生物化學與分子生物學：第14章 DNA的生物合成

1、第十四章第十四章 DNA的生物合成的生物合成 DNA Replication 1. DNA與染色體與染色體-DNA高度盤繞成基因組高度盤繞成基因組 原核生物原核生物DNA l 真核生物染色體真核生物染色體DNA 2. DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) DNA的生物合成又稱的生物合成又稱DNA復(fù)制。復(fù)制。 復(fù)制（復(fù)制（replication）是指遺傳物質(zhì)的傳代，是指遺傳物質(zhì)的傳代， 以母鏈以母鏈DNA為模板，按照堿基配對原則指導為模板，按照堿基配對原則指導 合成子鏈合成子鏈DNA的過程。的過程。 復(fù)制復(fù)制 親代親代DNA 子代子代DNA 第一節(jié)第一節(jié) DNA復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律 l DNA復(fù)制的方式為

2、半保留復(fù)制復(fù)制的方式為半保留復(fù)制 (semi- conservative replication) l DNA復(fù)制的形式為雙向復(fù)制復(fù)制的形式為雙向復(fù)制 (bidirectional replication) l DNA復(fù)制的過程為半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的過程為半不連續(xù)復(fù)制 (semi-discontinuous replication) 一、一、DNA 以半保留方式進行復(fù)制以半保留方式進行復(fù)制 （semiconservative replication） DNA復(fù)制時，母鏈復(fù)制時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，解開為兩股單鏈， 各自作為模板，按堿基配對規(guī)律合成與模各自作為模板，按堿基配對規(guī)律合成與模 板

3、互補的子鏈，形成子代板互補的子鏈，形成子代DNA雙鏈，其中雙鏈，其中 一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股 單鏈則是合成的，故稱單鏈則是合成的，故稱半保留復(fù)制半保留復(fù)制。 n子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 半保留復(fù)制的實驗依據(jù)半保留復(fù)制的實驗依據(jù) 1958年，年，Messelson 和和Stahl 用實驗證實。用實驗證實。 1、把細菌放在含把細菌放在含15NH4Cl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的培養(yǎng)液中培養(yǎng) 若干代，密度梯度離心分離出若干代，密度梯度離心分離出DNA是是 含含15

4、N的的重重DNA。 2、把含把含15N-DNA的細菌放的細菌放14NH4Cl普通普通培培 養(yǎng)液中培養(yǎng)。子一代的養(yǎng)液中培養(yǎng)。子一代的DNA是是中等密中等密 度度DNA 。 3、繼續(xù)培育出子二代，其繼續(xù)培育出子二代，其DNA則是則是中等中等 密度密度DNA與普通與普通DNA各占一半。各占一半。 DNA半保留復(fù)制的實驗證據(jù)半保留復(fù)制的實驗證據(jù) 含含N15-DNA的細菌的細菌 培養(yǎng)于培養(yǎng)于 14NH4Cl 培養(yǎng)液培養(yǎng)液 第一代第一代 第二代第二代 梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果 培養(yǎng)于培養(yǎng)于 14NH4Cl 培養(yǎng)液培養(yǎng)液 重重DNA 普通普通DNA 中等密中等密 度度DNA DNA 半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)

5、制的意義 l按半保留復(fù)制的方式，子代保留了親代按半保留復(fù)制的方式，子代保留了親代 DNA的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳過程的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳過程 的相對保守性。的相對保守性。 l遺傳的保守性是相對的，而不是絕對的。遺傳的保守性是相對的，而不是絕對的。 自然界還存在著普遍的變異現(xiàn)象。自然界還存在著普遍的變異現(xiàn)象。 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T C C A T G A C A G G

6、 T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母鏈母鏈DNA 復(fù)制過程中形成的復(fù)制過程中形成的 復(fù)制叉復(fù)制叉 子代子代DNA （動畫（動畫1） lDNA復(fù)制時，從復(fù)制起始點復(fù)制時，從復(fù)制起始點(origin) ) 向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向 相反的復(fù)制叉，稱為相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制雙向復(fù)制。 二、二、 DNA復(fù)制從起點的兩個方向延伸復(fù)制

7、從起點的兩個方向延伸- 雙雙 向向 復(fù)復(fù) 制制(bidirectional replication) l原核生物是單點起始雙向復(fù)制。其環(huán)形原核生物是單點起始雙向復(fù)制。其環(huán)形DNADNA 為單復(fù)制子，只有一個復(fù)制起始點。為單復(fù)制子，只有一個復(fù)制起始點。 l真核生物是多復(fù)制子雙向復(fù)制。其線形真核生物是多復(fù)制子雙向復(fù)制。其線形DNADNA 有多個復(fù)制起始點，形成多個復(fù)制子。有多個復(fù)制起始點，形成多個復(fù)制子。 （復(fù)制子復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位，一個是獨立完成復(fù)制的功能單位，一個 復(fù)制起始點起始的復(fù)制起始點起始的DNADNA復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制子復(fù)制子 replicon ）。）。 A. 環(huán)

8、狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點及復(fù)制起始點 B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉 C. 復(fù)制接近終止點復(fù)制接近終止點(termination, ter) ori ter A B C 原核生物原核生物DNA復(fù)制復(fù)制 原核生物的原核生物的DNA雙向復(fù)制形成雙向復(fù)制形成結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 復(fù)制復(fù)制 3 真核生物真核生物DNA復(fù)制復(fù)制 三、三、DNA 復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)性復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)性 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向 3 5 3 3 5 前導鏈前導鏈 (leading strand) 后隨鏈后隨鏈 (lagging stran

9、d) 岡崎片段岡崎片段 前導鏈前導鏈(leading strand) ：復(fù)制方向與解鏈：復(fù)制方向與解鏈 方向一致的子鏈。領(lǐng)頭鏈復(fù)制是連續(xù)的。方向一致的子鏈。領(lǐng)頭鏈復(fù)制是連續(xù)的。 后隨鏈后隨鏈(lagging strand) ：復(fù)制方向與解鏈：復(fù)制方向與解鏈 方向相反的子鏈。隨從鏈的復(fù)制是不連續(xù)的，方向相反的子鏈。隨從鏈的復(fù)制是不連續(xù)的， 形成多個岡崎片段。形成多個岡崎片段。 岡崎片段（岡崎片段（Okazaki fragment）：1968年，年， 日本科學家岡崎用電鏡觀察到，原核生物大日本科學家岡崎用電鏡觀察到，原核生物大 小在一千至二千核苷酸范圍，真核生物數(shù)百小在一千至二千核苷酸范圍，真核生

10、物數(shù)百 個核苷酸。復(fù)制中不連續(xù)的個核苷酸。復(fù)制中不連續(xù)的DNA片段。片段。 第二節(jié)第二節(jié) DNA復(fù)制的酶學和拓撲學變化復(fù)制的酶學和拓撲學變化 參與參與DNA復(fù)制的酶與物質(zhì)：復(fù)制的酶與物質(zhì)： 1、模板、模板(template)底物底物 2、 dNTPs（N: A , G , C , T ） 3、解螺旋酶（解鏈酶）（、解螺旋酶（解鏈酶）（helicase) 4、拓撲異構(gòu)酶（、拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase) 5、單鏈、單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白SSB 6、DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase, DNA-pol) 7、引物酶（、引物酶（primase) 8、引物（、引物（pri

11、mer) 9、 DNA連接酶（連接酶（ligase) 10、其他因子、其他因子 1、復(fù)制的基本化學反應(yīng)：核苷酸和核苷酸之、復(fù)制的基本化學反應(yīng)：核苷酸和核苷酸之 間，通過間，通過3,5磷酸二酯鍵的生成而逐一聚磷酸二酯鍵的生成而逐一聚 合。反應(yīng)底物是合。反應(yīng)底物是 dNTP，加入單鏈的是，加入單鏈的是 dNMP 。 2、復(fù)制的方向性：新鏈只能從、復(fù)制的方向性：新鏈只能從5-端向端向3-端延端延 長（所有新生成的長（所有新生成的RNA或或DNA單鏈其方向單鏈其方向 都是都是53，模板鏈與之反向互補平行）。，模板鏈與之反向互補平行）。 3 3 5 5 模板鏈模板鏈 新生鏈新生鏈 復(fù)制的化學反應(yīng)復(fù)制的化

12、學反應(yīng) 24 3,5磷酸二酯鍵的生成磷酸二酯鍵的生成 一、一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合 （DNA polymerase, DNA-pol) （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol I DNA-pol II DNA- pol DNA聚合酶的多種活性聚合酶的多種活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性: ? 能切除引物及突變的能切除引物及

13、突變的 DNA片段。片段。 能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶 1、 DNA- pol ： 結(jié)構(gòu)：由結(jié)構(gòu)：由10種亞基組成的不對稱異聚合體。其種亞基組成的不對稱異聚合體。其 中中組成核心酶。組成核心酶。 功能：功能：真正的復(fù)制酶真正的復(fù)制酶，亞基具聚合活性。亞基具聚合活性。 亞基有亞基有35核酸外切酶活性和堿核酸外切酶活性和堿 基選擇功能?；x擇功能。 個核心酶個核心酶 1個個 -復(fù)合物復(fù)合物 （ 、 、 、 、 、 6種亞基）種亞基） 1對對 -亞基（可亞基（可 滑動的滑動的DNA夾夾 子）子） 全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括

14、： 2、DNA-pol II 有有3 5核酸外切酶活性和聚合酶活性，主核酸外切酶活性和聚合酶活性，主 要參與要參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)（損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)（SOS修復(fù)）。修復(fù)）。 3、DNA-pol I 單一肽鏈的大分子，二級結(jié)構(gòu)以單一肽鏈的大分子，二級結(jié)構(gòu)以-螺旋為主，螺旋為主， 從從A至至R共共18個個-螺旋肽段。螺旋肽段。I螺旋與螺旋與O螺旋之螺旋之 間有較大的空隙，可容納間有較大的空隙，可容納DNA鏈。鏈。圖圖 小片段：小片段：AF螺旋區(qū)螺旋區(qū) 大片段（大片段（Klenow片段）：片段）：GR螺旋區(qū)螺旋區(qū) pol I 323個氨基酸個氨基酸 小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切

15、酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是分子生物片段是分子生物 學常用的工具酶。學常用的工具酶。 DNA-pol I作用：作用： l 切除引物和突變片段；切除引物和突變片段； （53核酸外切酶活性）核酸外切酶活性） l 復(fù)制和修復(fù)中的空隙填補；復(fù)制和修復(fù)中的空隙填補； （DNA聚合酶活性）聚合酶活性） l 復(fù)制中的錯誤校讀。復(fù)制中的錯誤校讀。 （35核酸外切酶活性）核酸外切酶活性） 5 A G C T T C A G G A T

16、A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 l 3 5 外切酶活性外切酶活性 l 5 3 外切酶活性外切酶活性 ? 切除引物和突變的切除引物和突變的 DNA片段。片段。 能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 （二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶主要有聚合酶主要有5種。種。 DNA-pol：具引物酶活性：具引物酶活性(合成含合成含RNA+DNA 的引物的引物) DNA-pol：似：似DNA-pol (修復(fù)，低保真修復(fù)，低保真) DNA-pol：線粒體：線粒體DN

17、A復(fù)制酶復(fù)制酶 DNA-pol：真正的復(fù)制酶，似：真正的復(fù)制酶，似DNA-pol ， 并有解螺旋酶活性并有解螺旋酶活性 DNA-pol：似：似DNA-pol 真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較聚合酶的比較 E.Coli真核細胞真核細胞 功能功能 填補復(fù)制中的填補復(fù)制中的DNA空隙，空隙，DNA 修復(fù)和重組修復(fù)和重組 復(fù)制中的校對，復(fù)制中的校對，DNA修復(fù)修復(fù) DNA修復(fù)修復(fù) 線粒體線粒體DNA合成合成 錯配修復(fù)（校對和填補缺口）錯配修復(fù)（校對和填補缺口） DnaG 引物酶引物酶 前導鏈和后隨鏈合成，錯配修復(fù)前導鏈和后隨鏈合成，錯配修復(fù) （一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇（

18、一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇 u利用利用“錯配錯配”實驗發(fā)現(xiàn)，實驗發(fā)現(xiàn)，DNA pol 對核對核 苷酸的參入（苷酸的參入（incorporation）具有選擇功能。）具有選擇功能。 uDNA pol 對嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親對嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親 和力，因此實現(xiàn)其選擇功能。和力，因此實現(xiàn)其選擇功能。 二、二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對聚合酶的堿基選擇和校對 功能實現(xiàn)復(fù)功能實現(xiàn)復(fù) 制保真性制保真性 u原核生物原核生物DNA -pol I、真核生物、真核生物DNA - pol 和真核生物和真核生物DNA -pol 具有具有35外外 切酶活性，可以在復(fù)制過程中辨認并切除切酶活性，可以在

19、復(fù)制過程中辨認并切除 錯配的堿基，對復(fù)制錯誤進行校正，這個錯配的堿基，對復(fù)制錯誤進行校正，這個 過程叫過程叫錯配修復(fù)（錯配修復(fù)（mismatch repair）。 u原核生物原核生物DNA -pol I 還具有還具有53外切外切 酶活性，切除引物和突變片段酶活性，切除引物和突變片段 。 （二）（二）DNA聚合酶的核酸外切酶活性辨認聚合酶的核酸外切酶活性辨認 切除錯配堿基并加以校正切除錯配堿基并加以校正 DNA復(fù)制的保真性，依賴三種機制：復(fù)制的保真性，依賴三種機制： 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律遵守嚴格的堿基配對規(guī)律; 聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能; 復(fù)制出錯時

20、有即時的校讀功能。復(fù)制出錯時有即時的校讀功能。 三、三、 DNA解鏈伴有解鏈伴有DNA分子拓撲學變化分子拓撲學變化 (一）參與解鏈的酶與因子一）參與解鏈的酶與因子 主要有解螺旋酶、引物酶和單鏈主要有解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 1、解螺旋酶、解螺旋酶（helicase） 又稱解鏈酶又稱解鏈酶,復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白rep(replication), DnaB 。 其作用是利用其作用是利用ATP供能來解開供能來解開DNA雙鏈雙鏈。 （動畫（動畫2） 復(fù)制起始時復(fù)制起始時DnaA辨認辨認E.coli上復(fù)制起上復(fù)制起 始點始點oriC（origin C），），DnaC輔助輔助 DnaB(

21、解螺旋酶解螺旋酶)結(jié)合起始點并打開雙鏈。結(jié)合起始點并打開雙鏈。 （DnaA DnaB DnaC 分別是 分別是dnaA dnaB dnaC基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物) 。E.coli基因圖基因圖 E. Coli 基因圖基因圖 又稱又稱 DnaG （ dnaG 基因產(chǎn)物）?；虍a(chǎn)物）。 作用是催化形成短片段的作用是催化形成短片段的RNA引物，在引物，在 其其3-OH端開始復(fù)制。端開始復(fù)制。 引物引物 (primer)：由引物酶催化合成的短由引物酶催化合成的短 鏈鏈RNA分子。約十數(shù)個至數(shù)十個核苷分子。約十數(shù)個至數(shù)十個核苷 酸。酸。 2、引物酶（、引物酶（primase） 3、單鏈、單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋

22、白 （single stranded DNA binding protein，SSB） 由由177個氨基酸殘基組成的相同四聚體，個氨基酸殘基組成的相同四聚體， 結(jié)合單鏈結(jié)合單鏈DNA的跨度約的跨度約32個核苷酸單位。復(fù)個核苷酸單位。復(fù) 制過程中不斷與制過程中不斷與單鏈單鏈DNA結(jié)合和脫離。結(jié)合和脫離。 作用是在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)作用是在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài) 并保護單鏈并保護單鏈的完整。的完整。 (二二) DNA拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶（DNA topoisomerase） 拓撲拓撲：指物體或圖像作彈性移位而又保持物：指物體或圖像作彈性移位而又保持物 體不變的性質(zhì)。體不變的性質(zhì)。 復(fù)制

23、解鏈中的復(fù)制解鏈中的DNA分子繞雙螺旋軸高速解鏈分子繞雙螺旋軸高速解鏈 旋轉(zhuǎn)（旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)（旋轉(zhuǎn)100次次/秒），會造成解鏈前方的秒），會造成解鏈前方的 DNA分子纏繞打結(jié)，通過拓撲異構(gòu)酶的作用，分子纏繞打結(jié)，通過拓撲異構(gòu)酶的作用， 以改變以改變DNA分子拓撲構(gòu)象，解除分子拓撲構(gòu)象，解除DNA分子纏分子纏 繞打結(jié)。繞打結(jié)。 10 8 局部解鏈后局部解鏈后 復(fù)制過程正超螺旋的形成：復(fù)制過程正超螺旋的形成： l 拓撲酶拓撲酶I 切斷切斷DNA雙鏈中一股，切口處的斷端繞雙鏈中一股，切口處的斷端繞 螺旋軸按照松弛螺旋的方向轉(zhuǎn)動，解除螺旋軸按照松弛螺旋的方向轉(zhuǎn)動，解除 DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中的纏繞打結(jié)，適當時候解

24、鏈旋轉(zhuǎn)中的纏繞打結(jié)，適當時候 又把切口封閉。催化反應(yīng)不需又把切口封閉。催化反應(yīng)不需ATP。 l 拓撲酶拓撲酶II 1. 無無ATP時，切斷時，切斷DNA分子雙鏈某一部分子雙鏈某一部 位，通過切口使超螺旋松馳，解除解位，通過切口使超螺旋松馳，解除解 鏈過程中的纏繞打結(jié)。鏈過程中的纏繞打結(jié)。 2. 在利用在利用ATP供能情況下，斷端在拓撲供能情況下，斷端在拓撲 酶催化下恢復(fù)連接。酶催化下恢復(fù)連接。 （動畫（動畫3） 作用：連接作用：連接DNA單鏈單鏈3-OH末端和相鄰末端和相鄰 DNA單鏈的單鏈的5-P末端末端,使二者生成使二者生成3,5-磷磷 酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的

25、DNA單鏈連單鏈連 成完整的鏈。需成完整的鏈。需ATP。 圖圖 四、四、DNA連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單 鏈缺口鏈缺口（DNA ligase） HO5 3 3 5 DNA連接酶連接酶 ATP ADP 53 53 P O O- O- O P O O- O- O （動畫（動畫4） 提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P結(jié)果結(jié)果 DNA聚合酶聚合酶引物或延長中的引物或延長中的 新鏈新鏈 游離游離dNTP 去去PPi (dNTP)n+1 連接酶連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)不連續(xù)連續(xù)鏈連續(xù)鏈 拓撲酶拓撲酶切斷、整理后的兩鏈切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀

26、態(tài)改變拓撲狀態(tài) DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3 ,5 - 磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生成的比較 第三節(jié)第三節(jié) 原核生物原核生物DNA生物合成過程生物合成過程 一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始 l復(fù)制起始點結(jié)構(gòu)：復(fù)制起始點結(jié)構(gòu)：E.coli固定的復(fù)制起始固定的復(fù)制起始 點點OriC跨度為跨度為245bp，包含有，包含有3組串連重組串連重 復(fù)序列和復(fù)序列和2對反向重復(fù)序列。對反向重復(fù)序列。 E.coli復(fù)制起始點復(fù)制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29

27、 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列 5 3 5 3 l復(fù)制起始過程：復(fù)制起始過程： DnaA辨認結(jié)合于辨認結(jié)合于OriC重復(fù)序列，重復(fù)序列，DnaC輔輔 助助DnaB結(jié)合于結(jié)合于OriC附近，解開局部雙鏈附近，解開局部雙鏈 ， 置換出置換出DnaA，DnaG（引物酶）進入，形成（引物酶）進入，形成 引發(fā)體引發(fā)體。 繼續(xù)解鏈，繼續(xù)解鏈，SSB結(jié)合保護解開的單鏈，拓結(jié)合保護

28、解開的單鏈，拓 撲異構(gòu)酶發(fā)揮作用，引物酶催化生成撲異構(gòu)酶發(fā)揮作用，引物酶催化生成RNA引引 物，復(fù)制起始完成物，復(fù)制起始完成 。 3 5 Dna C Dna B DnaG 3 5 ori C DnaB, DnaC ,DnaG與與OriC 共同形成引發(fā)體共同形成引發(fā)體 （動畫（動畫5） 3 5 3 5 引物引物 3 HO 5 SSB Dna C Dna B 引物酶引物酶 3 HO 引物酶引物酶 5 復(fù)制起始完成復(fù)制起始完成 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 二、復(fù)制的延長二、復(fù)制的延長 復(fù)制的延長是在復(fù)制的延長是在DNA-pol催化下以催化下以dNTP 為原料，以為原料，以dNMP方式逐個加入到引物或延方式

29、逐個加入到引物或延 長中的新鏈長中的新鏈3-OH末端上，逐個形成末端上，逐個形成3,5-磷磷 酸二酯鍵酸二酯鍵, 復(fù)制方向復(fù)制方向53，復(fù)制特點：半不，復(fù)制特點：半不 連續(xù)性復(fù)制。連續(xù)性復(fù)制。圖圖1 圖圖2 DNA復(fù)制速度相當快，復(fù)制速度相當快，E.coli 20分鐘可繁殖分鐘可繁殖 一代，每秒可參入一代，每秒可參入2500個核苷酸。個核苷酸。 3 5 3 5 引物引物 5 SSB Dna B 引物引物 酶酶 5 復(fù)制延長復(fù)制延長 拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶 5 聚合酶聚合酶 （動畫（動畫6） 復(fù)制延長過程復(fù)制延長過程 5 5 5 RNA酶酶 OHP5 DNA-pol dNTP 5 5 P ATP

30、ADP+Pi 5 5 DNA連接酶連接酶 子鏈上不連續(xù)性片段的連接子鏈上不連續(xù)性片段的連接 三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止 原核生物環(huán)狀原核生物環(huán)狀DNA采取單復(fù)制子雙向復(fù)采取單復(fù)制子雙向復(fù) 制。領(lǐng)頭鏈和隨從鏈上的制。領(lǐng)頭鏈和隨從鏈上的RNA引物被引物被RNA 酶（或酶（或DNA-pol I）水解，空隙由）水解，空隙由DNA-pol I來催化填補，來催化填補，DNA連接酶將各片段連接連接酶將各片段連接 成完整的成完整的環(huán)狀環(huán)狀新鏈，新鏈，形成兩個完整的形成兩個完整的環(huán)狀環(huán)狀 DNA。 ori 53 原核生物復(fù)制終止原核生物復(fù)制終止 ter ter ori 3 3 5 5 5 3 3 53 5 5

31、 3 3 5 5 3 3 5 + 5 3 3 3 3 5 5 5 （動畫（動畫7） 細胞周期細胞周期 DNADNA合成期合成期 G1 G2 S M 第四節(jié)第四節(jié) 真核生物的真核生物的DNA生物合成生物合成 細胞周期可分為：細胞周期可分為： S期期（Synthetic phase, DNA合成期）合成期） G2期期（ Gap , DNA合成后期）合成后期） M期（期（mitotic phase, 有絲分裂期有絲分裂期） G1期（期（Gap , DNA合成前期）合成前期） DNA在每個細胞周期只復(fù)制一次在每個細胞周期只復(fù)制一次 1. 真核生物真核生物DNADNA復(fù)制是多復(fù)制子雙向復(fù)制，復(fù)制是多復(fù)制

32、子雙向復(fù)制， 有多個起始點；有多個起始點； 2. 復(fù)制有時序性，復(fù)制子以分組方式激活復(fù)制有時序性，復(fù)制子以分組方式激活 而不是同步起動；而不是同步起動； 一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始 真核生物復(fù)制起始與原核生物基本相似，真核生物復(fù)制起始與原核生物基本相似， 有以下特點：有以下特點： 3. 復(fù)制起始點序列較原核復(fù)制起始點序列較原核oriC短。短。 酵母復(fù)制起始點含酵母復(fù)制起始點含11bp的自主復(fù)制序列：的自主復(fù)制序列： A(T)TTTATA(G)TTTA(T)。 4. DNA-pol具引物酶活性，具引物酶活性，DNA-pol具解具解 螺旋酶活性。螺旋酶活性。 5. 增殖細胞核抗原增殖細胞核抗原(

33、PCNA)參與復(fù)制起始。參與復(fù)制起始。 其作用與原核其作用與原核DNA- pol的的亞基相似，亞基相似， 形成鉗卡形成鉗卡DNA的夾子的夾子 。 二、復(fù)制的延長二、復(fù)制的延長 真核生物復(fù)制延長與原核生物基本相似，真核生物復(fù)制延長與原核生物基本相似， 有以下特點：有以下特點： 1 1、DNA-pol生成引物（生成引物（RNA+小段小段DNA）。）。 2 2、DNA-pol在增殖細胞核抗原在增殖細胞核抗原PCNA協(xié)助下協(xié)助下 合成合成DNADNA子鏈子鏈 。 3 3、引物和岡崎片段較原核生物短，單個復(fù)制引物和岡崎片段較原核生物短，單個復(fù)制 子復(fù)制速度慢，但總體速度不慢。子復(fù)制速度慢，但總體速度不慢

34、。 3 5 5 3 前導鏈前導鏈 3 5 3 5 親代親代DNA 后隨鏈后隨鏈 引物引物 核小體核小體 三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體 四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制 1、真核生物復(fù)制終止、真核生物復(fù)制終止 真核生物復(fù)制終止與原核生物基本相似。真核生物復(fù)制終止與原核生物基本相似。 不同點：不同點： DNA為線形，復(fù)制結(jié)束時兩條為線形，復(fù)制結(jié)束時兩條 新生子鏈的新生子鏈的5端的引物切下后形成的空隙需端的引物切下后形成的空隙需 端粒酶修補并形成端粒。端粒酶修補并形成端粒。 n線性線性DNA 復(fù)制的末復(fù)制的末 端端 5 3

35、 端粒酶端粒酶RNA 5 3 3 OH 5 3 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 反折反折 5 DNA-polDNA-pol，連接酶，連接酶 TTTGGGTTTGG-OH 3 AAACCCAAACCCAAACCC TTTGGGTTTGGGTTTGGG-OH3 AAACCCAAACCCAAACCC 端粒酶端粒酶RNA 2、端粒（、端粒（telomere） 是真核生物染色體是真核生物染色體線性線性DNA分子末端分子末端 的膨大的粒狀結(jié)構(gòu)，由的膨大的粒狀結(jié)構(gòu)，由DNA和結(jié)合蛋白和結(jié)合蛋白 形成。在維持染色體的穩(wěn)定性和形成。在維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)復(fù) 制的完整性有重要作用。制的完整性有重要作用。 端粒端粒DNA序列

36、共同特點是富含序列共同特點是富含T、G短短 序列的重復(fù)序列序列的重復(fù)序列(Tn G n )x 3、端粒酶、端粒酶(telomerase) 是一種是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。 端粒酶端粒酶RNA (An C n )x 端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶端粒酶 端粒酶以其端粒酶以其RNA為模板，在其協(xié)同蛋白參為模板，在其協(xié)同蛋白參 與下，其逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成與下，其逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成DNA單鏈。單鏈。 l端粒酶借助其端粒酶借助其RNA與與DNA單鏈有互補單鏈有互補 堿基序列而辨認結(jié)合。堿基序列而辨認結(jié)合。 l以以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄，進行母鏈為模板的逆轉(zhuǎn)錄

37、，進行母鏈 DNA的延長。的延長。 l延長以后的單鏈反折，延長以后的單鏈反折，DNA-pol以其以其 3- OH末端復(fù)制末端復(fù)制DNA 單鏈，填補引物單鏈，填補引物 切除后的缺失，切除后的缺失，DNA連接酶完成連接。連接酶完成連接。 端粒酶（端粒酶（TBP）類似于反轉(zhuǎn)錄酶）類似于反轉(zhuǎn)錄酶，其中的其中的RNA與與DNA的的3端端 互補并作為合成互補并作為合成cDNA的模板延長的的模板延長的 T2G4 3-端端 作為作為5-端端 DNA合成的模板合成的模板 端粒酶端粒酶(telomerase)的作用機制的作用機制爬行模型爬行模型 通過通過TGTG鏈的回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（鏈的回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（GGGG

38、氫鍵）氫鍵）實現(xiàn)實現(xiàn) 端粒酶位置的調(diào)整端粒酶位置的調(diào)整 復(fù)制子鏈復(fù)制子鏈 進一步加工進一步加工 第五節(jié)第五節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription) l逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄: :以以RNA為模板指導合成為模板指導合成DNA的過的過 程，因與轉(zhuǎn)錄方向相反故稱逆轉(zhuǎn)錄（反程，因與轉(zhuǎn)錄方向相反故稱逆轉(zhuǎn)錄（反 轉(zhuǎn)錄）。轉(zhuǎn)錄）。 l19701970年，年，H. Temin和和D. Baltimore分別從分別從 R N A病毒中發(fā)現(xiàn)病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶( r e v e r s e transcriptase)。此類此類RNA病毒稱病毒稱逆轉(zhuǎn)錄病逆轉(zhuǎn)錄病 毒毒(r