7帶有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳膠管

1、實驗十二聚丙烯酰胺凝膠電泳 一、目的 了解聚丙烯酰胺盤狀電泳的基本原理和操作技術(shù)。 二、原理 聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量交聯(lián)劑 在催化劑和加速劑的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)而制得的。聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)眼的孔徑可用改變凝膠液中單體的濃度來加以控制。一般分離蛋白 質(zhì)選用 7.5聚丙烯酰胺凝膠，分離比較大的分子，如核糖體核酸時則用2.5 凝膠。 凝膠電泳分辨力較高。 三、器材 1 .電泳儀（600V）及盤狀電泳槽。 2電泳玻璃管（用堿性較低的玻璃管） ，內(nèi)徑 57毫米，長 80100毫 米。 3. 玻璃架（制膠時用來垂直插放玻璃管） 。 4. 微量注射器或微量

2、吸管。 5. 帶長針頭的注射器。 6. 日光燈。 7. 帶有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳膠管。 四、試劑和材料 1 .唾液。 2.貯液和工作溶液： 按下頁表配制。 五、操作方法 一般先制分離膠，再在分離膠上面制作濃縮膠。 l.分離膠的制備 將貯液由冰箱取出等達(dá)到室溫后再按下表中的比例配制工作溶液。先將分 離膠液與過硫酸分別放在真空干燥器中。待抽出溶解的空氣后取出，趕快混 勻，用帶長針頭的注射器吸取一定量的膠液，沿著管壁加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻璃 管中（玻璃管的一端用帶有玻璃珠或小段玻璃棒的乳膠管塞住，乳膠管中加二 滴 40蔗糖后插在玻璃架上），灌入的分離膠液高約 65 厘米，然后立即用帶彎針頭的小注射器

3、在已加入的分離膠液面上，距 膠面約 0.l 厘米處沿管壁緩緩加人 35 毫米高的蒸餾水層，切忌使加入之水呈 滴狀墜入膠液，這樣會使頂部凝膠濃度變稀，改變凝膠孔徑。 水層放好后，靜置膠液使進(jìn)行聚合反應(yīng)。正常情況下 10 分鐘開始聚合，應(yīng) 控制在 30 分鐘到 1 小時內(nèi)完成聚合。 剛加水時看出有界面，后逐漸消失。等到再看出界面時表明凝膠已經(jīng)聚 合，再靜置 30 分鐘便聚合完全。貯液 12 3100ml 溶液中的含量 1mol/L 鹽酸 48ml Tris 36.6g TEMED 0.23ml Acr 28.0g Bis 0.753g 過磷酸銨 0.14g 1mol/L 鹽酸 48mlpH 8.9

4、 工作溶液混合 xx 乳膠（分離膠） 1份1號貯液 2份2號貯液 1份水 4份3號貯液pH8.9,凝膠濃度7% 4Tris 5.98g TEMED 0.23ml Acr 10.0g6.7大孔乳膠（濃縮膠） 1 份 4號貯液 2份5號貯液 1 份6號貯液 567 電極緩沖液 Bis 2.5g 核黃素 4.0g 蔗糖40g4份7號貯液pH6.7，凝膠濃度2.5% Tri 6.0g 甘氨酸 28.8g 加水到1 L8.3用時稀釋10倍 2濃縮膠的制備 用注射器吸去分離膠上的水層，用濾紙條吸去殘留的水液（濾紙不要接觸 膠面）。 按比例混勻濃縮膠液（也預(yù)先抽氣，抽氣時不要與核黃素混合，抽完氣后 再混合）

5、，先用這種膠液很快漂洗一下分離膠的頂部，除去漂洗液后，按上法 加人濃縮膠液約 0.5l 厘米高，并立即仔細(xì)加水層。然后在距管10厘米處用日 光燈照射進(jìn)行光聚合。正常情況下照射 67 分鐘就可看到濃縮膠顯乳白色，表 明聚合開始。 繼續(xù)照半小時，使聚合完全。 除去水層，吸干后用上電極槽緩沖液洗滌，再將這種緩沖液加至管頂，在 室溫放置 0. 51 小時就可使用。 濃縮膠應(yīng)在臨用前制備。 3加樣 盤狀電泳所需樣品很少，用 1 毫克毫升濃度的樣品液每管需 5100 微 升。 加樣前先把玻璃管下邊的橡膠塞除去，要注意先拉開乳膠管使空氣進(jìn)人， 再拔下來，防止將凝膠拉壞。下槽中放滿緩沖液，把管固定在上槽的洞中

6、，要 保證凝膠管垂直和橡皮塞孔密封不漏。管的下端懸上一滴緩沖液，再把上槽放 在下槽上，避免管下有氣泡。管中凝膠表面上部及上槽灌滿電極緩沖液。 將 4 號貯液 1 份，水 3份， 20蔗糖溶液 4 份，混和，然后取唾液 3微 升，加上述混合液 0.15 毫升，混勻后小心地加在濃縮膠與電極緩沖液界面處， 因樣品液比重大，即平鋪在凝膠表面。 指示染料一般用溴酚藍(lán)或酚紅，通常每管加 0的染料溶液0.005毫升， 指示染料與樣品混合后加人。 4電泳 加完樣后接通電源，負(fù)極在上，正極在下。調(diào)節(jié)電流，開始時用 l2 毫安 /管，電泳12分鐘，再升高電流到約3-5毫安/管，不要一開始電流很高。 電流最好不超過

7、 5 毫安，以免產(chǎn)熱過多，必要時應(yīng)進(jìn)行冷卻或在冷庫內(nèi)進(jìn)行。 當(dāng)指示染料遷移到凝膠柱的下端附近時就可停止電泳，關(guān)閉電源，取出玻 管。 緩沖液可再行使用，但上下槽緩沖液不能混淆，因下槽緩沖液中已混人催 化劑及氯離子（快離子），如將它當(dāng)作上槽液就要影響電泳效果。 5凝膠的取出 將一針頭長約 10厘米的注射器吸滿水。將針頭插入凝膠與管壁之間，并緊 貼管壁，一面注入水一面慢慢旋轉(zhuǎn)玻管并推針前進(jìn)，靠水流壓力和潤滑作用使 玻管內(nèi)壁與凝膠分開，待水從玻管一端流出時，再慢慢將針頭退出。然后去掉 針頭，用注射器向玻管中快速注射水，將凝膠壓出玻管。如凝膠濃度較高，取 出困難，可用 10的甘油水溶液代替水注入。一般剝膠方向是從濃縮膠端開 始。 6固定 為防止凝膠柱內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散，需進(jìn)行固定。方法是： 把剝出的凝膠柱浸泡在 7乙酸或 12 5三氯乙