質(zhì)量研究總結(jié)

1、4復(fù)方雙氫青蒿素片質(zhì)量研究總結(jié)張美義、肖文中、林燕芳、詹利之雙氫青蒿素、磷酸哌喹采用分光光度法；甲氧芐啶回收試驗(yàn)、線性試驗(yàn)及樣品的測定證明了該方法的摘要 復(fù)方雙氫青蒿素片由雙氫青蒿素、磷酸哌喹、甲氧芐啶三種主 要成分組成。是治療瘧疾的西藥三類新藥。我們通過對(duì)其性狀、鑒別、檢 查、含量測定等各方面的研究，建立了復(fù)方雙氫青蒿素片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以 TCL、磷酸鹽反應(yīng)、香草醛硫酸顯色等進(jìn)行鑒別。溶出度主要研究了磷酸 哌喹、甲氧芐啶的溶出度，以漿法 0.1NHCl 900ml 為溶劑，轉(zhuǎn)速 75r/min， 30分鐘取樣，為溶出度檢查條件，溶出量不低于 70%。以 TCL 法進(jìn)行有 關(guān)物質(zhì)檢查，并對(duì)檢出限

2、、點(diǎn)樣量等進(jìn)行了研究。三種成分的含量測定分 別采用了不同的方法， 采用高效液相色譜法。 可靠性及穩(wěn)定性。關(guān)鍵詞 ：鑒別 檢查含量測定一、 性狀復(fù)方雙氫青蒿素片( ARTECOM )為淺綠色薄膜衣片，除 去包衣后片芯顯類白色至淡黃色。本品中除磷酸哌喹為類白色 至淡黃色，其余原輔料均為白色，但本品中磷酸哌喹含量大， 所以未包衣的片是類白至淡黃色。二、鑒別1. 磷酸鹽的鑒別反應(yīng)。取本品細(xì)粉約 0.2g，加水10ml，超 聲振蕩10分鐘后濾過。取濾液5ml，加氨試液2ml，搖勻，濾 過，濾液加硝酸2ml，搖勻，放置10分鐘后加鉬酸銨試液3ml， 產(chǎn)生黃色沉淀，此沉淀能在氨試液中溶解。本品中甲氧芐啶、雙

3、氫青蒿素以及片劑輔料在同樣實(shí)驗(yàn)條件下不產(chǎn)生顏色和沉 淀，不干擾該反應(yīng)。2. 雙氫青蒿素的鑒別反應(yīng)。取本品的細(xì)粉約 0.2g,加氯仿 10ml，攪拌使溶解，濾過，濾液蒸干，殘留物加 2%香草醛硫 酸溶液 1 滴，即顯紅色， 放置后漸變棕紅色。 本品中磷酸哌喹、 甲氧芐啶以及片劑輔料在同樣實(shí)驗(yàn)條件下不顯色，不干擾該反應(yīng)。3. 薄層色譜法鑒別：（1）展開劑選擇：用硅膠 GF254薄層板，以醋酸乙酯的堿 性系統(tǒng)和酸性系統(tǒng)， 氯仿的堿性系統(tǒng)和酸性系統(tǒng)篩選分離條件， 結(jié)果，酸性系統(tǒng)除雙氫青蒿素外其它各組份未能展開。根據(jù)調(diào) 整二乙胺的量達(dá)到相互分離的目的，選用氯仿甲苯二乙胺（ 5:4:2）為展開劑展開，雙氫

4、青蒿素、甲氧芐啶、磷酸哌喹分 離效果較好。曾試驗(yàn)過的展開劑有：1、2、3、4、5、6、7、8、9、醋酸乙酯甲酸水（ 10:2:1） 甲苯醋酸乙酯冰醋酸（ 5:4:1 ） 氯仿甲苯二乙胺（ 5:4:2 ） 甲苯二乙胺（ 8:2） 甲苯二乙胺（ 8.5:1.5）甲苯氯仿二乙胺（ 5:4:1 、5:4:2 ） 環(huán)乙烷丙醇二乙胺（ 8:1:1） 醋酸乙酯二乙胺（ 9.2:0.8、9:1.5） 氯仿二乙胺（ 10:1、10:0.6）主斑點(diǎn)分開了但不圓拖尾10、氯仿甲醇濃氨（ 9.5:7.5:1）拖尾11、甲苯二氧六環(huán)氯仿二乙胺（ 8:1:1:0.5）12、甲苯二氧六環(huán)氯仿二乙胺（ 5:1.5:3:0.5

5、）13、甲苯二氧六環(huán)氯仿二乙胺水（ 8:1:1:0.5:0.2）14、15、16、17、5:5:0.5） 拖尾 分不開甲苯醋酸乙酯二乙胺（甲醇冰醋酸（ 10:0.2）甲醇二乙胺（ 10:0.15）TMP 在原點(diǎn)，另二者雖可分開，但接近。甲苯18、苯三者可分離，但 TMP 與雙氫青蒿素相連。19、氯仿TMP Rf 約 0.6，但另二者至前沿。20、醋酸乙酯二乙胺 （9.2:0.8） 可以分開21、氯仿甲苯二乙胺（ 5:4:1）22、氯仿甲苯二乙胺（ 5:4:2） 層析薄層板均需預(yù)飽和半小時(shí)，展開效果才好。（2）檢出方法：斑點(diǎn)檢視，比較了熏氨后立即置熒光燈（254nm）下觀察和噴以香草醛一硫酸試液

6、，后者為雙氫青蒿 素的顯色反應(yīng)（桃紅色），但需先觀察鑒別其它組份后才反應(yīng) 顯色。前者則各組份均可觀察，選用前者檢視。磷酸哌喹和甲 氧芐啶在紫外光燈下（254nm）檢視是很靈敏的，而雙氫青蒿 素在紫外光燈下（254nm）檢視就不很靈敏。采用氨蒸汽熏約 20分鐘后，立即置紫外燈（254nm）下檢視，三種成份均能檢 出。（3）溶劑選擇：本品中三種成份對(duì)提取溶劑的溶解度不同。雙氫青蒿素、甲氧芐啶經(jīng)超聲能溶于 80%乙醇。磷酸哌喹難溶 于80%乙醇，操作中是取其80%乙醇飽和的澄清溶液點(diǎn)樣。因 此制備三種成份的對(duì)照品溶液時(shí)按制備供試品溶液的條件，雙 氫青蒿素16mg,甲氧芐啶45mg,磷酸哌喹160mg

7、各加80%乙 醇10ml，經(jīng)超聲助溶20分鐘，取濾液點(diǎn)樣。三、檢查1、溶出度 本品的溶出度研究中以測定磷酸哌喹和甲氧芐 啶兩種，因雙氫青蒿素在水、稀酸中均不溶，亦未查到其溶出度有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，因而暫時(shí)不能測定。通過對(duì)不同溶出介質(zhì), 不同取樣時(shí)間的比較，以及六批樣品及三個(gè)不同批號(hào)樣品的 溶出度檢查，確定了溶出度的檢查方法。（1）操作方法確定：采用溶出度第二法，以900ml溶劑為 介質(zhì)，本品在用漿法操作時(shí)，片子沉在杯底，不漂浮，而且片 子在介質(zhì)中崩散快，操作也方便，所以采用該法。（2）不同溶出介質(zhì)（0.1mol/L鹽酸溶液和水）的比較，結(jié) 果如下：批號(hào) 981021采用溶出度第二法溶出時(shí)間45分鐘溶

8、出量（標(biāo)示量）成份50 轉(zhuǎn) /min75 轉(zhuǎn) /min0.1mol/L HCI 水0.1mol/L HCI水96 9999 10092 9089 9093 92磷酸哌喹甲氧芐啶99 9997 95959595 9294941009999 10093 94949696 95919293 889091從以上結(jié)果看，本品以水為介質(zhì)甲氧芐啶與磷酸哌喹45分鐘溶出量均比以0.1mol/L HCI溶液為介質(zhì)低，而且溶出量 不均勻，提高轉(zhuǎn)速也改變不大。以 0.1moI/L HCI為介質(zhì)，75 轉(zhuǎn)/min較50轉(zhuǎn)/min溶出量高。經(jīng)實(shí)驗(yàn)甲氧芐啶、磷酸哌喹在 水溶液中較穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)有分解降低的現(xiàn)象，主要還是溶解

9、度 問題。故選用0.1 moI/L HCI溶液為介質(zhì)。（3）不同轉(zhuǎn)速（50轉(zhuǎn)/min及75轉(zhuǎn)/min ）的比較：溶出時(shí) 間統(tǒng)一采用45分鐘，但為了考察溶出情況，在 0.1moI/L鹽酸 溶液為介質(zhì)，每分鐘75轉(zhuǎn)條件下，比較了 15、30、45分鐘不同 時(shí)間的溶出量。結(jié)果見下表：片號(hào)15min溶出量（%）30min溶出量（%）45min溶出量（%）磷酸哌喹甲氧芐啶磷酸哌喹甲氧芐啶磷酸哌喹甲氧芐啶11009610198101952100971009598943100959995100964101929596100955999610096999669794989410093平均溶99.5095.00

10、98.8395.6799.6794.836出度XSD1.381.792.131.371.031.16CV%1.391.882.161.431.041.23從上表結(jié)果看，本品在15分鐘時(shí)已溶出90%以上，與30 分鐘、45分鐘差別不大。但考慮本品為試制樣品，還未經(jīng)過放 大生產(chǎn)的實(shí)踐，所以訂為漿法 75轉(zhuǎn)/min，30分鐘時(shí)溶出限度 為 70%。（3）以上述條件進(jìn)行了 6批復(fù)方雙氫青蒿素片的溶出度檢 查，結(jié)果如下：復(fù)方雙氫青蒿素片六批溶出度測試數(shù)據(jù)成份磷酸哌喹甲氧芐啶溶出量101 98100959595第1批（標(biāo)示量%）99 1009596 9694X SD98.83 2.1495.17 0.75

11、CV%2.160.79溶出量99 9999919494第2批（標(biāo)示量%）96979794 9693X SD97.83 1.3393.67 1.63CV%1.361.74溶出量1019810293 9592第3批（標(biāo)示量%）979910094 9590X SD99.5 1.8793.17 1.94CV%1.882.08溶出量99 9899979694第4批（標(biāo)示量%）101989893 9694X SD98.83 1.1695.0 1.55CV%1.181.63溶出量101 100 10096 9597第5批（標(biāo)示量%）100999796 9492X SD99.5 1.3895.0 1.78CV

12、%1.391.88溶出量101100 100959496第6批（標(biāo)示量%）100989995 9396X SD99.67 1.0394.83 1.17CV%1.041.23上述結(jié)果表明，6片中每片的溶出量，按標(biāo)示量計(jì)算，均 不低于規(guī)定限度（70%）。6片在不同時(shí)間溶出量的（X 士 SD） 較小，CV%均在5%之內(nèi)，因而該法有較良好的均一性。（4）樣品測定三批不同批號(hào)的樣品按以上條件測定結(jié)果見下表。漿法0.1mol/L HCI 900ml 為介質(zhì)75 轉(zhuǎn) /min成份勺木山/ 士： ： j%)浴出量（標(biāo)小量98102098102198102299 99101 98101 98磷酸哌喹999710

13、0971009996 97102 99100 95969394909695甲氧芐啶94919392989694 9495 9594 95（5）測試結(jié)果可信性分析a. 磷酸哌喹 6批 36個(gè)溶出度數(shù)據(jù)，最高溶出度值為 102%， 最低為 95%，最大差異為 7%。6 個(gè)均值及其標(biāo)準(zhǔn)差（ XSD） 最高值 99.671.03，最低 97.831.16，均值差異僅 1.84%， CV5%。b. 甲氧芐啶 6批 36個(gè)溶出度數(shù)據(jù)，溶出度最高值為 97%， 最低為 90%，最大差異為 7%，6批均值及其標(biāo)準(zhǔn)差 （XSD）， 最高值 95.170.75，最低值 93.171.94，相差 2%，CV5% 。

14、由上述試驗(yàn)及 3 批樣品測試結(jié)果，我們認(rèn)為采用的溶出度 的試驗(yàn)方法、溶劑、時(shí)間和限度，比較合理，溶出度均一性好， 測得值可信性高，可以作為該產(chǎn)品的溶出度測試方法。（6）溶出度檢查方法總結(jié)： 取本品，照溶出度測定法（中國藥典 1995 年版二部附錄 XC 第二法），以 0.1mol/L 鹽酸溶液 900ml 為溶劑，轉(zhuǎn)速為每 分鐘75轉(zhuǎn)，依法操作，經(jīng)30min，取溶液20ml，濾過。精密 量取續(xù)濾液2ml,置50ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度， 搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取經(jīng) 80C真空干燥至恒重的 磷酸哌喹對(duì)照品適量,用 0.1mol/L 鹽酸溶液溶解并制成每 1ml 約含1

15、4 gg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液照分光光度法（中國藥 典 1995 年版二部附錄 IVA ）在 345nm 的波長處,分別測定吸 收度,計(jì)算出每片中磷酸哌喹的溶出量。另精密量取上述續(xù)濾液5ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L 鹽酸溶液至刻度,搖勻,作為供試品溶液。另分別精密稱取經(jīng) 105 C干燥至恒重的甲氧芐啶對(duì)照品與經(jīng)80 C真空干燥至恒重量,的磷酸哌喹對(duì)照品適量, 用 0.1mol/L 鹽酸溶液溶解并分別制成 每1ml約含甲氧芐啶20 g，磷酸哌喹71的溶液，作為對(duì)照 品溶液，對(duì)照品溶液。照分光光度法（中國藥典1995年 版二部附錄IVA ）取對(duì)照品溶液，以271 nm為測定波長

16、（喝, 在366nm波長附近（每間隔0.2nm）選擇等吸收點(diǎn)波長為參比 波長（入1）,要求 A=A入2-A入1=0。再在入2與入1波長處分別測 定供試品溶液與對(duì)照品溶液的吸收度，求出各自的吸收度差 值（M）,計(jì)算出每片中甲氧芐啶的溶出量。限度均為標(biāo)示量 的 70%，應(yīng)符合規(guī)定。2、有關(guān)物質(zhì)檢查 （供穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)用）方法篩選a. 甲氧芐啶有關(guān)物質(zhì)的檢查方法按 中國藥典 95 年版, 以氯仿甲醇（ 9:1）為溶劑,分別制成含甲氧芐啶 20mg/ml, 40/ml,磷酸哌喹飽和液的對(duì)照品溶液。 取本品細(xì)粉適量（約 相當(dāng)于甲氧芐啶100mg），加上述溶劑5ml制成樣品溶液，分 別點(diǎn)樣于層析硅膠GF254

17、 板上,以氯仿甲醇濃氨溶液（95:7.5:1）為展開劑,顯色劑為鐵氰化鉀三氯化鐵溶液（取 5%鐵氰化鉀溶液與 10%三氯化鐵溶液各 10ml ,臨用前混合, 搖勻）于 1min 內(nèi)顯藍(lán)色, 但磷酸哌喹與甲氧芐啶主斑點(diǎn)不能分 離。通過更改展開劑比例也沒有取得較好的分離效果。b. 為了正確反應(yīng)有關(guān)分（降）解產(chǎn)物,在篩選鑒別反應(yīng) 展開劑系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,采用甲苯氯仿二乙胺（ 4:5:2）為展 開劑，紫外254nm燈下檢視，能清楚地顯示出甲氧芐啶及磷酸 哌喹的斑點(diǎn)。c. 雙氫青蒿素有關(guān)物質(zhì)檢查在采用部頒標(biāo)準(zhǔn)中收載的展 開劑系統(tǒng)的基礎(chǔ)上， 用 0.5%香草醛硫酸顯色， 再加熱使雜質(zhì)斑 點(diǎn)顯色的方法，取得較好

18、的效果。d. 對(duì)三種成份有關(guān)物質(zhì)檢查的點(diǎn)樣量進(jìn)行了考察，雜質(zhì) 斑點(diǎn)均隨點(diǎn)樣量增多而明顯增大，而主斑點(diǎn)附近未發(fā)現(xiàn)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)，所以磷酸哌喹、甲氧芐啶選用溶解度大的80%醋酸為溶劑，雙氫青蒿素以氯仿為溶劑。檢出限復(fù)方雙氫青蒿素片中三種成份最小檢出量的考察方法與結(jié)果:液,50、a. 精取50mg雙氫青蒿素，加5ml氯仿使成10mg/ml溶 再依次稀釋成系列濃度的樣品溶液（卩g/ml）： 1000、100、20、10、5、1。各點(diǎn)樣10訕于層析硅膠G板上，按有關(guān) 物質(zhì)檢查方法展開，顯色。16mg/ml溶液，再依次稀釋成系列濃度的樣品溶液（卩 1600、160、32、16、8、1.6。各點(diǎn)樣5山于層析硅

19、膠 上，按有關(guān)物質(zhì)檢查方法展開，254nm紫外燈下檢查。b. 精取磷酸哌喹80mg,加80%醋酸5ml超聲溶解，使成 g/ml）: GF254 板10mg/mlc.精取甲氧芐啶100mg,加冰醋酸10ml使成 溶液，再依次稀釋成系列濃度的樣品溶液（ag/ml） ： 1000、100、 50、20、10、5、1。各點(diǎn)樣5 a于層析硅膠GF254板上，按有關(guān) 物質(zhì)檢查方法展開，254nm紫外燈下檢視。d.結(jié)果品名點(diǎn)樣量（a）最低檢出濃度（a g/ml）檢出限（ag雙氫青咼素10.010.00.1磷酸哌喹5.016.00.08甲氧芐啶5.020.00.1四、含量測定 本品中三種成份分別作含量測定。1

20、、雙氫青蒿素 本品中三種成份，雙氫青蒿素量最少,穩(wěn)定性亦較另二種成份差，同時(shí)也不溶于水。研究采用堿性溶 液紫外吸收的分光光度法。雙氫青蒿素的無水乙醇溶液靜置2小時(shí)以上是為了使雙氫青蒿素的異構(gòu)體達(dá)到平衡。在堿性溶液 加溫，使雙氫青蒿素開環(huán)，在238nm波長附近處有一個(gè)不受干 擾的最大吸收（見附圖1、2），進(jìn)行測定。該法首先須將片劑 中的雙氫青蒿素提取出來，并除去其他成分，再加堿進(jìn)行反應(yīng)， 測定反應(yīng)液的吸收度。（1）提取方法的選擇：比較了以下幾種方法：a. 樣品直接以乙醚過硅膠柱提取，b. 樣品以無水乙醇提取后，60-70 C水浴揮干無水乙醇，再 以乙醚轉(zhuǎn)移過硅膠柱提取，C.樣品以無水乙醇提取后，

21、冷風(fēng)水?。?0-70 C ）吹干無水 乙醇，再以無水乙醇轉(zhuǎn)移過硅膠柱提取d.樣品以氯仿提取后，60-70 C水浴揮干無水乙醇，再以 乙醚轉(zhuǎn)移過硅膠柱提取測定結(jié)果如下：樣品：980120批方法abCd結(jié)果93.8 91.790.699.5 100.086.6（標(biāo)示量%）93.3100.4試驗(yàn)表明不經(jīng)無水乙醇與樣品研磨振蕩這一步操作，含量偏低5%以上（91.7%, 93.3%, 93.8%）。曾試用氯仿提取，效果不好。在揮去無水乙醇溶劑時(shí)水浴溫度要控制在 70C以下, 并采用風(fēng)扇加速溶劑的揮散，雙氫青蒿素對(duì)熱不穩(wěn)定，溫度過 高測定結(jié)果偏低。揮去無水乙醇后的殘留物用乙醚溶解并通過 硅膠層析柱，使分離

22、除去溶在無水乙醇中的其他成份。硅膠對(duì)測定的影響：以不同來源的硅膠各取5g，置20ml玻璃注射器中，各加 同一批號(hào)乙醚50 ml洗脫，收集洗脫液揮干乙醚。殘留物用無 水乙醇轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中并稀釋至刻度。放置 2小時(shí)以上。 加2%NaOH 20 ml于59 1 C反應(yīng)30分鐘，以50 ml乙醚不過 柱直接揮干后同法操作為空白。結(jié)果如下：吸收度硅膠來源青島產(chǎn)160-200目層析硅膠（9606021批）青島產(chǎn)160-200目層析硅膠（9607051批）上海產(chǎn)100-200目層析硅膠（940406批）0.0009-0.00030.000522結(jié)果表明硅膠基本無吸收（3）乙醚對(duì)測定的影響：以不同來

23、源的乙醚各取100 ml,置小燒杯中，揮干乙醚。殘留物用無水乙醇轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中并稀釋至刻度。放置 2 小時(shí)以上。力口 2%NaOH 20 ml于59 1C反應(yīng)30分鐘，以無水 乙醇同法加熱為空白。結(jié)果如下：吸收度0.00050.0006乙醚來源麻醉用乙醚（廣州中醫(yī)藥大學(xué)）分析純（廣州化學(xué)試劑廠）分析純（天津化學(xué)試劑一廠）分析純（上?；瘜W(xué)試劑一廠）化學(xué)純（廣州化學(xué)試劑二廠）0.00020.0009-0.0219結(jié)果表明乙醚質(zhì)量的好壞對(duì)含量測定由較大的影響，應(yīng)選 用分析純以上的規(guī)格，在含量測定中對(duì)照品也應(yīng)同法操作，以 消除影響。（4）乙醚用量的確定：取雙氫青蒿素對(duì)照品100mg與相應(yīng)量的

24、其他成分置100 ml 量瓶中，加無水乙醇約75 ml，超聲20分鐘，放冷，稀釋至刻 度，搖勻，濾過。取續(xù)濾液10 ml至小燒杯中，60C水浴冷風(fēng) 吹干無水乙醇，分取50 ml與100 ml乙醚將殘留物轉(zhuǎn)移過硅膠 柱，收集洗脫液，揮干，將殘留物用無水乙醇轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，并用無水乙醇稀釋至刻度，放置2小時(shí)以上。加2%NaOH 20 ml于59士 1C反應(yīng)30分鐘，以無水乙醇同法加熱為空白。 結(jié)果如下：含量（標(biāo)示量%）乙醚用量50 ml99.9100ml100.3結(jié)果表明乙醚用量50 ml與100 ml無差異，因而乙醚用量 以50-60 ml為好，用量太少不好轉(zhuǎn)移、洗滌，用量太大操作時(shí)

25、間太長。（5）硅膠柱大小確定：取不同直徑的硅膠柱均裝3克硅膠進(jìn)行操作，結(jié)果如下：硅膠柱直徑D加入量回收率（mm）（mg）%2599.6100.2100.3 99.620100.1100.3100.3 100.5結(jié)果表明硅膠柱直徑對(duì)含量測定沒有多大影響，但柱直徑 小，硅膠層厚，乙醚流速慢，操作時(shí)間長，不宜使用。故硅膠 柱直徑以選用25 mm為宜。（6）硅膠用量確定：分取3g與5g硅膠柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：硅膠用量（g）回收率（）100.299.299.8100.4結(jié)果表明硅膠用量3g與5g差別不大，3g的硅膠柱流速較 快，操作時(shí)間短，故選3g硅膠為宜。（7）雙氫青蒿素線性試驗(yàn)雙氫青蒿素的線性測試

26、方法：精密稱取雙氫青蒿素10mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇 適量，振搖使溶解，并加無水乙醇至刻度，搖勻（每 1ml含雙 氫青蒿素100，精密量取此溶液1, 2, 3, 4, 5ml，分別置 50ml比色管中，分別加入無水乙醇 4、3、2、1、0ml，搖勻， 使每管中均含5ml溶液，在每管中加入2%氫氧化鈉溶液20ml, 搖勻，置59 1C的水浴中加熱30分鐘，取出，立即冷卻至室 溫，在234-239nm波長范圍測定，應(yīng)在237nm波長附近處有最 大吸收。雙氫青蒿素在堿性溶液的紫外分光光度法，測定濃度在4-20血/ml時(shí)，測得吸收度A, C-A線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) r=0.999996，

27、見附一元線性回歸圖(圖 3)。C (pg/ml)A4.00.13778.00.277912.00.416016.00.554220.00.6926(8) 雙氫青蒿素的回收試驗(yàn)取雙氫青蒿素對(duì)照品約100mg，精密稱定，置100ml量瓶 中，加入按處方比例的其他成份及輔料，加無水乙醇超聲振蕩 使雙氫青蒿素溶解完全， 放至室溫， 加無水乙醇至刻度， 濾過。 取續(xù)濾液10ml (相當(dāng)于雙氫青蒿素10mg)置小燒杯中，在60C 水浴上冷風(fēng)吹干，再用乙醚將殘留物洗脫轉(zhuǎn)移至層析硅膠柱， 收集洗脫乙醚液，揮干。用無水乙醇將殘留物轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，并加至刻度。精取5ml加2% NaOH溶液20ml，依法操

28、 作，測定吸收值。另精取對(duì)照品雙氫青蒿素100mg不加其他成份與輔料，依法操作。計(jì)算回收率，分別為 100.2%， 100.2%， 100.7%， 99.5%， 99.9%。在回收試驗(yàn)時(shí)，不經(jīng)第一步無水乙醇 超聲提取，精取 10mg 雙氫青蒿素對(duì)照品與其他成份及輔料， 置層析硅膠柱中，直接用乙醚洗脫，也可得到如上相似的回收 率，但在測定樣品時(shí)卻不同，分析其原因，制片時(shí)原輔料混合 均勻，加粘合劑制粒，與回收試驗(yàn)情況不完全相同，故必須要 充分超聲振蕩使雙氫青蒿素溶出。(9) 雙氫青蒿素測定溶液的穩(wěn)定性考察 雙氫青蒿素測定溶液穩(wěn)定性良好， 放置 24小時(shí)后再測定吸收度基本不變。雙氫青蒿素對(duì)照品溶液配

29、制后即測 A=0.6831， 24小時(shí)后測A=0.6832，供試品溶液配制后即測 A=0.5977, 24 小時(shí)后測 A=0.5974。雙氫青蒿素的含量測定曾考慮采用 HPLC 法，但對(duì)色譜柱、 試劑純度要求較高，且本品為復(fù)方制劑，雙氫青蒿素在三種成 份中量最少，分離時(shí)，其他兩種成份量大，色譜柱損耗大，雙 氫青蒿素片（單方）的含量測定方法也擬由 HPLC 法改為紫外 分光法，所以未進(jìn)一步研究。2、磷酸哌喹 磷酸哌喹在稀鹽酸溶液中，于 226、240 和 347nm 波長處有最大吸收。本品中磷酸哌喹的含量測定是在 O.1mol/L鹽酸溶液中測定，測定波長選用 347nm,另二種成份 及片劑中輔料

30、均不影響測定。在 200-500nm波長范圍內(nèi)掃描， 磷酸哌喹的0.1mol/L鹽酸溶液在345.8nm波長處有一個(gè)不受干 擾的最大吸收（見圖 4、5、6）。（1）磷酸哌喹的線性測試：精密稱取磷酸哌喹對(duì)照品 100mg，置250ml量瓶中，加 0.1mol/L鹽酸溶液適量使溶解，并加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度， 搖勻。精密量取此溶液1、2、3、4、5ml，分別置100ml量瓶 中,分別加 0.1mol/L 鹽酸溶液至刻度,搖勻。測得吸收度 A, C-A線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999969（見圖7）。A0.14750.29420.43650.58750.7312C (pg/ml)4.0

31、8.012.016.020.0含量測定方法中的測定液濃度在 16pg /ml 附近，在線性范 圍內(nèi)。（2）回收試驗(yàn) 按處方量配比作磷酸哌喹回收實(shí)驗(yàn)，五份的回收率分別為 100.6%，99.9%，100.2%，99.7%，100.3%。平均 100.1%。（3）磷酸哌喹測定溶液的穩(wěn)定性考察可滿足分析測定的要求。磷酸哌喹的 0.1mol/L 鹽酸溶液穩(wěn)定性好，配制后即測與放 置 24 小時(shí)后測得的結(jié)果基本一致，A=0.5315 ，24 小時(shí)后測A=0.5166， 24 小時(shí)后測HPLC 法同時(shí)測定，但磷酸磷酸哌喹對(duì)照品溶液配制后即測 A=0.5327,供試品溶液配制后即測 A=0.5182。曾考慮

32、磷酸哌喹與甲氧芐啶用 哌喹拖尾嚴(yán)重，而用紫外法測定磷酸哌喹，方法簡便，可靠， 其它成份對(duì)其含量測定均無干擾，因而磷酸哌喹含量測定選用 紫外法。3、甲氧芐啶 比較了紫外分光光度法和高效液相色譜法。紫外法 ：甲氧芐啶的 0.1mol/L 鹽酸溶液在 271nm 波長處 有最大吸收，可作為定量測定波長（見圖8），但磷酸哌喹的O.1mol/L鹽酸溶液在271 nm波長處也有吸收，經(jīng)測定在366nm 波長附近有等吸收點(diǎn)（見圖 9）：甲氧芐啶與磷酸哌喹 UV 等 吸收圖）。雙波長紫外分光光度法，即在Ax（366nm）及他271 nm） 測定供試品及對(duì)照品溶液的吸收度，然后求出 A（A AQ進(jìn)行 計(jì)算。a.

33、甲氧芐啶的等吸收點(diǎn)選擇甲氧芐啶和磷酸哌喹的O.1mol/L鹽酸溶液中等吸收點(diǎn)的測 定選擇方法：精密稱取甲氧芐啶對(duì)照品10mg，置100ml量瓶中，加 O.1mol/L 鹽酸溶液溶解并加至刻度，搖勻。精密量取此 溶液 5ml 置 50ml 量瓶中，加 0.1mol/L 鹽酸溶液稀釋至刻度， 搖勻（每1ml含甲氧芐啶10Q。另精密稱取磷酸哌喹對(duì)照品 約50mg,置100ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并加至 刻度，搖勻。精密量取此溶液 2, 4, 6ml，分別置100ml量瓶 中，分別加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻（每1ml中含 磷酸哌喹分別為10，20陶30）。用以上甲氧芐

34、啶溶液測得最大吸收波長在270.4nm處，再用10-30/ml濃度的磷酸哌喹溶液測得與270.4nm的等吸收點(diǎn) 波長分別為366.5nm, 366.5nm及366.5nm,見測定數(shù)據(jù)。不同濃度磷酸哌喹與甲氧芐啶等吸收點(diǎn)波長測定波長(n m)吸收值A(chǔ) （/ml）10.0 20.030.0270.40.1260.2580.363366.20.1360.2680.367366.30.1340.2650.370366.40.1300.2610.368366.50.1270.2580.362366.60.1230.2540.357b.甲氧芐啶的線性測試： 精密稱取甲氧芐啶對(duì)照品 50mg,置100ml量

35、瓶中，加 0.1mol/L鹽酸溶液適量使溶解，并加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度， 搖勻（每1ml含甲氧芐啶約0.5mg）。 取磷酸哌喹對(duì)照品約60mg,精密稱定，置100ml量瓶中, 加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并加至刻度，搖勻（每1ml含磷酸哌 喹約 0.6mg）。精密量取溶液5ml 10份，分別置100ml量瓶中，分別 精密加入溶液1, 2, 3, 4, 5ml，再分別加0.1mol/L鹽酸溶 液至刻度， 搖勻， 在271 nm及366nm測定顯示出 A （A入 2271 nm A1366nm）值，進(jìn)行C-A計(jì)算，見實(shí)驗(yàn)結(jié)果。甲氧芐啶線性測定樣品濃度/mlWL1WL2 A150.401

36、20.51060.1095250.40140.50910.10763100.40340.61530.21194100.40580.61660.21085150.41050.72970.31926150.41210.72630.31427200.41080.83100.42018200.41710.83820.42119250.41330.94020.526910250.41720.94070.5235當(dāng)甲氧芐啶溶液濃度在5-25/ml時(shí)，測得吸收度 A, C -A線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) r=0.999995,見附一元線性回 歸圖（圖10）。C.回收試驗(yàn)甲氧芐啶測定的回收試驗(yàn)結(jié)果為99.6%,

37、100.4%, 99.8%。按處方量加大磷酸哌喹的量為處方量的150%，測定甲氧芐啶即使在磷酸哌喹含量偏高的情況下， 含量測定時(shí)為使 A在0.3以上，測定15-25/ml范圍內(nèi)?；厥章蕿?00.2%, 99.5%, 100.6%。說明本方法測定樣品中甲 氧芐啶的含量是可信的， 也不影響測定的準(zhǔn)確性。液中甲氧芐啶濃度應(yīng)在d.甲氧芐啶測定溶液的穩(wěn)定性考察在線性范圍內(nèi)配制的溶液穩(wěn)定性好，配制后即測與放置24小時(shí)測得結(jié)果基本一致，可滿足分析測定的要求。甲氧芐啶對(duì) 照品溶液配制后即測 A =0.4144,24小時(shí)后測定，A=0.4145。 供試品溶液配制后即測 A=0.3966, 24小時(shí)后測A=0.3

38、968。e不同過濾材料對(duì)含量測定的影響測定磷酸哌喹和甲氧芐啶含量時(shí)，供試品經(jīng)0.1mol/L鹽酸溶液溶解后濾過，曾試驗(yàn)用濾膜或?yàn)V紙作濾材，結(jié)果一致，如 以濾膜濾過測得甲氧芐啶 A=0.4144,磷酸哌喹A=0.5315,以 濾紙濾過測得甲氧芐啶 A=0.4145,磷酸哌喹A=0.5313。高效液相色譜法 方法依據(jù)參考有關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定流動(dòng)相以乙腈一 0.75%二乙胺（15:85，用磷酸調(diào)PH至2.5），甲氧芐啶和樣品 提取時(shí)帶入的小量磷酸哌喹分離效果最好。 檢測波長的確定 取甲氧芐啶對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制 成每1ml含5的溶液，在200-400nm波長處掃描，甲氧芐啶 在271 nm波長處有

39、最大吸收，因而選用271 nm作為檢測波長是 合適的（見圖11）。 溶劑選擇 樣品選用95%乙醇超聲振蕩提取，在保證甲 氧芐啶提取完全的同時(shí)，使其他成份的溶解量幾乎為 0,消除 了磷酸哌喹的影響。 色譜條件的確定12）。YWG5流動(dòng)相 經(jīng)篩選以乙腈一0.75%二乙胺（15:85，用磷酸調(diào) PH至2.5）為流動(dòng)相，甲氧芐啶峰形較好（見圖色譜柱的選擇比較了兩種不同牌號(hào)的色譜柱（C1810 gm 250X 4.6mm和 LiChro CART250-4 RP-18C，柱效測定結(jié)果如下表：參數(shù)色譜柱型號(hào)YWG C1810 pm 250 X 4.6mm471215.461.48LiChro CART25

40、0-4 RP-18C5 gm908019.191.09以柱效比較來看，進(jìn)口的LiChro CART250-4 RP-18C5 pm柱效比國產(chǎn) YWG C18 10m 250X 4.6mm好，但以國產(chǎn) 柱進(jìn)行線性測定、回收實(shí)驗(yàn)等結(jié)果均可達(dá)到分析測定的要求。 線性關(guān)系 用流動(dòng)相制成每1ml含甲氧芐啶20、40、60、80、100的溶液，測定，得結(jié)果如下(見圖13):C (pg/ml)峰面積20450646409151546013767488018240341002307791以濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=23115.85X-12076.4r=0.99994 回收實(shí)驗(yàn) 按處方量，稱取甲氧芐啶、雙氫青蒿素、磷 酸哌喹和輔料至250ml量瓶中，加95%乙醇約75ml，超聲振蕩 30分鐘，取出放冷至室溫，加 95%乙醇至刻度，搖勻。濾過， 取續(xù)濾液5ml至25ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。另取甲 氧芐啶對(duì)照品不加其他成份，依法操作，作為對(duì)照品溶液。各 取20 p注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法 計(jì)算回收率?；厥仗?hào) 加入量回收量回收率平均回收率RSDmgmg%62.863.162.262.563.362.299.50.5799.9100.3100.032363.162.3100.699.262.762.8樣品測定：HPLC法、UV法高效液相色譜法與紫外分光