拮抗化療藥物體外免疫抑制模型的建立及活性成分篩選

1、拮抗化療藥物體外免疫抑制模型的建立及活性成分 篩選以小鼠脾淋巴細(xì)胞為試驗(yàn)材料 , 將有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)或細(xì)菌脂多糖(LPS)與化療藥物5氟尿嘧啶(5 Fu)聯(lián)合 使用建立了體外免疫抑制模型，并比較了多糖樣品對(duì)5 Fu抑制淋 巴細(xì)胞增殖的拮抗作用。結(jié)果表明 , 在供試樣品中 ,F1 1 龍須菜 (Gracilaria lemaneiformis)中分離多糖和BW滬農(nóng)靈芝1號(hào)(Ganoderma lucidum) 子實(shí)體中分離 對(duì) 5 Fu 產(chǎn)生的輕度抑制有 完全拮抗作用,19號(hào)滬農(nóng)靈芝1號(hào)(G. lucidum)子實(shí)體中分離 樣品刺激淋巴細(xì)胞增殖活性最好 , 但對(duì) 5 Fu 產(chǎn)生的

2、抑制基本無拮 抗作用 , 表明樣品刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性與拮抗化療藥物抑制 淋巴細(xì)胞增殖的活性無正相關(guān)性。免疫抑制 ; 化療藥物 ; 多糖腫瘤是危害人類健康的嚴(yán)重疾病 , 對(duì)其發(fā)生機(jī)制及治療手段 的研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn) 1 。目前化療仍是臨床上治療腫 瘤的三大有效手段之一 , 化療在殺滅患者體內(nèi)的癌細(xì)胞方面有很 好的效果 , 但均有不同程度的毒副作用 , 如化療后往往會(huì)出現(xiàn)白 細(xì)胞減少 , 特別是中性粒細(xì)胞減少 , 血小板減少等情況 2, 嚴(yán)重 的會(huì)造成人體免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷 3, 限制了化 療藥物的使用 , 影響到癌癥的治療效果。 因此 , 尋找能減輕化療藥 物免疫抑制副作用

3、的活性成分 , 對(duì)提高化療藥物的治療效果和擴(kuò)大其適用范圍有重要的意義。研究表明 ,多糖具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性 , 其抗腫瘤活性 主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能而間接實(shí)現(xiàn)的 4, 實(shí)驗(yàn)表明多 糖在減輕化療藥物免疫抑制副作用方面效果明顯 5 。如今多糖 藥物作為免疫調(diào)節(jié)劑已經(jīng)成為輔助化療、 放療和手術(shù)治療腫瘤的 重要組成部分。但多糖種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜 , 為了更好地對(duì)其進(jìn) 行開發(fā)利用 , 需要建立有效的活性篩選模型。常用的篩選減輕化 療藥物免疫抑制副作用的模型多為動(dòng)物體內(nèi)模型 6,7, 結(jié)果可 信度高 , 但由于其耗時(shí)長、 費(fèi)用高、所需的樣品量大等缺點(diǎn) ,不適 用于大量樣品的初篩及樣品分離過程中各

4、組分活性的跟蹤檢測(cè)。 若利用高效的體外細(xì)胞篩選模型進(jìn)行初步篩選 , 獲得相關(guān)的線索 后再進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證 , 將能大大提高活性成分的篩選效率。雷 林生等 8 利用不同品系小鼠淋巴細(xì)胞相互作用后會(huì)引起淋巴細(xì) 胞增殖這一特性 , 在細(xì)胞水平上考察了靈芝多糖拮抗抗腫瘤藥物 免疫抑制作用的效果 ,但該模型應(yīng)用少、 操作較復(fù)雜 ,因此需要建 立方便、有效的篩選體系。5 氟尿嘧啶 (5 Fu) 為臨床上常用的化療藥物 , 主要副作用為 骨髓抑制 , 對(duì)在體內(nèi)處于增殖狀態(tài)的免疫細(xì)胞損傷較大。為了篩 選拮抗化療藥物免疫抑制作用的樣品 , 本研究取用小鼠的脾淋巴 細(xì)胞,通過外加有絲分裂原刺激其增殖 , 模擬體內(nèi)

5、免疫細(xì)胞快速 增殖的狀態(tài) ,再與 5 Fu 合用,建立免疫抑制模型。常用的有絲分 裂原刀豆蛋白A(ConA)和細(xì)菌脂多糖(LPS)分別刺激T淋巴細(xì)胞 和 B 淋巴細(xì)胞增殖 , 為考察樣品對(duì)不同淋巴細(xì)胞亞群的影響 , 本 試驗(yàn)選用ConA和LPS兩種工具藥，建立體外拮抗化療藥物免疫抑 制作用的篩選模型。 該模型的建立為從多糖中開發(fā)輔助化療的藥 物奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 樣品來源供試樣品均為本研究室分離純化得到的多糖。 其中 FB1 為灰 樹花 (Grifola frondosa) 子實(shí)體中分離獲得 ( 制備方法見文獻(xiàn) 9),F11 為龍須菜 (Gracilaria le

6、maneiformis) 中分離獲得 ( 制備方法見文獻(xiàn) 10),BW 、glpds1a 、19號(hào)為靈芝 (G. lucidum) 滬 農(nóng)靈芝1號(hào)子實(shí)體中分離獲得(BW制備方法見文獻(xiàn) 11,glpds1a 、 1 9制備方法見文獻(xiàn) 12) 。劉艷芳, 等: 拮抗化療藥物體外免疫抑制模型的建立及活性 成分篩選1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c 小鼠, C57BL/6j 小鼠, 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限 責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK滬)2007 0005,812周齡，體重20 25 g, 雌雄不拘。1.1.3 試劑與儀器刀豆蛋白A(ConA)、細(xì)菌脂多糖(LPS)、5氟尿嘧啶(5 Fu)均購自 S

7、igma 公司;Alamar Blue Assay kit 購自 Biosource 公 司;RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、臺(tái)盼藍(lán)、胎牛血清 （FBS）購自 Gibco 公司 ; 青霉素和鏈霉素購自 Amresco 公司 , 其它試劑 均為國產(chǎn)分析純?cè)噭oulter Z series 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 （Coulter Electronics 公司）,Synergy HT酶標(biāo)儀（BioTek 公司）,CO2 培養(yǎng)箱（Thermo Forma 公司 ）, 倒置顯微鏡 （Olympus 公司 ） 。1.2 方法1.2.1 試劑配制RPMI1640培養(yǎng)液:取RPMI1640培養(yǎng)基粉末一包，用無菌超純水定容至1 L,待粉末充分溶解后，加入NaHCO3 2 g,同時(shí)分別加 入青霉素和鏈霉素至其濃度為30卩g/mL和100卩g/mL,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2,過0.22卩m濾膜后分裝，于4C保存，使用時(shí)加 入 10%滅活的胎牛血清。紅細(xì)胞裂解溶液:9