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定。以各管中標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨所含的mol數(shù)為橫坐標(biāo)，其吸光度為縱坐標(biāo)，繪制氨的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑1 nessler試劑 同實(shí)驗(yàn)四。2 0.02mol/l標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的溶液配制 同實(shí)驗(yàn)四。3 0.004mol/l標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的溶液：將0.02mol/l標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液再稀釋五倍即可。4 1nad+5 1%苯肼溶液6 10%三氯醋酸7 0.01mol/l鹽酸8 50%氫氧化納9 3%阿拉伯膠液

50、 同實(shí)驗(yàn)四(原講義實(shí)驗(yàn)四，現(xiàn)已刪除，具體見原講義)注意事項(xiàng)1 在制備勻漿的過程中，不能用力過猛，時(shí)間過久，防止酶活性降低。2 在conway皿未蓋緊前，外側(cè)加反應(yīng)液時(shí)不能碰到另一側(cè)的50%naoh溶液，否則結(jié)果不準(zhǔn)。思考題1 肝細(xì)胞谷丙轉(zhuǎn)氨酶在體內(nèi)的生理意義有哪些？臨床上測(cè)定血清gpt有何診斷價(jià)值？2實(shí)驗(yàn)中，苯肼有何作用？此時(shí)再加入過量磷酸吡哆醛，可能出現(xiàn)什么現(xiàn)象？實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原理 細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體的基本單位，也是生命的基本單位。只有在適宜的環(huán)境和條件下，它才能生長(zhǎng)、繁殖。離體的細(xì)胞在模擬的生理環(huán)境下，也能生存、生長(zhǎng)和繁殖。通過觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，可了解細(xì)胞與環(huán)境的密切關(guān)系。細(xì)胞在體外培養(yǎng)的基本條件:1. 首要條件: 無菌、無毒。一旦環(huán)境被污染即可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2. 溫度: 人和哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溫度為360.5，一般而言，細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較高溫強(qiáng)。偏離最適溫度均可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，甚至死亡。3. 氣體和ph: 氣體主要是o2和co2。 o2是細(xì)胞呼吸所需，而co2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物也是細(xì)胞生存所需成分，其主要作用是參與環(huán)境ph的維持。大多數(shù)細(xì)胞的最適ph7.27.4，原代細(xì)胞對(duì)ph變動(dòng)的耐受性較差，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。一般而言，細(xì)