實(shí)驗(yàn)一底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響[參照模板]

1、實(shí)驗(yàn)一 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆盏孜餄舛葘?duì)酶活性的影響，了解堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP )的Km值的測(cè)定原理和方法，理解Km值的意義。、實(shí)驗(yàn)原理在溫度、pH及酶濃度等恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶的催化作用有很大的影響。當(dāng)?shù)?物濃度較低時(shí)，酶促反應(yīng)速度V隨底物濃度S的增高而顯著加快，隨著底物濃度漸高，反應(yīng)速度加快程度漸小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭纫陨蠒r(shí)，再增高底物濃度，反應(yīng)速度亦 不再增加，成為該條件下極限最大反應(yīng)速度Vmax。底物濃度與反應(yīng)速度的這種關(guān)系可以用下列米曼(Michaclis-Menten )氏方程式表示。v= V max S Km

2、S式中，Km為米氏常數(shù)。當(dāng) V=Vmax/2時(shí)，貝U Km=S，即米氏常數(shù)是反應(yīng)速度等于最 大速度一半時(shí)底物物濃度的數(shù)值。如圖所示：Km是酶的特征性常數(shù)，不同酶的Km值不同，同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多數(shù)純酶的 Km值在0.01100mmol/L之間。Km值的測(cè)定在酶學(xué)研究中有重要的 實(shí)際意義。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制上述直角雙曲線，難以準(zhǔn)確求出Km和Vmax值。而用米曼氏方程式的下列變換式，則容易求得Km及Vmax值。-僅供參考一一頁(yè)眉頁(yè)腳可刪除米曼氏方程式中各項(xiàng)皆采用倒數(shù)表示，則成為L(zhǎng)ineweaver Burk氏方程式:Km 11= + V V max S V max如圖所示:SKm

3、Lineweaver Burk氏法作圖求 Km值這是個(gè)上截式直線方程式。1截距為，橫軸截距為-V max系作圖而容易正確得出 Km值。1 1與一為直線關(guān)系，如上圖。直線斜率為V S1據(jù)此可以測(cè)定不同濃度底物的反應(yīng)速度，按Km龜，縱軸V max1 1-與丄關(guān)V另有其他變換式，例如把上式兩側(cè)皆乘以S，則轉(zhuǎn)換成 Wilkinson氏方程式。宜=耳+亠伺V V max V max如圖所示:圖3 Wilkinson氏法作圖求 Km值這也是直線方程式。以S為縱軸，S為橫軸作圖，則直線在橫軸上的截距為Km.V本實(shí)驗(yàn)利用磷酸苯二鈉法測(cè)定不同濃度底物的堿性磷酸酶（Alkali ne Phosphatase,AK

4、P ）的反應(yīng)速度，作圖求出Km值。AKP的催化原理為：在一定 pH和溫度下，待測(cè)液中的 AKP作用于基質(zhì)液中的磷酸苯 二鈉，使之水解釋放出酚。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林（AAP）作用并經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色醌類化合物。以酚作標(biāo)準(zhǔn)液同樣處理顯色進(jìn)行比色，可測(cè)知酚的生成量，從 而計(jì)算出酶的活力。C.HSK3Fc(CN)bcnh34氨基安替比林CsH5IN/ HiCN C =0HQYCNHg3= 0醍衍生物三、實(shí)驗(yàn)器材試管、37C水浴鍋、可見分光光度計(jì)、座標(biāo)紙四、實(shí)驗(yàn)試劑1、0.04mol/L 基質(zhì)液稱取磷酸苯二鈉2H2O 10.16g，用煮沸冷卻的蒸餾水溶解并稀釋至1000mL。加4mL氯

5、仿防腐貯于棕色瓶中冰箱保存，可用一周。2、 0.1mol/L pH10碳酸鹽緩沖液（含 0.3% 4-氨基安替比林）稱取4-氨基安替比林（AAP）3g,用0.1mol/L pH10碳酸鹽緩沖液溶解并稀釋至 1000mL，放棕色瓶?jī)?nèi)，冰箱保存。3、酚標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL ）與酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（0.1mg/mL） 酚標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL ）:稱取結(jié)晶酚1.0克溶于0.1N鹽酸至1000mL。 酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（0.1mg/mL）:準(zhǔn)確吸取酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液（ 1mg/1mL） 10.0 mL于100mL 容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，貯存冰箱中可保存一個(gè)月。4、0.5%鐵氰化鉀溶液稱取5g鐵氰化鉀和15g硼酸，

6、分別溶于400mL蒸餾水中，溶解后兩液混合，再加蒸 餾水至1000mL，置于棕色瓶中暗處保存。5、O.1mol/L pH10碳酸鹽緩沖液（37 C時(shí)）稱取無(wú)水碳酸鈉 6.36g及碳酸氫鈉3.36g溶解于蒸餾水中，稀釋至 1000mL。6、0.01mol/L pH8.8 Tris 緩沖液稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸餾水溶解并稀釋到1000mL，此即為0.1mol/LTris溶液。取上液100mL，加蒸餾水約 700mL，再加0.1mol/L醋酸鈉100mL，混勻后用 1 %醋酸調(diào)pH到8.8，用蒸餾水稀釋至 1000mL。7、酶液AKP （10mg , 10U/mg ）用0.

7、01mol/L Tris緩沖液稀釋成每 mL含0.71.0單位的酶溶 液。實(shí)驗(yàn)操作取干凈試管8支，編號(hào)，按下表操作。特別注意準(zhǔn)確吸取酶液、基質(zhì)液及標(biāo)準(zhǔn)液。管號(hào)123456SB0.04mol/L 基質(zhì)液（mL)0.100.200.300.400.801.00水（mL）1.401.301.201.100.700.501.501.50碳酸鹽緩沖液（含（mL）AAP)1.501.501.501.501.501.501.501.50搖勻37 C，保溫5min0.1mg/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液（mL） 0.10 酶液（mL）0.100.10 0.100.100.100.100.10充分搖勻，37 C準(zhǔn)確保溫15mi n0.5%鐵氰化鉀（mL）2.002.00 2.002.002.02.002.002.00混勻，室溫放置 10min以B管調(diào)零，讀記在510nm處的各管光密度值 OD，并填入下表，計(jì)算有關(guān)數(shù)據(jù)并作 圖。如按林貝氏法可如下進(jìn)行：列表并計(jì)算記入各有關(guān)數(shù)據(jù)。底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響AvV 口呂號(hào)t1t2t3t4t5t6S光密度ODV1/VS1/S（1）計(jì)算出各管的酶活性單位 ODt/ODsX0.01,此數(shù)代表反應(yīng)速度（V）。計(jì)算出各管底物濃度：基質(zhì)液濃度叮反應(yīng)總液量=04迦