動(dòng)物組織細(xì)胞玻璃化凍存方法的研究進(jìn)展

1、動(dòng)物組織細(xì)胞玻璃化凍存方法的研究進(jìn)展vol_23no.2mar.20o7科技通報(bào)bulletinofscienceandtechnology第23卷第2期20o7年3月動(dòng)物組織細(xì)胞玻璃化凍存方法的研究進(jìn)展楊瓊霞,張紹志,俞雅芳,胡軍祥(1.浙江林學(xué)院林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江l臨安311300;2.浙江大學(xué)制冷與低溫研究所,杭州310027)摘要:動(dòng)物組織細(xì)胞的玻璃化凍存是一項(xiàng)新的深低溫冷凍保存方法,已成功地凍存了多種動(dòng)物細(xì)胞,具有較高的實(shí)際應(yīng)用和研究價(jià)值.本文論述幾種主要組織細(xì)胞玻璃化凍存方法的研究及其進(jìn)展,如小鼠胰島和卵母細(xì)胞,大鼠卵巢,牛胚泡,牛卵母細(xì)胞,豬胚胎,人胚胎等,不同冷凍保護(hù)劑,

2、玻璃化溶液和冷凍程序?qū)?xì)胞存活率的影響.并提出了玻璃化凍存動(dòng)物以及組織細(xì)胞的問題與展望.關(guān)鍵詞:動(dòng)物生理學(xué);細(xì)胞;玻璃化;冷凍保存;組織中圖分類號(hào):q955文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:a文章編號(hào):lool-7119(2007)02020205advancesincry0preservati0nofanimaltissuesandcellsbyvitrificationyangqiong-xia,zhangshao-zhi2,yuva-fangi,hujunxiangf1.collegeofforestryandbiotechnology,zhejiangforestryuniversity,tjnan3113

3、00,china2.refrigeration&cryonicengineeringinstitute,zhejianguniversity,hangzhou310027,china)abstract:thevitrifiedcryopreservationofanimaltissuesandcellsisanewultralowtemperaturefreezingmethod,severalanimaltissuesandhumanembryoshavebeensuccessfullycryopreserved,thismethodwillbeofgreatvaluetoappli

4、cationandresearch.thispapersummarizestheresearchprogressinvitrifiedcryopreservationofseveralanimaltissuesandcells,forexample,pancreaticisletandoocytesofmouse,ovariesofrat,blastocystsandoocytesofbovine,embryosofpigandhuman,andtheeffectofdifferentcryoprotectants,vitrificationsolutionsandcoolingprocedu

5、resonsurvivalrate.thequestionandprospectofvitrifiedcryopreservationonanimaltissuesandcellsaresuggested.keywords:animalphysiology;cells;vitrification;cryopreservation;tissues生物材料的玻璃化凍存技術(shù)是目前低溫生物學(xué)和低溫醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容.1985年rau和fahy采用高濃度的混合多元保護(hù)劑組成的玻璃化溶液(vs1).以較快的降溫速率使小鼠胚胎玻璃化凍存獲得成功【-1.之后.人們用玻璃化方法成功地凍存了哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞,精

6、子,胰島,胚胎神經(jīng)細(xì)胞以及各個(gè)階段的胚泡等.玻璃化是指在降溫過程中.不產(chǎn)生冰晶.而使溶液固化的過程.它與常見的液體變晶體或部分結(jié)晶的凍結(jié)過程不同.玻璃態(tài)固體分子間的的作用和液態(tài)相比無明顯的變化.玻璃態(tài)物質(zhì)與液體同屬于近程有序.遠(yuǎn)程無序的結(jié)構(gòu).而且比收稿日期:2006一o104基金項(xiàng)目:浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(y304053),國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50606032)作者簡介:楊瓊霞(1982一),女,浙江寧波人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物生理學(xué)和低溫生物學(xué)的研究.通訊作者:胡軍祥,教授,博士,e?mail:hjxyhzcnc.corn第2期動(dòng)物組織細(xì)胞玻璃化凍存方法的研究進(jìn)展203液體近

7、程有序程度更高【2】.玻璃化凍存就是利用高濃度的低溫保護(hù)劑組成玻璃化溶液.使其溶質(zhì)與水分子發(fā)生水合作用,增加溶液的粘稠度.降低降溫過程中冰晶的形成速度,從而使細(xì)胞在急劇降溫的過程得到保護(hù).它使細(xì)胞在冷凍和解凍過程中所受到的溶質(zhì)損傷和機(jī)械損傷降到最低,大大地提高了細(xì)胞冷凍保存后的存活率.玻璃化凍存方法的優(yōu)點(diǎn)是.冷凍工藝簡單.不需要價(jià)格昂貴的降溫裝置,操作簡便,在一般的低溫生物學(xué)和低溫醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行.本文綜述近年來幾種動(dòng)物組織細(xì)胞的玻璃化凍存方法及其研究進(jìn)展.1幾種動(dòng)物組織細(xì)胞的玻璃化凍存方法1.1小鼠胰島jutte等用rail和fahy玻璃化凍存小鼠胚胎的方法玻璃化保存小鼠的胰島.發(fā)現(xiàn)使用

8、相同的保護(hù)劑采用不同的預(yù)平衡步驟得到的存活率并不一樣【31.方法如下:用含o.3%bsa的rpmi配制含22.5%(w/v)dmso,l1%(w/v)丙二醇.5%(w/v)聚乙二醇,17%(w/v)乙酰胺的玻璃化溶液(io0%vm).實(shí)驗(yàn)分兩組,第一組使用rall和fahy的方法,在室溫條件下,胰島25%vm(室溫,15min)5o%vm(o,10rain)100%vm(o,1omin)ln.第二組實(shí)驗(yàn)預(yù)平衡步驟在第一組實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上稍做改進(jìn),胰島25%vm(室溫,20min)5o%vm(o.10min)7o%vm(o,3min)8o%vm(o,3rain)9o%vm(o,3min)100%vm

9、(oc,10min)ln,.之后,兩組實(shí)驗(yàn)的操作方法和步驟都相同,復(fù)溫都以200,min的速率在室溫下進(jìn)行,復(fù)溫后按如下順序進(jìn)行洗脫:50%vm(o,10min)25%vm(室溫,lomin)l2.5%vm(室溫,lomin)6.25%vm培養(yǎng)液培養(yǎng).檢測(cè)兩組實(shí)驗(yàn)的胰島素分泌情況,發(fā)現(xiàn)第二組的胰島存活率比第一組要高得多.這就說明玻璃化低溫保存小鼠胰島時(shí)預(yù)平衡方法的選擇對(duì)其存活率有很大影響.六步預(yù)平衡法比三步預(yù)平衡法得到的胰島存活率高.mostafam.e1一naggar等對(duì)小鼠胰島玻璃化凍存的復(fù)溫方法進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)快速復(fù)溫效果較好,經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)快速復(fù)溫的胰島細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理功能上,都只是稍微弱

10、于其對(duì)照組41.1.2小鼠卵母細(xì)胞在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn).無論是用慢速冷凍法還是用快速冷凍法凍存成熟卵母細(xì)胞都能得到較高的存活率【5j.但快速冷凍卵母細(xì)胞或許是一種更理想的技術(shù).因?yàn)檫@樣可以避免細(xì)胞長時(shí)間暴露于低溫下而造成寒害61.已經(jīng)有很多人用玻璃化方法低溫保存了小鼠的卵母細(xì)胞,但報(bào)道的結(jié)果并不一致.oneil等用玻璃化方法凍存小鼠的成熟卵母細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn).在含6m的dmso和5%fbs的冷凍保護(hù)劑(vsd)中加入1mg/ml的peg配制成vsdp作為冷凍保護(hù)劑.其存活率大大提高.方法如下:成熟卵母細(xì)胞25%vsdp(室溫,3min)65%vsdp(室溫,少于1min)100%vsdp(室溫,少于1

11、min)一140c液氮蒸汽(3min)ln,保存復(fù)溫洗脫.表明玻璃化溶液中除了需要滲透性介質(zhì)外還需要加入適量的大分子化合物(如peg.bsa,ficoll等),從而促進(jìn)玻璃態(tài)的形成.1.3大鼠卵巢kagabu等用玻璃化方法凍存胎鼠的卵巢.并移植成功.但移植后的卵巢產(chǎn)生卵泡數(shù)量非常有限【8】.sugimoto等對(duì)出生后1o12d的幼鼠卵巢進(jìn)行玻璃化冷凍保存,用pbs配制含2o.5%(w/v)dmso,15.5%(w/v)乙酰胺,1o.o%(v/v)丙二醇,6.o%(w/v)peg的vs.預(yù)平衡和洗脫都采用分步法即卵巢12.5%vs(室溫,5min)25%vs(室溫,5min)5o%vs(o,15

12、min)100%vs(oc,15min)盛有100%vs的凍存管ln保存復(fù)溫將lmlo的50%vs加入凍存管繼續(xù)加50%vs至5ml,在o水浴中放10mirr_25%vs(oc,10min)12.5%vs(室溫,10min)pbs(室溫,10rain).并進(jìn)行自體移植,發(fā)現(xiàn)移植后的卵巢也能發(fā)育成具有內(nèi)分泌功能的性成熟的大鼠,與沒有低溫保存過直接進(jìn)行移植的大鼠卵巢一樣有卵泡成熟,但成熟卵泡的數(shù)量略少1.4牛胚泡vanderzwalmen等用三步預(yù)平衡法玻璃化凍存牛胚泡,存活率為57.1%【嘲.m.kuwayama等對(duì)體外受精的牛胚泡進(jìn)行玻璃化凍存,發(fā)現(xiàn)其它條件都相同但預(yù)平衡方法不同.培養(yǎng)24h后

13、得到的存活率分別為1步法o%,2步法10%.4步204科技通報(bào)第23卷法79%,8步法82%,16步法87%【1.ohboshi等用dpbs配制含40%(v/v)eg,6%(v/v)peg,0.5m蔗糖的vs保存牛胚胎,發(fā)現(xiàn)即使在vs中暴露1min或2min,胚胎的存活率都明顯下降【】21.說明vs對(duì)體外受精的牛胚胎有毒性,而且毒性的影響與vs成分的滲透性有關(guān).采用兩步法預(yù)平衡(胚胎一10%eg+dpbs,室溫,5minvs,0c,1min)比一步法預(yù)平衡(胚胎直接放入vs中,0c,1min)得到的存活率明顯升高(exb:80%vs60%,hb:80%vs26.7%).表明將胚胎逐步暴露于濃度

14、依次增加的保護(hù)劑可以減輕玻璃化過程中溶液的化學(xué)毒性和滲透性傷害.1.5牛卵母細(xì)胞牛卵母細(xì)胞對(duì)低溫非常敏感,尤其是體外成熟的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)形成的紡錘體.martino等研究表明.在投入液氮前長時(shí)間暴露在+15至一15的低溫環(huán)境下造成的卵母細(xì)胞的損傷是引起其低溫保存后低存活率的主要原因,通過超速降溫可以縮短其在該溫度范圍的時(shí)間,提高存活率131.t.otoi等用凍存管(straw)玻璃化凍存牛卵母細(xì)胞,通過一系列實(shí)驗(yàn)篩選出eg濃度,預(yù)平衡的步驟以及在蔗糖溶液中洗脫的時(shí)間,最后得到存活率為10%,.比martino等取得的存活率(15%)低.h.s.luna等用tcm199配制成含10%eg,1

15、0%dmso,20%fbs的vsi:含20%eg,20%dmso,20%fbs的vsi1,將不成熟的牛卵母細(xì)胞放在vsi中平衡30s后轉(zhuǎn)移到vsi1,然后放入液氮中保存.復(fù)溫后轉(zhuǎn)移至0.25m的蔗糖溶液,洗脫5min,再移至0.15m的蔗糖溶液洗脫5min,然后換成培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng).電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),先培養(yǎng)8h凍存后再培養(yǎng)16h的和不培養(yǎng)直接凍存然后培養(yǎng)24h的卵母細(xì)胞的雙倍體數(shù)明顯高于先培養(yǎng)12h或22h凍存后再培養(yǎng)12h或2h的卵母細(xì)胞.說明不培養(yǎng)或只培養(yǎng)8h的不成熟的牛卵母細(xì)胞玻璃化低溫凍存后存活率是很低的,這個(gè)階段的細(xì)胞不適合作低溫凍存.而培養(yǎng)12h或22h后再進(jìn)行低溫凍存的卵母細(xì)胞能避免

16、第一極體的殘留,提高其凍存后的存活率.包華瓊等的研究結(jié)果也說明牛體外培養(yǎng)22h成熟卵母細(xì)胞冷凍效果最好.a.dhiali等利用dpbs配制的含4.5meg,3.4mdmso,5.56mm半乳糖,0.33mm的sodiumpyruvate,0.4%(w/v)bsa的vs,第一次用玻璃化法低溫保存水牛(buffalo)卵母細(xì)胞獲得成功【.1.6豬胚胎實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),豬胚胎比其它哺乳動(dòng)物的胚胎更易受寒害的影響1,其中的細(xì)胞質(zhì)脂是造成豬胚對(duì)低溫敏感的主要因素.j.toshino等使用tcm199配制的四種玻璃化溶液,以一步預(yù)平衡法和四步預(yù)平衡法成功地保存了豬的胚泡,發(fā)現(xiàn)以四步法進(jìn)行預(yù)平衡的豬胚存活率比一

17、步法高,培養(yǎng)后的hb也是如此【l91.nagashima等使用微控制設(shè)備對(duì)冷凍前的早期胚胎進(jìn)行去細(xì)胞質(zhì)脂處理.發(fā)現(xiàn)去脂后的豬胚對(duì)低溫的耐受性增加.晚期豬胚由于大多的細(xì)胞質(zhì)脂都已經(jīng)通過代謝消耗掉.從而其對(duì)低溫的耐受性比早期豬胚強(qiáng),但凍存后的晚期豬胚移植到受體發(fā)育成小豬的成功幾率很低【2】1.s.kobayashi等對(duì)nagashima的方法稍作改進(jìn),即在pbs中加入8.0meg和7%(w/v)pvp制成vs,胚胎用vs凍存后,在25水浴復(fù)溫.然后依次經(jīng)過1.7m半乳糖,1.0meg,0.5meg的順序各洗脫2min,最后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液培養(yǎng)24h或48h,存活率為94.9%/24h,84.6%/48

18、h.1.7人卵母細(xì)胞w.seung等使用兩種不同的方法對(duì)玻璃化凍存后的人卵母細(xì)胞進(jìn)行解凍,發(fā)現(xiàn)采用相同的解凍步驟和洗脫液,不同的時(shí)間間隔,得到的存活率不同.說明玻璃化凍存后洗脫時(shí)間的長短對(duì)人的卵母細(xì)胞移植后能否發(fā)育成胚泡有著很大影響.hunter等用玻璃化方法凍存了人的卵母細(xì)胞,存活率為65%,受精率為45%,但沒有發(fā)現(xiàn)受精卵的分裂231.liebermann等在傳統(tǒng)的玻璃化液中加入大分子的聚合物,冷凍人卵母細(xì)胞,其凍融后復(fù)蘇率達(dá)到80.9%,較未加入聚合物的玻璃化液冷凍效果好.shee.uanchen等用dpbs配制含1.5meg+20%小牛血清的預(yù)處理液處理5min或10min后,轉(zhuǎn)移至用

19、dpbs配制的含5.5meg+20%小牛血清+1.0m蔗糖的vs預(yù)平衡6o90s,然后進(jìn)行玻璃化凍存,解凍后依次用1.0m,0.5m,0.25m,0.125m蔗糖溶液各洗脫2.5min,然后換成培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),其存活率為93%/96%,有受精卵的分裂,但看不到胚泡的形成閻.1.8人胚胎dmso和1,2.丙二醇是最早用于玻璃化凍存人胚胎的冷凍保護(hù)劑,近年來eg被廣泛地用第2期動(dòng)物組織細(xì)胞玻璃化凍存方法的研究進(jìn)展205作凍存人胚胎的玻璃化保護(hù)劑.并且取得了孕育的成功.imame1一danasoun等用eg作為保護(hù)劑,成功地凍存了人胚胎,而且8一細(xì)胞胚泡的存活率高達(dá)79.2%.2002年,ladis

20、lava等玻璃化凍存了受精后19h的人受精卵.方法如下:受精卵一4%eg+10%(v/v)人白蛋白,3min一2o%eg,lmin一38%eg+1.2m海藻糖.o.5min(以上都在39條件下進(jìn)行)一液氮一復(fù)溫,先在空氣中停留10s,然后轉(zhuǎn)移到35水浴中解凍lmin使其與含有10%(v/v)人白蛋白和lm海藻糖的hepes液混合一lm,o,5m,o.25m,0.125m海藻糖各洗脫5min(前兩步為室溫,后兩步為37)一培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后得到5或6細(xì)胞的胚胎一移植一29d后懷孕成功.說明以eg和海藻糖為保護(hù)劑凍存人的受精卵是比較安全的,對(duì)其分裂和進(jìn)一步的發(fā)育的影響較小.2討論玻璃化冷凍方法可

21、以用來保存各種生物的多種細(xì)胞,組織,甚至器官.盡管目前應(yīng)用不夠廣泛,但已經(jīng)引起了很多低溫工作者的濃厚興趣,并做了大量的工作,取得了許多研究成果.但實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)最后結(jié)果的影響都不容忽視,包括保護(hù)劑的組分和濃度,預(yù)平衡的步驟和時(shí)間,降溫的速率,復(fù)溫的速率,洗脫的步驟和時(shí)間,凍存材料的選擇等等.具體體現(xiàn)為:相同的保護(hù)劑采用不同的預(yù)平衡步驟得到的存活率并不一樣:胚胎對(duì)低溫保護(hù)劑和低溫保存的敏感性很大程度上還取決于其發(fā)育階段,所取材料本身品質(zhì)的優(yōu)劣也會(huì)影響凍存的結(jié)果:保護(hù)劑組成成分的不同對(duì)冷凍材料的毒性影響程度不同,相同的保護(hù)劑組成對(duì)不同的冷凍材料影響也不一樣;用不同的步驟預(yù)平衡相同的時(shí)間得

22、到的存活率不同,相同的步驟預(yù)平衡不同的時(shí)間得到的存活率也不同:降溫速度不夠快會(huì)導(dǎo)致冷凍材料在冷凍前就已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷,復(fù)溫速度太慢產(chǎn)生的去玻璃化現(xiàn)象對(duì)冷凍材料來說同樣是致命性的;相同的洗脫液采用不同的洗脫步驟和時(shí)間以及不同的洗脫液采用相同的時(shí)間和步驟同樣會(huì)得到不同的存活率.總的來說,玻璃化凍存方法的選擇應(yīng)注意:1)選擇的保護(hù)劑對(duì)冷凍材料的毒性要盡量低.2)預(yù)平衡一般以多步法為宜,溫度不宜太高.3)降溫和復(fù)溫的速率都要盡量快,時(shí)間要短.4)洗脫時(shí)一般是逐步稀釋.5)選擇的冷凍材料不能發(fā)育太成熟(如:早期的胚胎比晚期的容易凍存),但還沒發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞同樣是不易凍存成功.6)保護(hù)劑中加入適量的大分子

23、化合物可以促進(jìn)玻璃化的形成.參考文獻(xiàn):1railwf,fahygm.icefreecryopreservationofmouseembryosat一196byvitrificationj.nature.1985.313:573575.2馬學(xué)虎,一,一,等.細(xì)胞及玻璃化冷凍保護(hù)劑顯微實(shí)驗(yàn)研究j.大連理工大學(xué),2005,45(4):517521.3juttenhpm,heysejansenhg,bruininggi,zeil-makergh.vitrificationofmouseisletsoflangerhans:comparisonwithamoreconventionalfreezingm

24、ethodj.cryobiology,1987,24:292302.4mostafam.e1一naggar,faisalm.h.a1一mashat,ahmeda.elayat,abdulrahmanm.sibiany,m.sallehm.ar-dawi,mohamedh.badawoud.effectofthawingrateandpost-thawcultureonthecryopreservedfetalratislets:functionalandmorphologicalcorrelationj.lifesciences,2006,78:19251932.5bcmardfullerb工

25、cryopreservationofhumanooeytes:areviewofcurrentproblemsandperspectivesj.hum.reprod.uspate.1996.2:193207.6martinoa,songxasenn,lcibosp.developmentintoblastocystsofbovineoocytescryopreervedbyultrarapidcoolingj.bio1.reprod,1996,54:10591069.7oneill,payntersj,fullerbj,shawrw.vitrificationofmatureoocytes:i

26、mprovedresultsfollowingadditionofpolyethyleneglycoltoadimethylsulfoxidesolu-tionj.cryobiology,1997,34:195301.8kagabus,makitat,mambak,ishidat.transplantationofratovaryintoovariallbursaafterfreezingandthawingj.jmammovares,1998,5:8997.9sugimotom,maedas,manaben,miyamotoh.developmentofinfantileratovaries

27、autoransplantedaftercryopreservationbyverificationj.theriogenology2000,53:1o931103.10vanderzwalmenp,touatik,ectorsfj,massipa,ectorsf.vitrificationofbovineblastocystsj.theri-ogenology,1998,31:270(abstract).11kuwayamam,hamanonagaivitrificationofbovineblastocystsobtainedbyinvitrocultureofoocytesmatured

28、andfertilizedinvitroj.j.reprod.fert,1992,206科技通報(bào)第23卷i213141516171819】2o96:l87-l93.ohboshis,fujiharan,yoshidattomoganeh.usefulnessofprolyethyleneglycolforcryopreservationbyvitrificationofinvitroderivedbovineblastocystsj.animalreproductionscience,1997,48:27-36.martinoa,songsasenn,leibosp.developmentin

29、toblastocystsofbovineoocytescryoproservedbyuhrarapidcoolingj.bio1.reprod,1996,54:1059-1069.otoit,yamamotok,koyaman,tachikawas,uzukit.cryopreservationofmatureoocytesbyvitrificationinstrawsj.cryobiology,1998,37:77-85.lunahs,ferrarii,rumpfr.influenceofstageofmaturationofbovineoocytesattimeofvitrificati

30、onontheincidenceofdiploidmetaphaseiiatcompletionofmaturationj.animalreproductionscience,2001,68:23-28.包華瓊,一,一,等.3種因素對(duì)牛卵母細(xì)胞玻璃毛細(xì)管玻璃化冷凍效果的影響研究j.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25(6):9o一93,dhialia,manikrs,singlask,pahap.vitrificationofbuffalo(bubalusbubalis)oocytesj.theriogenology,200o.53:12951303.leibospmartinoa,kobayashi

31、s.pollardjw.stagedependentsensitivityofoocytesandembryostolowtemperaturej.animreprodsee,1996,42:43-53.toshinoj,kojimat,shimizum.tomizukat.cryobiologyofporcineblastocystsbyvitrificationj.cryobiology.1993.30:4l3432.nagashimah,kashiwakin,ashmanrj.,grupencg.,nottlemb.cryopreservationofporcineembryosj.na

32、ture,1995.374:416-420.21222324252627】nagashimah,yamakawah,niemannh.freezabilityofporcineblastocystsatdifferentperihatchingstages【jj.theriogenology,1992,37:839850.seungw,hongms,hyungm.improvedhumanoocytedevelopmentaftervitrification:acomparisonofthawingmethodsj.fertilityandsterility,1999,72(1):231237

33、.hunterje,fullerbj,bemanda,javksona,shawrw.vitrificationofhumanoocytesfollowingminimalexposuretocryoprotectants:initialstudiesonfertilizationandembryonicdevelopment【j.hum.reprod,1995,10:184189.liebermannj,tuckermj,sillses,eto1.cryoloopvitrificationinassistedreproduction:analysisofsurovivalratesin>1000humanoocytesafterultrarapidcoolingwithpolymeraugmentedcryoprotectants【j】.clinexpobstetgynecol,2003,30(2-3):125129.sheeuanchen,yinronlie,kua