實(shí)驗(yàn)三___線粒體活體染色

1、線粒體活體染色 n實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握線粒體活體染色的方法與原理掌握線粒體活體染色的方法與原理 n實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。 活活 體染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而體染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而 又很少影響細(xì)胞生命活動(dòng)的一種染色方法。詹納斯綠又很少影響細(xì)胞生命活動(dòng)的一種染色方法。詹納斯綠 B是線粒體的專一是線粒體的專一 性活體染色劑。呈堿性，具有脂溶性，能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并性活體染色劑。呈堿性，具有脂溶性，能夠穿

2、過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并 通過其結(jié)構(gòu)中帶有正電荷的染色基團(tuán)結(jié)合到帶負(fù)電荷的線粒體內(nèi)膜上。通過其結(jié)構(gòu)中帶有正電荷的染色基團(tuán)結(jié)合到帶負(fù)電荷的線粒體內(nèi)膜上。 線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì) 胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。 線粒體活體染色 活體染色：是使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色，活體染色：是使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色， 但對(duì)該樣本又沒有毒害作用的一種染色方法。但對(duì)該樣本又沒有毒害作用的一種染色方法。 目的：既顯示活體細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，又不影響細(xì)胞目的：既顯示活體

3、細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，又不影響細(xì)胞 的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理和化學(xué)變化以致細(xì)胞的死亡。的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理和化學(xué)變化以致細(xì)胞的死亡。 應(yīng)用：活體染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形應(yīng)用：活體染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形 態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生理、病理狀態(tài)態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生理、病理狀態(tài) 線粒體活體染色 1、人口腔粘膜上皮細(xì)胞活體染色顯示線粒體 （1）用消毒牙簽刮取口腔粘膜細(xì)胞，用力應(yīng)稍重些， 以便得到生活力教旺盛的細(xì)胞，將刮取物涂在載玻片 中央。 （2）滴1滴詹納斯綠B染液于細(xì)胞涂片處，23分鐘后 蓋上蓋玻片。 （3）用顯微鏡觀察，在高倍鏡下可見細(xì)胞質(zhì)中散在一 些被染成亮綠色的短棒狀和圓形顆粒，即為

4、線粒體。 線粒體活體染色 小鼠肝細(xì)胞中線粒體的顯示 實(shí)驗(yàn)四 染色體標(biāo)本制備 染色體標(biāo)本制備 n實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?初步掌握動(dòng)物骨髓（精巢細(xì)胞）染色體 標(biāo)本制備基本過程，了解操作步驟的原 理。 染色體標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)原理： 染色體是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細(xì)胞具有高度 的分裂能力，可直接觀察到細(xì)胞周期中的各個(gè)時(shí)相。但通 常情況下，中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素 處理后，分裂的骨髓細(xì)胞大多被阻斷在有絲分裂中期，經(jīng) 離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體 標(biāo)本，用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)儀器、用具實(shí)驗(yàn)儀器、用具 n天平 n離心機(jī) n溫箱 n顯微鏡 n酒精燈 n

5、注射器 n解剖盤 n解剖剪 n刀片 n離心管 n吸管 n燒杯 n冰凍載玻片 染色體標(biāo)本制備 骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備 1. 秋水仙素處理動(dòng)物：按4g/g體重的劑量經(jīng)腹腔注 射秋水仙素，34h后殺死動(dòng)物。 2. 取骨髓取出動(dòng)物后肢的股骨，剪去兩端骨骺。 用注射器吸取2ml 0.075M KCl溶液注入骨髓腔，將 骨髓細(xì)胞沖入離心管中，用吸管反復(fù)吸打骨髓細(xì)胞， 使細(xì)胞團(tuán)塊分散。 3. 加至5ml低滲液，吹打后將離心管置37水浴中低滲 20min。 精巢細(xì)胞染色體標(biāo)本制備 1. 秋水仙素處理動(dòng)物：按4g/g體重的劑量經(jīng)腹腔注 射秋水仙素，34h后殺死動(dòng)物。 2. 取雄性小鼠睪丸及附睪組織，將其放在平皿

6、中。加入 2ml 0.075M KCl低滲液，用剪子剪開睪丸及附睪組 織，使精細(xì)胞游離出來，吸取上清液轉(zhuǎn)移到離心管中。 3. 加至5ml低滲液，吹打后將離心管置37水浴中低滲 20min。 染色體標(biāo)本制備 4. 1000rmin離心8min。，棄上清液。 5. 固定：加入新配制的甲醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml， 立即用吸管將細(xì)胞輕輕吸打均勻，靜置固定20min。 （如此反復(fù)固定23次，每次20min。） 6. 滴片：固定的細(xì)胞經(jīng)離心后，吸去上層固定液，加入 少量新配制的固定液，將細(xì)胞團(tuán)塊輕輕吸打成懸液。 在干凈、冰冷的載玻片上滴23滴上層細(xì)胞懸液， 在酒精燈上文火烘干。 染色體標(biāo)本制備 7

7、. 染色：將玻片標(biāo)本放于染缸中，用1：10 Giemsa應(yīng) 用液染色10min。 8. 沖洗：在自來水管下細(xì)流水沖洗15s。 9. 觀察：用濾紙吸干玻片標(biāo)本，置于顯微鏡觀察。 染色體標(biāo)本觀察 1. 在顯微鏡下可觀察到染色體被Giemsa應(yīng)用液染為紫 紅色或桃紅色。小鼠染色體數(shù)目2n=40。 2. 在低倍鏡下可見較多的圓形的間期細(xì)胞核。尋找染 色體分散良好的中期分裂相，移至視野中央，然后 用油鏡觀察。在油鏡下，可見40條清晰的染色體， 每條染色體中，還可以見到著絲粒、染色體長(zhǎng)臂和 短臂等特征。 油鏡下小鼠骨髓細(xì)胞染色體 油鏡下觀察 染色體標(biāo)本觀察 線粒體活體染色 線粒體活體染色 A C C M

8、M N 線粒體電鏡觀察 線粒體電鏡觀察 C C M N MV L C B M M N N N MVMV L L 線粒體電鏡觀察 線粒體活體染色 染色體標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)原理： 染色體是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細(xì)胞具有高度 的分裂能力，可直接觀察到細(xì)胞周期中的各個(gè)時(shí)相。但通 常情況下，中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素 處理后，分裂的骨髓細(xì)胞大多被阻斷在有絲分裂中期，經(jīng) 離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體 標(biāo)本，用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實(shí)驗(yàn)。 染色體標(biāo)本制備 實(shí)驗(yàn)原理： 染色體是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體。骨髓細(xì)胞具有高度 的分裂能力，可直接觀察到細(xì)胞周期中的各個(gè)時(shí)相。但通 常情況下，中期染色體在鏡下的數(shù)量較少，如經(jīng)秋水仙素 處理后，分裂的骨髓細(xì)胞大多被阻斷在有絲分裂中期，經(jīng) 離心、低滲、固定、滴片等步驟，便可得到理想的染色體 標(biāo)本，用以觀察中期染色體形態(tài)和染色體組型分析等實(shí)驗(yàn)。 精巢細(xì)胞染色體標(biāo)本制備 1. 秋水仙素處理動(dòng)物：按4g/g體重的劑量經(jīng)腹腔注 射秋水仙素，34h后殺死動(dòng)物。 2. 取雄性小鼠