脊髓傷后脊髓組織一氧化氮合酶活性的動態(tài)變化及其意義

1、如果對您有幫助！感謝評論與分享 脊髓傷后脊髓組織一氧化氮合酶活性的動 態(tài)變化及其意義 導(dǎo)讀：本文脊髓傷后脊髓組織一氧化氮合酶活性的動態(tài)變化及其意義 僅供參考，如果覺得很不錯，歡迎點評和分享。 一氧化氮 (Nitric oxide, NO) 是由一氧化氮合酶 (Nitric oxide synthase, NOS) 催化左旋精氨酸 (L-arginine, L-Arg) 而產(chǎn)生， 在生物 體內(nèi)具有廣泛而多樣的生物學(xué)效應(yīng)， 在生理狀態(tài)下能傳遞信使、 調(diào)節(jié) 血管張力；在病理狀態(tài)下參與腦缺血損害，具有神經(jīng)毒性作用 1 。 然而它在脊髓損傷中的作用尚不清楚。 由于 NO 半衰期極短， 難以直 接測定 ,

2、加之它在體內(nèi)不能貯存，所以本實驗通過測定大鼠脊髓壓迫 傷后 NOS 活性的動態(tài)變化來間接反應(yīng) NO 的變化規(guī)律， 以利于進一 步探討 NO 與脊髓繼發(fā)性損傷的關(guān)系。 1 材料與方法 1.1 實驗動物與分組 健康、封閉群 SD 大鼠 42 只 ,體質(zhì)量 (280 士 30)g隨機分為假手術(shù)組及根據(jù)后路壓迫傷后取材的時間分為 0、5、10、20、30 和 60min 組，每組 6 只。 1.2 試劑及器材 L-2,3,4,5-3H-arginine 、Dowex AG50w-X8 、 NADPH 、鈣調(diào)蛋白均購自 Sigma 公司 ,其余試劑為國產(chǎn) AR 級。 Megafuge1.0R 低溫離心機

3、為日本產(chǎn)品， Beckman LS5000 CE 液體 閃爍儀為美國產(chǎn)品， CPS-1A 超聲波粉碎機為上海超聲波儀器廠產(chǎn)品。 1.3 方法 1.3.1 動物模型的制備動物用 1% 戊巴比妥鈉 30mg/kg 腹腔注射 醫(yī)學(xué)專用，取后正中切口，切除T 810椎板，暴露脊髓，按Nystrom 方法2后路壓迫脊髓 (35.0g/10min) 。假手術(shù)組僅行脊髓暴露而不致 傷。 1.3.2 脊髓標(biāo)本的采集 按分組時間要求處死動物后 ,立即浸入冰 水中，取傷段脊髓或相應(yīng)部位脊髓置于冰冷的 HEPES 緩沖液中 (20mmol/L , pH7.4)，勻漿，超聲粉碎。立即置于 4 C低溫離心機 中離心(1

4、5000r/min x 30min)。 1.3.33HCitrulline 檢測 將上述 25ml 上清液加于含有 2mmol/L NADPH 、0.5mmol/L CaCl2 、10 g/L 鈣 調(diào)蛋白 的 50mmol/L HEPES 緩 沖 液 中 ， pH 為 7.4 。 然 后 加 入 25ml3HL-arginine (25m ci/25 m l),置于 24 C恒溫水浴箱中 30min 。立即加入含有 2mmol/LEDTA 的 20mmol/L HEPES 反應(yīng) 停止液中，過 Dowex AG 層析柱，于 Beckman 液閃儀中測定 3H-citrulline 的放射活性。

5、1.34 蛋白含量的測定采用改良 Lowry 法3 測定蛋白含量。 1.3.5 NOS 活性表示 NOS 活性表示為每分鐘每毫克蛋白形成的 3H-citrulline 的量。創(chuàng)傷后各時相 NOS 活性以與假手術(shù)組相比而 得的相對值表示。 1.3.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用 F 檢驗和 t 檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。 2 結(jié)果 脊髓壓迫傷后即刻，傷段脊髓組織 NOS 活性升高到正常脊髓的 1.42 倍，有顯著差異 (P0.01); 壓迫傷后 5 min 達最高點，為正常 脊髓組織 NOS 的 3.24 倍；之后迅速下降，至傷后 60min ，傷段脊 髓組織 NOS 活性基本接近正常 (P0.05 ，) 3 討

6、論 脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。 脊髓原發(fā)性損傷后引起了一 系列級聯(lián)放大的生化物質(zhì)改變， 從而造成了不可逆的繼發(fā)性結(jié)構(gòu)損害。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多因素都參與脊髓創(chuàng)傷后繼發(fā)性損傷過程， 諸如興奮性氨 基酸、單胺、神經(jīng)肽、血小板活化因子等。然而通過逆轉(zhuǎn)或阻止這些 因素的變化并未能有效地阻斷繼發(fā)性脊髓損傷的發(fā)生。 這可能是由于 脊髓創(chuàng)傷后繼發(fā)性損傷的發(fā)生是多因素參與的復(fù)雜過程， 對其病理生 理過程的認(rèn)識尚不夠深入，未能找到阻止其發(fā)生、發(fā)展的根本環(huán)節(jié)。 近年來，人們認(rèn)識到 NO 是一種機體內(nèi)無處不有的小分子物質(zhì)， 具有 廣泛而多樣的生物效應(yīng)。 為探討其在脊髓創(chuàng)傷中的作用， 本實驗根據(jù) NOS 催化同位素標(biāo)

7、記的 L-Arg 生成同位素標(biāo)記的瓜氨酸 (L-citrulline) 和 NO 的原理， 首次動態(tài)地觀測了大鼠脊髓壓迫傷后 NOS 活性的變 化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓壓迫傷后 NOS 活性迅速升高，傷后 5 min 達最高 點，此后又迅速下降，傷后 60 min 恢復(fù)至正常水平。脊髓壓迫傷后 NOS 活性迅速而短暫升高 ,說明機體具有調(diào)節(jié) NOS 活性的內(nèi)在機制， 然而目前對其調(diào)節(jié)的確切機制尚不清楚 ,可能有如下因素參與： (1) 對 缺血刺激的直接反應(yīng)。 NO 的主要功能之一是調(diào)節(jié)血管張力和抗血小 板粘附與聚集。 在腦組織中， NO 是調(diào)節(jié)血流的主要介質(zhì) ,腦缺血后導(dǎo) 致了結(jié)構(gòu)性 NOS 活性迅速

8、升高 4 。在脊髓組織中 , NO 可能存在著 同樣的作用 ,當(dāng)脊髓受壓時導(dǎo)致局部缺血 ,從而需要大量的 NO 來維持 局部血供 , 以達到內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。 (2) 結(jié)構(gòu)性 NOS 是鈣依賴性酶，而 脊髓損傷后可導(dǎo)致大量的鈣離子細(xì)胞內(nèi)流5。(3)N0S的磷酸化與脫 磷酸化。 Bredt 等發(fā)現(xiàn)腦 NOS 有兩個基團，能被不同的蛋白激酶磷 酸化，導(dǎo)致 NOS 活性下降6。脊髓創(chuàng)傷后缺血可使 ATP 迅速消耗 而引起 NOS 脫磷酸，也將會導(dǎo)致 NOS 活化。 (4)底物及輔助因子對 NOS活性的影響。NOS催化底物L(fēng)-Arg和02反應(yīng)需要大量的還原 性輔助因子，如底物不足或缺少輔助因子 ,都將會影響反應(yīng)的進行。 脊髓損傷后由于 N0S 活性迅速升高使底物及輔助因子大量消耗，從 而導(dǎo)致 N0S 活性下降。 (5)反應(yīng)產(chǎn)物對 N0S 活性的影響。 N0 具有 強氧化性，能使 N0S 的巰基亞硝?；?，從而使 N0S7 失活。另 外，N0尚能氧化NMDA受體中關(guān)鍵的巰基群，從而減少鈣內(nèi)流，降 低 N0S 的活性8。 脊髓損傷后 N0S 活性早期迅速升高的意義何在， 目前尚不清楚。 一方面可