赤芍總苷的提取純化與質(zhì)量檢查設(shè)計方案

1、赤芍總苷的提取純化與質(zhì)量檢查設(shè)計方案1文獻(xiàn)背景赤芍為毛茛科植物芍藥 Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍 Paeonia veitchiiLynch的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分為芍藥苷、 芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥花苷等單萜苷類化合物，總稱赤 芍總苷，可改善機體微循環(huán)，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有廣泛的藥理活 性1-3，是一種可用于保健食品的中藥。1.1赤芍總苷背景意義在藥理學(xué)上，赤芍總苷對血液具有抗凝血、抗血栓以及抗內(nèi)毒素和改善微循環(huán)的作用。并且赤芍總苷對缺血性損傷如心肌缺血同樣具有保護作用，正是這樣的良好使用療效，我們需要對

2、赤芍總苷進(jìn)行更多的研究，來保證臨床的使用療效。1.2提取研究現(xiàn)狀目前報道的赤芍總苷提取工藝文獻(xiàn)中，多采用正交試驗設(shè)計法5。即分別稱取赤芍藥材若干（通常 800g）,以不同的提取液（水、乙醇）分別按正交試驗 設(shè)計表試驗，濾過，合并濾液，量取體積，即得正交試驗各試驗的提取液。1.3純化研究現(xiàn)狀目前報道的赤芍總苷純化工藝文獻(xiàn)中，多采用正丁醇萃取法和大孔樹脂吸附 法。即將提取過程中，包括糖類、脂類等許多雜質(zhì)在內(nèi)的浸膏提取液，補充蒸 餾水至藥材的2倍量，作為待純化樣品溶液。純化方法1 （正丁醇萃取法）：取上述待純化樣品溶液 200ml，取等量石油 醚萃取3次，除去石油醚層，然后用水飽和后的正丁醇萃取 3

3、次，收集正丁醇層， 再用200ml蒸餾水洗1次，棄去水層，減壓回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器 中干燥。純化方法2 （大孔樹脂吸附法）：D101大孔吸附樹脂100g,經(jīng)95%乙醇浸 泡12h，充分溶脹后裝柱，蒸餾水洗至無醇味，備用。上述待純化樣品溶液取 200ml，上樹脂柱，3倍量蒸餾水洗，再用3倍量的乙醇洗脫，收集20%洗脫組 分，減壓回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。1.4質(zhì)量控制赤芍中赤芍總苷質(zhì)量控制包括性狀鑒別（顏色、氣味）、薄層鑒別（藍(lán)紫色斑點）、以及對其進(jìn)行高效液相色譜的含量測定（檢測波長為 230nm,理論板數(shù) 按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于 3000）以及水分、熾灼殘渣，重金屬等檢

4、測。2 赤芍飲片的質(zhì)量檢查2.1 性狀 : 本品應(yīng)呈圓柱形,稍彎。表面棕褐色,粗糙,有縱溝和皺紋,并有須 根痕和橫長的皮乳樣突起,有的外皮易脫落。質(zhì)硬而脆,易折斷,斷面粉白色或 粉紅色,有的有裂隙。氣微香,味微苦、酸澀。2.2鑒別：取本品粉末0.5g,加乙醇10ml，振搖5分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣 加乙醇 2ml 使溶解,作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品,加乙醇制成每 1ml 含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（附錄W B）試驗，吸取上述兩 種溶液各4卩，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（ 40：5：10：0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5%香

5、草醛硫酸溶液， 加熱至斑點顯色清晰。 供試品色譜中， 在與對照品色譜相應(yīng)的位置上， 顯相同的 藍(lán)紫色斑點。2.3含量測定： 照高效液相色譜法（通則 0512）測定。2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（40: 65）為流動相；檢測波長為 230nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于 3000。2.3.2 對照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥 36小時的芍藥苷對照品適量， 精密稱定， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液，即得。2.3.3 供試品溶液的制備取本品粗粉約0.5g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密

6、加入甲醇 25ml，稱定 重量，浸泡 4 小時，超聲處理 20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的 重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2.3.4 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10卩,1注入液相色譜儀，測定，即 得。本品含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.8%。參考文獻(xiàn)： 2015 版中國藥典3 赤芍總苷的提取工藝3.1 指標(biāo)成分的選擇及含量測定赤芍中所含豐富的苷類成分總稱赤芍總苷， 為赤芍的主要活性部位， 其中以 芍藥苷的含量最高，選擇芍藥苷作為含量測定的指標(biāo)成分。3.1.1 HPLC 色譜條件的優(yōu)化選擇色譜柱的選擇：考察 Hypersil ODS(150mm*4.6

7、mm,5 pm)和 Hypersil BDS(200mm*4.6mm,5 pm)流動相選擇：流動相考察甲醇 -水系統(tǒng)、甲醇 -0.05%磷酸溶液系統(tǒng)、乙腈 -水 及乙腈 -0.05%磷酸溶液系統(tǒng)。流速選擇：流速考察 0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min3.1.2 對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品10.63mg,置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度， 搖勻，即得對照品貯備液 (每 lml 含芍藥苷對照品 425.2pg)。3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取對照品貯備液溶液 (425.2pg/ml)0.5ml、l.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0

8、ml 置 10ml 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述不同 濃度對照品溶液各10卩注入液相色譜儀，按前述色譜條件分別測定其峰面積。 以對照品濃度 X 為橫坐標(biāo)，峰面積積分值 Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.1.4 供試品溶液的制備及測定 取提取液，稀釋至一定體積，濾過，即得供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 p,注入液相色譜儀，測定，由外標(biāo)一點法計算即得芍藥 苷含量。3.2 提取溶媒的篩選：赤芍中所含苷類成分極性較大， 在水、乙醇等親水性溶劑中溶解度較好。 本實驗以芍藥苷的含量為評價指標(biāo)，考察水和不同濃度的乙醇對芍藥苷的提取效 率，篩選赤芍藥材的最佳提取溶媒。見表

9、 1：表1不同提取溶媒芍藥苷含量提取溶媒水50%乙 醇70%乙醇溶媒用量（倍）666提取次數(shù)（次）222提取時間（h）1.51.51.5芍藥苷含量（）3.3正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝331因素水平設(shè)置溶劑法提取中影響提取效率的因素主要有溶媒用量、提取時間及提取次數(shù)等。根據(jù)實際情況，設(shè)置醇用量、提取時間及提取次數(shù)為3個考察因素，因素水平設(shè)置見表2。表2因素-水平表因素-水平A提取溶媒 （倍）B提取時間（h）C提取次數(shù)（次）1411261.5238233.3.2實驗安排及結(jié)果考察影響提取效能的主要因素乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)及相應(yīng)水平， 選取正交表L9（34）作正交試驗，所選因素一水平見表 2。

10、稱取川赤芍藥材約50g, 按L9（34）正交試驗表按排試驗，以芍藥苷含量（芍藥苷含量=提取液中芍藥苷質(zhì)量/ 稱取的藥材量*100%）為評價指標(biāo)。試驗方案見表 3表3 3L9（34）正交試驗表表頭ABCD芍藥苷含量（%）列號1234111112122231333421235223162312731328321393321IIIIIISS333驗證試驗以優(yōu)化工藝條件重復(fù)試驗3次，驗證試驗結(jié)果見表4表4驗證試驗結(jié)果試驗試驗號投料量固形物固形物RSDRSD芍藥苷芍藥苷萬案(kg)得率平均得率含量平均含量(%)(%)(%)(%)(%)(%)1234赤芍總苷(TPG的純化工藝的優(yōu)化4.1上樣液預(yù)處理赤芍醇

11、提液減壓濃縮至無醇味，加水適量分散溶解、過濾定容，制成每毫升含0.2g生藥(0.2g ml-1)的溶液，備用。4.2大孔吸附樹脂型號篩選取AB-8型和D-101型大孔吸附樹脂各20ml，裝于樹脂柱中(徑高比為1:8), 取樣液40ml上樣。先用3BV蒸餾水，再用5BV 20%乙醇洗脫，合并乙醇洗脫 液，測定，結(jié)果見表5。從芍藥苷吸附解析率和殘液中芍藥苷含量綜合考慮，選 擇樹脂種類。表5樹脂動態(tài)吸附實驗結(jié)果樹脂型號上樣液含量(mg)吸附-解吸率(%)殘液中含量(%)D101207.31AB-8207.314.3上樣濃度考察取AB- 8型大孔吸附樹脂3份，每份20ml，裝柱(徑高比為1:8)，分別

12、取含 生藥濃度為0.1g- ml-1、0.2g ml-1、0.3g ml-1樣品液上樣，吸附流速為 1.0ml min-1。然后用3BV水洗脫，再以5BV 20%乙醇洗脫，按4.3色譜條件進(jìn) 行測定醇洗脫液中芍藥苷含量，結(jié)果見表6。表6上樣濃度考察結(jié)果上樣濃度（g ml-1）0.10.20.3芍藥苷洗脫量（mg）洗脫率（%）4.4泄漏曲線考察取AB- 8型大孔吸附樹脂20ml，裝于樹脂柱中（徑高比1:8）,取樣品液60ml 上樣，吸附流速為1.0ml min-1。收集流出液，每5ml為一流分。按如下色譜條 件測定，繪制泄漏曲線，確定最大上樣量。色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（250

13、mM 4.6mm,5卩m）乙腈為流動相 A， 水為流動相B，按表7進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0ml min-1;柱溫25C；檢測波長 230nm。表7流動相梯度洗脫時間表時間/min流動相A/%流動相B/%01486209552514864.5吸附流速的考察取AB- 8型大孔吸附樹脂3份，每份20ml，裝柱（徑高比為1:8），取樣液60ml 上樣，吸附流速分別為1.0ml min-1、2.0ml min-1、3.0ml min-1。進(jìn)行動態(tài)吸 附后，先用3BV水洗脫，再用5BV 20%乙醇洗脫，按4.3色譜條件進(jìn)行測定， 結(jié)果見表8表8吸附流速考察結(jié)果吸附流速(ml min-1)123芍藥苷洗脫量

14、(mg)洗脫率(%)4.6樹脂徑高比考察取直徑依次為1.4cm、1.5cm、1.6cm的樹脂柱3根，分別加入AB- 8型大孔 吸附樹脂各20ml，裝柱(徑高比為1:6、1:8、1:10)，取樣液60ml上樣，吸附流 速為1.0ml min-1。然后用3BV水洗脫，再以5BV 20%乙醇洗脫，收集乙醇洗 脫液，按4.3色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表9。表9樹脂徑高比考察結(jié)果樹脂徑咼比1:61:81:10芍藥苷洗脫量(mg)洗脫率(%)4.7水洗除雜體積考察取AB- 8型大孔吸附樹脂四份，每份20ml，裝柱(徑高比1:8)，取樣品液60ml 上樣，吸附流速分別為1.0ml - min-1,進(jìn)行動態(tài)吸附

15、后，分別用1BV、2BV、3BV 和4BV水洗，測定水洗脫液中芍藥苷的含量，計算損失率，結(jié)果見表 10。表10水洗除雜體積考察結(jié)果水洗脫體積(BV)1234水洗液中芍藥苷累積含量（mg）芍藥苷累積損失率（）4.8洗脫溶劑考察取AB- 8型大孔吸附樹脂4份，每份20ml，裝于樹脂柱中（徑高比為1 : 8）, 60ml樣品液上樣，吸附流速分別為1.0ml min-1。然后先以3BV水洗脫，再分 別用20%、40%、60%和80%乙醇洗脫，按4.3色譜條件進(jìn)行測定醇洗脫液中芍 藥苷含量，結(jié)果見表11。表11洗脫溶劑考察結(jié)果洗脫劑乙醇（%）20406080芍藥苷洗脫量（mg）洗脫率（%）4.9洗脫曲線

16、取AB- 8型大孔吸附樹脂20ml，裝于樹脂柱中（徑高比為1:8），60ml樣品液 上樣，吸附流速分別為1.0ml min-1。然后先以3BV水洗脫，再用20%乙醇洗 脫，每10ml收集一份，洗脫液減壓至干，以10ml甲醇復(fù)溶，按4.3色譜條件進(jìn) 行測定醇洗脫液中芍藥苷含量，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑用量。5赤芍中赤芍苷提取物的質(zhì)量控制5.1性狀：棕褐色粉末，氣微香，味微苦、酸澀。5.2鑒別：取本品粉末0.2g，加乙醇10ml，振搖5分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣 加乙醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗

17、，吸取上述兩種溶液各4卩,1分別點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40: 5: 10: 0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相 同的藍(lán)紫色斑點。5.3含量測定：照高效液相色譜法（通則0512）測定。5.3.1色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇 -0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（40:65）為流動相；檢測波長為230nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于 3000。 5.3.2對照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥 36小時的芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成

18、每1ml含0.5mg的溶液，即得。5.3.3供試品溶液的制備取本品粉末約0.2g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 25ml，稱定 重量，浸泡4小時，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的 重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。5.3.4測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10,1注入液相色譜儀，測定，即 得。將提取物中芍藥苷含量換算成藥材中芍藥苷含量， 對比藥典，檢查提取純化 工藝是否合適。2015版中國藥典中規(guī)定赤芍藥材中含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.8%。 5.3.5系統(tǒng)適用性試驗線性關(guān)系考察吸取上述對照品溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5

19、ml、3.0ml，分別置25ml量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10卩注入液相色譜儀分析。以進(jìn)樣量（yg為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回 歸，結(jié)果見表12:表12線性關(guān)系考察結(jié)果芍藥苷對照品（ug）峰面積12345精密度試驗 精密量取已知濃度的芍藥苷對照品溶液 10卩,按液相色譜條件，進(jìn) 樣測定6次，結(jié)果見表13：表13精密度試驗結(jié)果峰面積值平均值RSD(%)123456穩(wěn)定性試驗 取本品，制備供試品溶液，測定芍藥苷于0、2、4、6、8、10小時內(nèi)峰面積，結(jié)果見表14：表14穩(wěn)定性試驗結(jié)果時間(小時)峰面積值平均峰面積值RSD(%)02468重復(fù)性試驗 取本品，一

20、式6份，制備供試品溶液，測定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果見表15：表15重復(fù)性試驗結(jié)果樣品量（g）芍藥苷含量平均含量RSD（%）（mg/g）（ mg/g）123456加樣回收率試驗 取已知含量芍藥苷的本品6份，每份約10mg精密稱定，分 別按樣品中芍藥苷含量精密加入芍藥苷對照品，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，精密量取續(xù)濾液10pl，經(jīng)HPLC分析，測定芍藥苷含量，計算回收率， 結(jié)果見表16:表16加樣回收率試驗結(jié)果取樣量（g） 樣品中芍芍藥苷對芍藥苷測回收率平均回收RSD（%）藥苷量照品加入得量（mg）（%）率（mg）量（mg）5.4水分按中國藥典2015年版四部通則0832的第二法項下操作，

21、取本品粉末約1g,平鋪于恒重的扁形稱量瓶中，厚度v 5mm精密稱定，打開瓶蓋100105C, 烘5小時，蓋好，移至干燥器中冷卻 30分鐘，精密稱定，同樣溫度下在烘1小 時移至干燥器中冷卻30分鐘，精密稱定。直至連續(xù)兩次稱定重量之差v 5mg為 止。按減失重量和稱樣量計算供試樣品中水分含量（ 見表17。表17水分含量樣品編號水分含量/%平均含量/%1235.5熾灼殘渣按中國藥典2015年版四部通則0841進(jìn)行熾灼殘渣的檢測，取本品粉末 約1g，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩緩織灼至完全炭化，放冷至室 溫；加硫酸0.5ml使?jié)駶?，低溫加熱至硫酸蒸汽除盡后，在 500600E熾灼使 完全灰化，移置干燥器內(nèi)，放冷至室溫，精密稱定后，再在500600 E熾灼至恒重。表18熾灼殘渣樣品編