浙江大學生物化學丙實驗報告6

1、專業(yè)： 農業(yè)資源與環(huán)境 姓名： 李佳怡 學號： 3130100246 日期： 2015.6.9 地點： 生物實驗中心310 裝 訂 線實驗報告課程名稱： 生物化學實驗（丙） 指導老師： 方祥年 成績：_實驗名稱： 質粒DNA的微量制備及電泳檢測 同組學生姓名： 金宇尊、鮑其琛 一、實驗目的和要求（必填）二、實驗內容和原理（必填）三、實驗材料與試劑（必填） 四、實驗器材與儀器（必填）五、操作方法和實驗步驟（必填） 六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理七、實驗結果與分析（必填） 八、討論、心得一、實驗目的和要求1、學習并掌握質粒DNA的提取原理和方法；2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的原理和操作；3、學習并掌握對

2、電泳檢測結果的初步分析。二、實驗內容和原理1、實驗內容質粒DNA的提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定2、 實驗原理質粒：質粒是一種染色體（核質體）外的寄生性的自主復制子，存在于細菌等細胞中，為雙鏈閉環(huán)的DNA分子，大小在1-200kb之間，具有自主復制和轉錄功能, 能表達例如抗性、菌毒素等細胞非必需的遺傳信息，但其復制和轉錄必須要利用依賴宿主細胞（細菌）基因組DNA編碼的一些酶和蛋白質。質粒能夠自發(fā)的或人為的在細胞間轉移，因此是基因工程技術中將外源基因導入受體細胞的重要載體。從細菌細胞中抽提質粒DNA的步驟：a細菌培養(yǎng)使質粒大量擴增；b收集和裂解細胞,并去掉細菌碎片和核質體DNA ；c進一步除去蛋

3、白、脂類、RNA等雜質，分離和純化質粒DNA。堿裂解法來分離純化質粒DNA：在EDTA存在下，經過SDS處理使細胞膜裂解，從而使菌體充分裂解，利用在堿性條件下（NaOH），使核質體DNA與質粒DNA的變性；加入乙酸鉀，在中性條件下，核質體DNA與質粒DNA又存在復性的差異，質粒DNA很快得以復性，而細菌核質體DNA分子難以復性，核質體DNA會纏繞附著在細胞膜碎片上通過離心被沉淀下來，質粒DNA則留在上清液內；上清液中還含有可溶性蛋白質、核糖核蛋白和少量核質體DNA以及脂質類雜質等，可通過堿性酚-氯仿-異戊醇混合液的抽提去除；含有質粒DNA的上清液用無水乙醇或異戊醇沉淀，這是由于當加入無水乙醇時

4、，其會奪去核酸周圍的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍體積的乙醇或1倍體積的異丙醇沉淀DNA和RNA。獲得較純的質粒DNA。DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定: DNA分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在堿性溶液中（pH8.3緩沖液）帶負電荷，它在電場作用下向正極泳動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即具有不同的相對分子量的DNA片段泳動速度不同，并能區(qū)分出不同的區(qū)帶。DNA片斷在凝膠中當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色后，在紫外光下可見橙紅色帶，并可確定DNA片斷在凝膠中的位置。影響DNA泳動速率（遷移率）的因素有：DNA分子質量的影響：雙鏈

5、DNA分子遷移的速率與DNA分子量對數(shù)成反比。分子量越大，遷移率越小。 DNA構型的影響：超螺旋DNA線狀DNA開環(huán)DNA。膠濃度的影響： 濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度為12；電場強度的影響：電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，（一般5V/cm）（電場強度） 。而對于大片段電泳，甚至用0.51.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。EB的影響：溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。電泳緩沖液的影響:核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊

6、。TAE價格低廉，但緩沖能力低，必須進行兩極緩沖液的循環(huán)。TPE在進行DNA回收時，會使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應。所以多采用TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價離子，抑制DNase，保護DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。堿基組成與電泳溫度的影響: 一般影響不大。質粒DNA不同構型在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速度：環(huán)形雙鏈DNA分子有三種構型。 第一種是共價閉合環(huán)狀DNA，它的兩條鏈都保持完整的環(huán)狀結構，通常呈超螺旋構型，遷移速度最快； 第二種是開環(huán)DNA，它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結構，另一條單鏈上有一到幾個切口兩條核苷酸鏈中只有一條保持完整

7、的環(huán)形結構，即OC構型，遷移速度最慢； 第三種是線狀DNA，這種質粒的雙鏈斷裂呈線狀,通稱L構型。這三種構型的同一種質粒在瓊脂糖凝膠中電泳時，出現(xiàn)不同的遷移速率，走得最快的是超螺旋構型，其次是線性構型，最慢的是開環(huán)構型。實驗有關試劑的作用： 溶液：葡萄糖：增加溶液的黏度，減少抽提過程中的機械剪切作用，防止破壞質粒DNA。EDTA：絡合掉Mg等二價離子，防止DNA酶對質粒分子的降解作用。TrisHCl：使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍。溶液：SDS：解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性。NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液：中和溶液的堿性，使染色體DNA復性而發(fā)生纏繞，并使質粒DNA復性

8、。高鹽的3mol/L NaAc/KAc有利于變性的大分子核質體DNA以及K/Na離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質形成沉淀而除去。酚：一種強烈的蛋白質變性劑，能非常有效地去除蛋白質，同時抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有強烈的溶脂傾向，可以溶解細胞膜，同時溶解去除脂質類雜質，此外具有使蛋白質變性并分相的作用。異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。乙醇或異丙醇可以沉淀核酸，當加入乙醇時，其會奪去核酸周圍的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍體積的乙醇或1倍體積的異丙醇沉淀DNA和RNA。70的乙醇用于洗滌核酸沉淀，其目的是去除鹽及揮發(fā)性較小的異丙醇。RNaseA用于消化質粒DNA溶

9、液中的殘余RNA。3、 實驗材料與試劑 1、實驗材料 含重組質粒菌種 2、實驗試劑 LB液體培養(yǎng)基 氨芐青霉素：100mg/ml 溶液 溶液 溶液 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） 無水乙醇 70%乙醇 TE緩沖液（pH 8.0） RNaseA（1mg/ml） 0.5TBE緩沖液（pH8.0） 瓊脂糖 6加樣緩沖液 1mg/ml溴化乙錠（EB）4、 實驗器材與儀器1、恒溫培養(yǎng)箱 37； 2、恒溫搖床 37； 3、高壓滅菌鍋； 4、超凈工作臺； 5、臺式離心機； 6、振蕩器；7、微量移液槍(10，20，200，1000ul)； 8、槍頭（10，20，1000ul）及槍頭盒；9、離心管 1.5m

10、l及離心管架； 10、制冰機； 11、冰箱； 12、干式恒溫器 37、50 ； 13、微波爐； 14、電泳儀及；15、電泳槽； 16、紫外檢測儀。五、實驗操作方法和步驟1、收集細菌,堿裂解液提取質粒DNA，純化質粒DNA去除核DNA，粗提取質粒DNA離心：取1.2ml的過夜培養(yǎng)菌液加入1.5ml離心管中，8000r/min離心1min；棄上清液， 將管倒置于吸水紙上，使液體盡可能流盡。冰?。簩⒕w沉淀加100ul溶液，振蕩懸浮菌體，冰浴放置510min。再離心：加200ul溶液，蓋緊管蓋，快速溫和顛倒離心管數(shù)次，確保離心管內溶液混勻 使之變清，冰浴10min。加150ul溶液，蓋緊管口，顛倒數(shù)

11、次使之混勻，冰浴 放置5min。（說明：以上步驟目的）去除可溶性雜蛋白等雜質，純化質粒DNA離心：12000r/min離心10min，將上清液轉至另一干凈離心管，加入等體積的酚：氯仿： 異戊醇（25：24：1），振蕩混勻，12000r/min離心 10min 。冰?。荷锨逡阂迫肓硪桓蓛綦x心管中，加入2倍體積無水乙醇，混勻后置-20冰箱中20min。離心：12000r/min離心10min，棄上清液，將溶液管口倒置吸水紙上，使液體盡可能流盡。去除核RNA加樣：加入1ml 70乙醇洗沉淀一次（動作要輕），棄70乙醇溶液，將管口倒置于吸水 紙上，使液體盡可能流盡，自然干燥或50干燥。保存：將沉淀溶于

12、50ul TE緩沖液（pH8.0，含20mg/L RNaseA）中，置37恒溫器中保溫 30min后，取質粒DNA樣液做瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余純化的質粒DNA樣品置于 -20保存?zhèn)溆谩?、DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定加樣：取5ul純化的質粒DNA樣品，與1ul 6電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心 加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過 樣品槽容量。（注：a勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡；b上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣 品槽底部凝膠刺穿；c每加完一個樣品要換槍頭以防互相污染。）電泳：加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調到100V，恒壓電泳

13、。當溴酚藍 條帶移動到距凝膠前緣約2cm時，停止電泳（約需3060min）。觀察和拍照：取出膠塊置于紫外燈下觀察，DNA存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶， 再用成像儀進行拍照，以便于分析。注：紫外光對眼睛有害，觀察時戴上防護鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機玻璃觀察。6、 實驗數(shù)據(jù)記錄和處理1、樣品離心后：上層淡黃色，下層有乳黃色沉淀；2、加入溶液后：沉淀溶解，溶液呈淡黃色；3、加入溶液后：溶液無色澄清；4、冰浴后：部分凝固，呈現(xiàn)無色；5、加入溶液后：有白色絮狀沉淀出現(xiàn)；6、離心后：溶液分層，沉淀白色，有部分粉末懸?。?、加 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）后：分層，下層顏色土黃色，上層淡黃色；

14、8、離心后：分層，上層無色透明，下層淡黃色，中層雜蛋白油狀。七、實驗結果與分析電泳圖譜：1、 實驗結果：第一條帶對應的DNA為超螺旋構型DNA，條帶最亮，表明此結構的DNA含量最高，同時其遷移距離最遠，在同樣時間內，超螺旋構型DNA遷移速度最快，結果正常。第二條帶對應的DNA為線狀DNA，在三條帶中顏色最淺，含量最少。第三條帶對應的DNA，為開環(huán)DNA，遷移速度最慢，含量較線狀DNA微多一些。點樣孔處有較多DNA殘留，表明加樣時有較多溢出，操作不夠規(guī)范，仍需改進。在第一條帶之前無其它可辨的條帶，可推測無RNA殘留。2、 結果分析：根據(jù)實驗結果得出如下分析：在加樣時，未控制好位置和高度，導致殘留

15、在點樣孔中的樣品較多，因此也影響了各個條帶中的樣品量，若在加樣時操作規(guī)范，則可增大條帶中DNA的量。各個條帶之間距離較大，表明超螺旋構型DNA、線狀DNA、開環(huán)DNA三種不同類型的DNA之間分離較好，且超螺旋型DNA亮度最亮，表明其含量最多。但仍存在較多開環(huán)和線狀DNA含量也較多，表明提取到的DNA雜質較多，原因可能為沒有在洗滌沉淀時進行充分洗滌，只是稍微放置一會后就將乙醇倒掉了，應多放置一段時間，并微微搖動，以除去雜質。由于在第一條帶之上不再有其它可辨的條帶，可推測無RNA殘留。說明DNA純度高，提取過程對RNA的去除完全。八、討論、心得思考題：1、在提取質粒DNA的過程中， EDTA、 S

16、DS、 NaOH、乙酸鉀、酚-氯仿-異戊醇等試劑的作用是什么？ EDTA：絡合掉Mg等二價離子，防止DNA酶對質粒分子的降解作用。 SDS：解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性。 NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性。 乙酸鉀：質粒DNA復性。 酚-氯仿-異戊醇：酚：一種強烈的蛋白質變性劑，能非常有效地去除蛋白質，同時抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有強烈的溶脂傾向，可以溶解細胞膜，同時溶解去除脂質類雜質，此外具有使蛋白質變性并分相的作用。異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡（泡沫）。 其余試劑見實驗原理部分。2、在質粒DNA的提取過程中，應注意哪些操作，為什么？（1）各步驟中的混勻過程要

17、溫和，因為質粒DNA是環(huán)狀生物大分子，若是過于劇烈，極易收集到破碎、斷裂的片段而不是完整的超螺旋DNA；（2）各步驟中的試劑的量要適當，過量和不足都會影響實驗結果。（3） 提取過程中應盡量保持較低溫度。 （4） 加入溶液II和溶液III后操作應混和,切忌劇烈振蕩。3、瓊脂糖凝膠電泳操作應注意哪些環(huán)節(jié)？ （1）倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60C，否則溫度太高會使制膠板變形。（2）膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄壞點樣孔。（3）配膠和灌電泳槽需使用同一緩沖液。pH或離子強度很小的差別也會在凝膠前部造成紊亂，影響DNA片段的泳動。（4）加樣時需將槍頭深入加樣孔內再吹出樣品，以免

18、樣品從凝膠表面擴散；加樣時槍頭不要刺穿或碰壞凝膠孔壁，否則將導致樣品將從凝膠底部擴散或DNA帶型不整齊。此外點樣孔內不能有氣泡。（5）樣品應加在陰極端，沒加完一個樣品要更換槍頭，防止相互污染。（6）觀察時在透射儀的樣品臺上鋪一張保鮮膜，趕去氣泡。（7）要選擇合適的電壓、pH等條件。討論心得：1、 質粒在正常情況下以超螺旋構型存在，在提取過程中由于機械力、酸堿度、試劑等的原因，可能會使DNA鏈發(fā)生斷裂。2、 DNA泳動速率受到多方面因素的影響。3、 溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。4、 用無水乙醇沉淀DNA：乙醇可以任意比和水相溶，乙醇與核酸不會起化學反應，不會破壞DNA。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪取DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。本次實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混，其含量約為67%，因此可以考慮用95%乙醇，但是DNA回收率可能會下降。5、 提取過程中應盡量保持較低溫度。 6、 加入溶液II和溶液III后操作應混和,切忌劇烈振蕩。7、 要盡可能充分利用提取物，可增加產率；但是在不同情況和實驗要求下應在產率和質