紫外分光光度計測蛋白質(zhì)含量

1、紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量1儀器與試劑TU-1 9 01紫外一可見分光光度計，比色管,吸量管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5、00 mg、mL-l溶液0、9% NaCl洛液，待測蛋白質(zhì)溶液2實驗方法與原理本實驗采用紫外分光光度法測定蛋口質(zhì)含量。紫外一可見吸收光譜法乂稱紫 外一可見分光光度法,它就是研究分子吸收19 0 nm750nm波長范圍內(nèi)得吸收 光譜，就是以溶液中物質(zhì)分子對光得選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來得一類分析方 法.紫外-可見吸收光譜得產(chǎn)生就是山于分子得外層價電子躍遷得結(jié)果，其吸收光 譜為分子光譜，就是帶光譜。蛋口質(zhì)中酪氨酸與色氨酸殘基得苯環(huán)含有共軌雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收 紫外光得性質(zhì)，其最大

2、吸收峰位于280 nm附近（不同得蛋白質(zhì)吸收波長略有差 別）在最大吸收波長處，吸光度與蛋口質(zhì)溶液得濃度得關(guān)系服從朗伯一比耳定 律。該測定法具有簡單靈敬快速高選擇性,且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品， 低濃度得鹽類不干擾測定等優(yōu)點。3實驗步驟3、1準(zhǔn)備工作3、3、1啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。3、3、2在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選 擇光度測量,設(shè)置測量條件（測量波長等）。3、3、3將空白放入測量池中，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零。3、3、4標(biāo)準(zhǔn)曲線得制作。3、2測量工作3、2、1吸收曲線得繪制用吸量管吸取2mL5、00m g/mL

3、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于1 0 mL比色管中，用 0、9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0、9% N&C1溶 液為參比，在190 nm40 0 nm區(qū)間，q全波段掃描。3、2、2標(biāo)準(zhǔn)曲線得制作用吸量管分別吸取 0、5、1、0、1、5、2、0、2、5m L 5、00 mg、niLl標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只1 0 mL比色管中，用0、9% N&C1溶液稀釋至 刻度，搖勻用1 cm石英比色皿，以0、9%NaC 1溶液為參比，在280 nm處分別 測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液得吸光度A決記錄所得讀數(shù).3、2、3樣品測定取適量濃度得待測蛋口質(zhì)溶液3mL,按上述方法測定2 78 n m處得吸光 度。平行測

4、定三份。4實驗結(jié)果記錄4、1吸收曲線根據(jù)全波段掃描結(jié)果，已知蛋白質(zhì)得最大吸收峰位于280nm左右。(Ama x=2 7 8nm )4、2標(biāo)準(zhǔn)曲線得制作以蛋口質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c (mg/mL)吸光度A0、250、1750、500、33 80、7 50、5381、000、6 981、250 x 892繪制得蛋口質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖所示。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線O 2O.-0.20,6 0.&濃度 mg/ml)1.21.44、3測定結(jié)果根據(jù)兩次平行測定得結(jié)果,得出未知蛋口溶液吸光度、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出得 蛋口溶液含量如下表所示。平行測定次數(shù)樣品液吸光度A樣品溶液濃度C

5、(mg/mL)10、36 4 40、51 820、 36600、52 0所測溶液平均濃度：00、5 1 9 (mg/mL)5實驗討論本次實驗采用得蛋白溶液為牛血清蛋白。蛋白質(zhì)中酪氨酸與色氨酸殘基得苯環(huán)含有共轆雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在27 528 0 nm處具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶 液在最大吸收波長處得吸光度與其濃度成正比,符合朗伯-比耳定律，因此可作定 量分析。山于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸與色氨酸得含量不同，所處得微環(huán)境也不同, 所以不同蛋白質(zhì)溶液在280 nm得光吸收值不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為1、0 mg/mL得180 0種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280 nm得吸光度在0、3

6、3、0之 間，平均值為1、25 0、51.上圖為文獻(xiàn):中以0、9%Na C 1溶液為參比液，將濃度為0、3 mg/mL得 蛋口質(zhì)溶液,進(jìn)行波長掃描測量，得到吸收曲線。從吸收曲線可得0、3 mg/ mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液得最大吸收波長為279 nm,此波長下得吸光度為0、1 6 7。根據(jù)文獻(xiàn)顯示，儀器誤差、不適當(dāng)?shù)眯?zhǔn)曲線、測量中不符合朗伯一比爾定 律得光學(xué)、化學(xué)因素、顯色反應(yīng)條件、共存離子干擾以及儀器測試條件等都就是 影響分光光度計準(zhǔn)確性得因素最讓我印象深得便就是儀器誤差，主要體現(xiàn)在樣品池得使用上。一般來說， 為得到最準(zhǔn)確得定量結(jié)果，應(yīng)使用同一樣品池測量標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測樣品，雖然這 樣比較麻煩，根據(jù)

7、文獻(xiàn)我們知道，最好得樣口池應(yīng)有平整、嚴(yán)格平行得光學(xué)表 面，否則會使光束偏離，引起表觀吸光度誤差；另外，樣品池在樣品架上得方位應(yīng) 始終不變，這樣不致于使測量空白與樣品時得光學(xué)效應(yīng)不一致而產(chǎn)生誤差.因此我認(rèn)為，今后在使用分光光度計得時候,若要平行測定樣品，應(yīng)該使用 同一樣品池來裝樣品，不要像以往一樣，因為麻煩、圖快，就使用兒個不同得樣 品池來測定，列外，師姐一再強(qiáng)調(diào)樣品池在裝不同樣品之前一定要用去離子水、 樣液潤洗兒遍，保證不會有上一樣品得殘留，并且將光面上得殘留物擦干，不能留 有指紋，否則都會影響測定得準(zhǔn)確性。另外，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得時候也有一定得講究，根據(jù)文獻(xiàn)我們知道注 理論上 僅用一個已知濃度得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量其吸光度便可進(jìn)行定量分析校正，測得得吸光 度值除以濃度便得斜率。但就是有很多儀器與樣品因素會偏離朗伯-比耳定律. 若校準(zhǔn)工作曲線不準(zhǔn)確，會造成定量分析結(jié)果較大得誤差。因此要得到一條標(biāo)準(zhǔn) 工作曲線，應(yīng)測量至少三個已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液得吸光度，標(biāo)準(zhǔn)樣品得濃度范 圍應(yīng)包括待測樣濃度然后用線性回歸方法找到所測數(shù)據(jù)與校正曲線得最佳擬 合，以決定哪種類型得工作曲線可給出最佳得擬合。我認(rèn)為在平時得實驗當(dāng)中， 我們得待測樣濃度經(jīng)常沒有在標(biāo)準(zhǔn)樣品得濃度范圍內(nèi)，若樣品濃度不在此范圍 內(nèi)，可能會導(dǎo)致線性關(guān)系不佳，造成實驗誤差，而本次實驗得標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，待 測樣品濃度落在標(biāo)準(zhǔn)樣品范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)