水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測,膠體金免疫層析法

1、水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測，膠體金免疫層 析法 附件5水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測膠體金免疫層析法 (KJ201905)1范圍 木方法規(guī)定了水產(chǎn)品中氯霉素的膠體金免 疫層析快速檢測方法。 本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速測定。 2原理木方法的測定以競爭抑制免疫層析原理為基礎(chǔ)。 樣品中的氯霉素經(jīng)有機(jī)試劑提取，固相萃取小柱凈化，濃縮復(fù)溶后， 氯霉素與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和微孔膜 檢測線(T線)上抗原的結(jié)合，從而致使檢測線色彩深淺的變化。通 過檢測線與控制線色彩深淺比較，對樣品中氯霉素含量進(jìn)行定性判 定。 3試劑和材料除另有規(guī)定外，木方法所用試劑均為分析 純，水為GB/T 6682

2、規(guī)定的2級水。 3. 1試劑3. 1.1正己烷。 3. 1.2丙酮。 3. 1.3乙酸乙酯。 3. 1. 4 乙月青 3. 1. 5 磷酸 2 氫鈉,NaH2P04 2H20。 3. 1. 6 磷酸氫 2 鈉，Na2HP04 12H20。 3. 1. 7氯化鈉3. 1. 8復(fù)溶液：稱取0. 12 g磷酸2氫鈉 (3. 1. 5)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液A； 稱取磷酸氫2鈉7. 16 g (3.1. 6)置于100 mL容量瓶中，用水溶解并 稀釋至刻度，制成溶液B。取溶液A 2.8 mL、溶液B 7.2 mL、氯化 鈉(3. 1.7)0. 85 g,用水溶解并稀釋

3、至100 mL,得磷酸鹽緩沖液，即 為復(fù)溶液。 3. 1. 9丙酮-正己烷(1+9)：丙酮(3. 1. 2)、正己烷(3. 1. 1) 按體積比1： 9混勻。 3. 1. 10丙酮-正己烷(6+4)：丙酮(3. 1. 2)、正己烷(3. 1. 1) 按體積比6： 4混勻。 3.2標(biāo)準(zhǔn)物資 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物資的中文名稱、英文名稱、 CAS登錄號、分之式、相對份子質(zhì)量見表1,純度298.6%。 表1氯霉素參考物資中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、 份子式、相對份子質(zhì)量 中文名稱 英文名稱CAS登錄號 份子式 相對份子量 氯霉素Chloramphenicol 56(7)5(7) C11H12C12N2O

4、5323. 13注：或同等可溯源物資。 3. 3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3. 3.1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL)： 精密稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物資(3.2) 10 mg,置于10 mL容量瓶中，用乙 (3.1.4)溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 mg/mL的氯霉 素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4C避光保存，有效期6個月。 3. 3.2氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液A (10 Hg/mL)：精密量取氯霉 素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL) (3. 3. 1) 0. 1 mL,置于10 mL容量瓶中， 用乙膳(3.1.4)稀釋至刻度，搖勻，制成10 Ug/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn) 中間液A。4C避光保存，有效期3個月。 3. 3.3氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作

5、液(0.01 Ug/mL)：精密移取氯霉 素標(biāo)準(zhǔn)中間液A (10 Ug/mL) (3. 3. 2) 0. 01 mL分別置于10 mL容量 瓶中，用乙睛稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.01 Hg/mL的氯霉素 標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用新配。 3. 4 材料 3. 4. 1 固相萃取小柱：Cleanert Silica, 200 mg/6mL0 LOT： 0170198。 3. 4. 2免疫膠體金試劑盒(在230C、干燥陰涼條件下保 存，在產(chǎn)品有效期內(nèi)使用)。 3. 4. 2. 1金標(biāo)微孔。 3. 4.2.2試紙條或檢測卡。 4儀器和裝備4.1移液器：200 UL、1 niL和5 mLo 4.2渦旋混合

6、器。 4. 3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速&4000 r/mino 4. 4電子天平：感量分別為0. 01 mg和0. 01 go 4. 5樣品濃縮儀：如有需要。 4.6環(huán)境條件：溫度:1525C,相對濕度：W60%。 5分析步驟5.1試樣制備 取具有代表性樣品約500 g, 充分粉碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密 封，標(biāo)記，于常溫保存。 5. 2試樣提取和凈化 準(zhǔn)確稱取試樣6 g (精確至0. 01 g) 置于50 mL具塞離心管中，順次加入1 mL水和8 mL乙酸乙酯(3. 1. 3), 渦旋提取5 min,以4000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層于 50 mL具塞離

7、心管中，加入正己烷25 mL,氯化鈉1 g渦旋混勻，4000 r/min離心1 min,上清液待凈化。5 mL丙酮-正己烷(1+9) (3. 1.9) 淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將待凈化溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取小 柱上，棄去流出液，用5mL丙酮-正己烷(6+4) (3. 1. 10)洗脫，搜 集洗脫液，洗脫液于40C氮?dú)獯蹈?，精密加?00 AL復(fù)溶液(3.1.8), 渦旋混合1 min,作為待測液。 5.3測定步驟5.3. 1檢測卡與金標(biāo)微孔測定步驟 吸取 150 AL樣品待測液于反應(yīng)微孔(3.4.2. 1)中，抽吸510次使混合 均勻，室溫溫育3 min；溫育結(jié)束后，將金標(biāo)微孔中溶液滴

8、加到檢測 卡(3. 4. 2. 2)上的加樣孔中，室溫溫育58 min,對結(jié)果進(jìn)行判定。 5. 3.2試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟 吸取150 PL樣品待測 液于反應(yīng)微孔（3.4.2. 1）中，抽吸510次使混合均勻，室溫溫育 3 min；溫育結(jié)束后，將檢測試紙條（3. 4. 2. 2）吸水海綿端垂直向下 插入反應(yīng)微孔中，室溫溫育3 min,從微孔中取出試紙條，去掉試紙 條下真?zhèn)€吸水海綿，并于5 min內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定。 5. 3. 3檢測卡測定步驟 吸取150 ML樣品待測液滴加到檢 測卡（3. 4. 2. 2）上的加樣孔中，室溫溫育58 min,對結(jié)果進(jìn)行判 定。 5. 4質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同

9、時進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控 實(shí)驗(yàn)。 5. 4. 1空口實(shí)驗(yàn) 稱取空白試樣，依照5. 2和5. 3步驟與 樣品同法操作。 5. 4.2加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白樣品6 g或適當(dāng)（精 確至0.01 g）置于15 mL具塞離心管中，加入180 U L氯霉素標(biāo)準(zhǔn) 工作液（0.01 u g/mL） （3. 3. 3）,使氯霉素濃度為0. 3 Ug/kg, 1式 2份，依照5. 2和5. 3步驟與樣品同法操作。 6結(jié)果判定要求通過對照控制線和檢測線的色彩深淺進(jìn) 行結(jié)果判定。由于長時間放置會引發(fā)檢測線色彩的變化，需在規(guī)定時 間內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀根據(jù)如圖1所示。 6.1無效控制線（C線）不顯色，表明不

10、正確操作或試 紙條/檢測卡無效。 6.2陽性結(jié)果 檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）色 彩比控制線（C線）色彩淺，表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測限, 判定為陽性。 6.3陰性結(jié)果 檢測線（T線）色彩比控制線（C線）色彩 深或檢測線(T線)色彩與控制線(C線)色彩相當(dāng)，表明樣品中氯 霉素含量低于方法檢測限，判定為陰性。 6. 4質(zhì)量控制要求 空白實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性， 加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。 7結(jié)論如被測樣品中氯霉素檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)采取 確證方法進(jìn)行確證檢測。 8性能指標(biāo)8. 1檢測限 氯霉素為0.1 u g/kgo 8.2靈敏度靈敏度應(yīng)298%。 8.3特異性特異性應(yīng)$90%。

11、 8.4假陰性率假陰性率應(yīng)W1%。 8.5假陽性率 假陽性率應(yīng)W10%。 注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A 9其他 木方法所述試 劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方 法時不做限定。方法使用者在使用替換試劑、試劑盒或操作步驟前， 須對其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足木方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 22338008動物源性食品中氯霉 素類藥物殘留量測定(包括所有修改單)。 附錄A定性方法性能計(jì)算表樣品情況a檢驗(yàn)結(jié)果b 總數(shù)陽性陰性陽性Nil N12 N1.=N11+N12陰性N21 N22 N2. =N21+N22 總數(shù) N. 1 二N11+N21 N. 2二N12+N22 N二Nl.+N2. 或 N. 1+N. 2 顯著性差異(x2) x 2= (| N12-N211 (D) 2/ (N12+N21),自 由度(df)=l 靈敏度(p+) p+二 N11/N1.特異性(p-)p-=N22/N2. 假陰性率(pf-) pf-二N12/N1. =1 -靈敏度 假陽性率(pf+) pf+二N21/N2. =1-特異性 相對準(zhǔn)確度 (N11+N22) /(Nl. +N2.) 注: N:任何特訂單元的結(jié)果數(shù)，第1個下標(biāo)指行，第2個下標(biāo)